免疫组化技术简介.pptx

免疫组化技术简介免疫组化技术简介CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制基本概念基本概念 应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)或 免 疫 细 胞 化 学 技 术(immunocytochemistry,ICC)。免疫组化免疫组化基本概念基本概念抗原（抗原（Antigen,Ag）一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物质。抗体（抗体（Antibody,Ab）机体受抗原刺激后由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）。基本概念基本概念抗体的结构抗体的结构V区氨基酸的种类和排列顺序千变万化，故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体。（抗原特异性，第一抗体）C区氨基酸的组成和排列在同一种属动物Ig同型L链和同一类H链中都比较恒定。制备第二抗体的重要基础。一抗：鼠抗人一抗：鼠抗人二抗：羊抗鼠二抗：羊抗鼠基本概念基本概念单克隆抗体单克隆抗体由同一克隆细胞产生，针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。多克隆抗体多克隆抗体由不同细胞产生，其免疫化学特性不同，能够识别抗原表面多种抗原决定簇的多种抗体的混合物。基因工程抗体基因工程抗体在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，甚至是在人工全合成后导入受体细胞表达产生的新型抗体。CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制基本原理基本原理抗原抗原显色显色抗体抗体间接法间接法直接法直接法PAP法法LSAB法法基本原理基本原理显显色系统色系统酶免疫组化染色中的常用的酶及显色酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物底物辣根过氧化物酶/HRP：DAB、AEC碱性磷酸酶/AP：AP-Red、NBT/BCIP酶酶的的选择选择HRP染色结果比AP染色结果保存时间长含有内源性HRP的组织切片：首选标记酶为APAP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记，对比清晰CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制操作流程操作流程CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制技术要点技术要点免疫原理的选择免疫原理的选择一抗一抗（属种、单/多抗、浓缩/即用型）二二抗抗（属种、标记方法）显显色方式色方式技术要点技术要点取材取材组组织织切切片片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）；大小（110.5cm）；取病变组织与正常组织交界处；避免对组织标本的损伤和挤压。印印片片：肝、脾、淋巴结等器官或组织(经新鲜标本最大面积剖开，充分暴露病灶，将载玻片轻轻压与组织切面，细胞粘附于玻片上，然后固定）（缺点是细胞分布不均匀，细胞有重叠）各各种种体体液液、穿穿刺刺液液：可直接涂片（血液、组织液等）或离心后涂片（细胞少脑脊液、腹水等）。培养细胞：培养细胞：悬浮细胞离心后涂片；贴壁细胞可爬片。取材时间要早（取材时间要早（24小时以内），避免组织自溶，使抗原变性消失或严重弥散。小时以内），避免组织自溶，使抗原变性消失或严重弥散。组织切块厚度不易超过组织切块厚度不易超过0.5cm，以便固定液的及时渗透及，以便固定液的及时渗透及脱水。脱水。技术要点技术要点固定固定目目的的：凝固蛋白，终止细胞内酶的作用，防止细胞自溶；固定细胞形态和结构；保持组织细胞的抗原性；防止细胞层脱落；去除细胞内的脂类（妨碍抗体结合）；防腐。注注意意事事项项：组织块不宜过大；固定液的量一般以组织块大小的30倍为宜；必须选择对组织渗透力强，同时又不致使组织过度收缩或膨胀的试剂；固定时间一般以24小时为宜。固固定定液液的的选选择择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂。如甲醇、丙酮、甲醛、乙醇等。甲醛固定后，抗原甲醛固定后，抗原容易被容易被掩盖，掩盖，形成醛键或羧甲基，使蛋白交联封闭部分抗原表位。形成醛键或羧甲基，使蛋白交联封闭部分抗原表位。技术要点技术要点石蜡切片石蜡切片优优点点：对组织结构形态保存好，对组织的定位很准确，是观察组织和细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究。缺点：缺点：抗原常被封闭和破坏。对抗原的保存不如冰冻切片。冰冻切片冰冻切片优优点点：能避免石蜡切片因固定，脱水，浸蜡等对抗原的损失，较好的保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。缺缺点点：不易保存（-80）；细胞内易形成冰晶而破坏抗原结构，造成抗原的弥散使定位不准确。能做石蜡切片的就能做冰冻切片，能做冰冻切片的不一定能做能做石蜡切片的就能做冰冻切片，能做冰冻切片的不一定能做石蜡切片！石蜡切片！技术要点技术要点抗原修复抗原修复免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学的信号减弱或消失等不良效应。使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即抗原修复抗原修复。抗抗原原修修复复常常用用方方法法：酶修复法（胰蛋白酶、胃蛋白酶和无花果酶）；热修复（高压修复、微波炉修复、煮沸法）技术要点技术要点抗体的保存抗体的保存分装密封保存，避免对抗体的污染并注明标记（批号、名称、效价、量）根据厂家提供的保存条件保存避免反复冻融而使抗体效价降低CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制结果判读结果判读必须设立对照必须设立对照阳性组织对照阴性组织对照阴性试剂对照（空白对照；替代对照；吸收试验；抑制试验）自身对照没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的！没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的！结果判读结果判读抗原表达必须在特定部位抗原表达必须在特定部位阳阳性性标标记记细细胞胞学学特特征征可分为胞膜型；胞核型；胞质(浆)型；微绒毛型；复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。结果判读结果判读阴性结果不能视为抗原不表达阴性结果不能视为抗原不表达由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。尽尽量量避避开开出出血血、坏坏死死及及切切片片刀刀痕痕和和界界面面边边缘缘细细胞胞的的阳阳性性表表达达，特特别别是是酶免疫酶免疫标记标记因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。对免疫组化标记结果的意义不能对免疫组化标记结果的意义不能绝对化绝对化应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。结果判读结果判读非非特异染色特异染色免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。原原因因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自：内源性干扰(自发荧光、内源酶、内源性生物素等)；试剂污染(质量差，交叉反应，Fc受体干扰等)；组织处理不当(组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所导致的游离试剂残留等)。特异性染色特异性染色非特异性染色非特异性染色分布在特定的部位分布在特定的部位,具结构性具结构性无分布规律，常出现在切片边缘、刀痕无分布规律，常出现在切片边缘、刀痕或皱折部位及坏死或挤压的细胞区域或皱折部位及坏死或挤压的细胞区域 由于细胞内抗原含量不同，所以显色不由于细胞内抗原含量不同，所以显色不均一均一不限于单个细胞，而是累及一片细胞，不限于单个细胞，而是累及一片细胞，均匀显色均匀显色阳性与阴性细胞相互交杂，同一切片上阳性与阴性细胞相互交杂，同一切片上显色强度不一显色强度不一细胞和周围的结缔组织均无区别的着色细胞和周围的结缔组织均无区别的着色结果判读结果判读结果表示结果表示着色程度（抗原含量）着色程度（抗原含量）弱阳性（+）1分中等阳性（+）2分强阳性（+）3分阳性细胞数量阳性细胞数量弱阳性（+，指阳性细胞数在25%以下）1分中等阳性（+,指阳性细胞数在25%49%)2分强阳性（+，指阳性细胞数在50%以上)3分目前多采用积分综合计量。计算公式：目前多采用积分综合计量。计算公式：两者相乘（或相加）。大多主张两者相乘（或相加）。大多主张4者为阳性，者为阳性，6者为强阳性，至者为强阳性，至少随机观察少随机观察5-10个个HPF，取其均值。，取其均值。以免疫酶标记（HRP-DAB/H2O2）为例：则表现为淡黄色细颗粒淡黄色细颗粒、棕黄色颗棕黄色颗粒粒和褐黄色粗颗粒褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。图像摄影，原则上多取强阳性区域。CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制失败原因失败原因假阴性常见假阴性常见原因原因失败原因失败原因假阳性假阳性常见常见原因原因CONTENTS目录01基本概念02基本原理03操作流程04技术要点05结果判读06失败原因07质量控制质量控制质量控制试剂的质量控制试剂的质量控制抗体特异性、敏感性测试，抗体最佳稀释度的选择，稀释剂，抗体孵育温度、时间。仪器的质量控制仪器的质量控制相关技术设备、仪器和器具定期校对、消毒。操作操作过程质量控制过程质量控制操操作作：步骤是否正确规范；每日之间、操作人员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好标标本本：阴性、阳性或自身组织对照三种类型质控品，可用于监控标本制备、操作过程、染色步骤、试剂质量等问题引起的误差。谢谢大家