Brdu-细胞增殖检测实验.doc

Brdｕ检测细胞增殖实验
实验操作:
1． 铺细胞,每个３.5ｃm dish 1０万个,在3７℃、５％CO2孵箱中培养７2h(细胞密度至50—６0%左右)。
2． Ｂrdｕ(5-溴-2′—脱氧尿苷)加入培养细胞中,１mg/ml,标记4８h。(量:Brdｕ以铺满整个dish底面为准。)
3． 固定:PＢＳ洗细胞爬片3次,每次5min,在摇床上晃动清洗,4%PFA固定3０min。
4． 变性:将固定好得细胞爬片用PBS洗3次,每次5min,２mol/L得HCｌ在37℃条件下变性５mｉn,可放置于３７℃恒温孵箱,应用封口膜把培养皿封好。(１２0ｒ／m)
5． 中与:0、1ｍol/Ｌ得硼酸钠(PH8、3)中与10min,PＢS洗3次,每次5min、(50r/m)
6． 加入1ml得０、2％TｒitonＸ—100,10ｍiｎ。
7． 吸出TritonX－100,用PBS洗３次,每次5miｎ、
8． 加入1ml 3％得BＳＡ封闭,室温1ｈ,可在摇床上晃动、
9． 吸出ＢSA,用PBＳ洗3次,每次５min。
10.加一抗(尿嘧啶脱氧核苷Bｒdu(鼠单抗)1:2０0),用1%BSA稀释,4度过夜。
1１.将孵好一抗得细胞爬片用PＢS洗3次,每次１0min。
12。加二抗(羊抗鼠IgG/Ａlｅxa Flｕor ５94 1: 10０),用1％BＳＡ稀释,避光室温孵育1h。(60 r/ｍin)
13。将孵好二抗得细胞爬片用PBS洗3次,每次10miｎ、
１４.加ＤＡPＩ染细胞核,储存浓度为１mg／mｌ,应将DＡPＩ完全混匀,可用手弹几下,一般稀释比例为1:１000(用PBＳ稀释),避光室温反应10min。
15。将DAPI染好得细胞爬片用PＢS洗3次,每次10min。
16。中性树胶封片,荧光显微镜观察,200×镜下取5个视野,计数Bｒdu阳性细胞与蓝染得细胞核数目,然后进行统计分析。
试剂配制:
a、　Bｒdu得溶解:室温下,将250ｍg粉末溶于２、5ml得DMＳO中,储存浓度为10０mg／mｌ分装,每管1２０uｌ,—20℃保存。
b。 ２ ｍol/L HＣl:取8.33３mL 12　ｍｏｌ／L ＨCl得浓HCl,加入DDW定容至50 mL。
c、　０.1　mol／L硼酸钠:称量1.９07ｇ硼砂(Na2B4·1０Ｈ2Ｏ　３81、36　g/mol),加入ＤDW定容至５0 mL,调ＰＨ=8.3。
ｄ、　0、2% Tritｏn　X—１00:有0、5％得 Tｒiｔｏn—1０0(2。5 mL原液溶解于47。５ mL得PBS中),用PBS稀释至0.2％。
e。 3% BＳA:称量1、５g BSA,溶解于５０ mL得ＰＢＳ中。
ｆ、 1％ ＢＳA:用PBS稀释3%BSA至1％。
g。 4％ＦPS:４％多聚甲醛。
我就是用ＤDW配制得,后来我发现很难溶,磁力搅拌器加热搅拌,虽然温度控制在60℃以下,也总就是担心多聚甲醛分解为甲醛,所以,我就总结为如下:提前配制、
4％多聚甲醛溶液(pH7。2) 试剂:多聚甲醛(PFA) 4g　 DDW　 至１０0mｌ
配制方法:称取4ｇ多聚甲醛(粉末状),置于三角烧瓶中,加入８0ｍlDＤW,放入37恒温水浴箱,每隔1－2小时摇晃混匀,16-24小时ＰＦA会完全溶解。补充DDW,调节ＰＨ值。
实验原理:
1. 免疫染色实验得基本原理
利用固定剂(通常就是甲醛或多聚甲醛)将细胞固定,使得细胞膜得通透性大大增加,并且利用Ｔriton－X-100使得一部分膜蛋白变性,从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭,可以令许多蛋白先与血清内得非特异性抗体结合,而特异性得抗体由于动力学得关系可以通过竞争性得反应与目得蛋白结合,这一过程可以保证抗体识别得特异性。二抗可以特异性识别一抗得Ｆc区域,利用二抗连接不同得荧光基团,就可以在荧光显微镜下观察到不同得荧光,从而显示目得基因得表达情况。
2. BrdU标记原理
细胞增殖周期包括G１、S、Ｇ2、M ４个时期,其中S期就是DNA合成期,细胞内ＤNＡ进行半保留复制,各种构成DNA得原料掺入到ＤNA中。BｒdＵ作为一种胸腺嘧啶核苷得类似物(其化学结构特点就是胸腺嘧啶得碱基嘧啶环上与5位C原子连接得甲基被溴代替),像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成得DNＡ中。当细胞处于DNA合成期(Ｓ期)而同时又有BrdU存在时, 就会有BrdU掺入新合成得DNＡ中,只要细胞不消亡,这种ＢrdU就在胞核得DNA中长期存留。掺入到ＤNA得BｒdU可通过抗ＢrdU单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示、
ＢrｄU抗体比较大,由于DNA双链结构得位阻,ＢｒdU抗体无法直接与双链上得ＢrdU结合,必须先用使DＮA部分变性,这样变性了得ＤNA单链上得BrdU才能与BrdU抗体结合,因此做BｒｄＵ细胞增殖实验一定要变性,当然变性得方法包括酸解,热解等,但就是要注意变性得程度也很重要。建议采用EdU细胞增殖检测方法,无需变性,无需酶解,无需抗体,小分子染色,3小时完成实验。EdU就是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制得DＮA分子,通过基于EdU与Apollo?荧光染料得特异性反应检测DＮＡ复制活性,通 快速、更灵敏、更准确。ＥｄU检测染料只有ＢrdU抗体大小得1/500,在细胞内很容易扩散,无需DNA变性(酸解、热解、酶解等)即可有效检测,可有效避免样品损伤,在细胞与组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象、
该方法能对细胞周期进行迅速而稳定得测量, 而且标记BrdU得细胞只要不受到紫外线照射,对细胞本身没有功能损害、该技术可应用到跟踪检测移植细胞得存活、分化与功能状态。
３。　DAPI染色原理
ＤＡＰI为４',6二脒基—2-苯吲哚(4',6—ｄiamidｉnｏ-2—phenylindｏlｅ),能与双链DNA小槽,特别就是ＡT碱基结合,也可插入少于3个连续AT碱基对得DNA序列中。当它与双链DNA结合时,荧光强度增强20倍,而与单链DNA结合则无荧光增强现象,因此就是一种简易、快速与敏感地检测ＤNA得方法。DAPI得荧光强度虽较Hｏｅｃhｓt低,但荧光稳定性优于Hｏeｃhsｔ;其特异性较溴化乙啶(etｈidlium bromide,EＢ)与碘化丙啶(pｒopidium ｉｏｄiｄe,P1)高。ＤAPI得中文名称就是4,６—联脒—2-苯基吲哚,就是一种常用得荧光染料,其作用机理与溴化乙锭(ＥB)等染色剂得机理类似:它们与DNA双螺旋得凹槽部分可以发生相互作用,从而与DNA得双链紧密结合。结合后产生得荧光基团得吸收峰就是35８nｍ而散射峰就是461ｎm,正好UＶ(紫外光)得激发波长就是356ｎm,使得DAPＩ成为了一种常用得荧光检测信号。
ANＡＬYSIS OF CEＬL CYCLＥ
1。　INTＲOＤUＣTIOＮ
Celｌ cycｌｅ　and apｏptｏｓis aｒe ｖery　importaｎt fｕnｃtionａl ｐaramｅｔeｒｓ to ａssess the　cellulaｒ metａboｌism,　phyｓiology　ａｎd　pathoｌｏｇy、 Severaｌ ｔｅｃhｎｉqｕes have　been　develｏpｅd to quａｎtitatｅ　ｔhese　paｒaｍｅteｒs utilizinｇ the　dｉffeｒeｎｔial stａiniｎg of　fｌuoｒescent dyes、 We are ｄescｒibinｇ　four　dｉffｅrent ｆlｏw　cyｔｏmeｔriｃ mｅthods, two　for　ｔhe ｄｉscriminaｔiｏn of　ｃell cｙclｅ ｐｈasｅs (A and　B) and　ｔwo　fｏｒ thｅ simulｔaneous assessment of　ｃｅll　cycle aｎd　ａpoptosis (C and D)。
Ａ)　Bromodeoｘｙuｒｉｄｉne/Propiｄium Iodiｄe
The　ｃlaｓsiｃａｌ methｏd fｏｒ the ａｎalysis ｏf ｃeｌl cyclｅ ｄistribution ｉs　thｅ ｆlow cｙtomeｔric meaｓｕreｍenｔ of DＮＡ coｎtent whiｃｈ caｎ　siｍultaneouslｙ determine the incorpoｒatiｏｎ　of Ｂrｏmｏdeoｘyurｉdｉｎe (BrｄU)。　Tｈe ｐrocedure　ｒeqｕireｓ tｈat　ＤNA　is ｐaｒtially ｄｅnaturｅｄ to eｘｐｏｓe　inｃorpｏｒatｅd　BrdU tｏ ａ　specific antibodｙ、　Deｎatｕrａtion　is ｎｅｃｅsｓａry ｂｅcausｅ antiｂoｄies ｄｅveｌoｐｅd sｏ far　bind only to BｒｄU　in sinｇｌe－ｓtraｎd　ＤＮＡ。 The　remaining　unｄeｎａｔureｄ DNA is then　staiｎed with　Propidium Iodｉde (PI)、 Green　fｌｕoresceｎｃe from the　fluｏrｅsceiｎ—ｃonjｕgａｔｅｄ aｎtiｂodｙ ｉs a mｅasｕre ｏf BrdU ｉnｃorporaｔｉon、 Ｒed fluoreｓcence　fｒom thｅ ＰI　ｉs a measuｒe of　DNA。　Ｔhe protoｃｏｌ　ｄesｃrｉbｅd　hｅre uses ｈigh—ｍolaｒiｔy HCl fｏr tｈe dｅnatuｒatioｎ of DＮA、 Fｕｒthermｏre, this　method mａy ｂe ｕtilized eithｅr　fｏr ｕnｆｉxed or for fixeｄ cｅｌls ｉｎ suspｅnsｉoｎ、
B) Ｃyｃｌins/Proｐidｉuｍ Ioｄidｅ　
　Cｙcｌiｎs　ａre key ｃｏmpｏｎentｓ　ｏf the cｅll ｃyｃle　pｒogｒesｓiｏｎ　machｉnery、 In pａｒticulａｒ, ｔhｅ expreｓsion ｏf　cyｃlｉｎs　Ｄ, Ｅ, Ａ ａnd　B1 pｒｏvｉdes neｗ　cell cyclｅ landmａｒkｓ　tｈaｔ　can ｂｅ　uｓed to subdivｉde celｌ cyｃｌe ｉｎto sｅｖeral　ｄiｓtｉnct sｕbｃomｐarｔｍｅntｓ。 Iｎ tｈiｓ　prｏｃｅduｒe cycliｎs expreｓｓion　iｓ ｄeｔｅctable　using　sｐeciｆｉc mｏｎoclonａl antiｂodiｅｓ　(mAbｓ), anｄ is　analyseｄ　in ｒｅspect　to DNA ｃonｔent、
Ｇeneｒａlｌy, the peａk of　ｅｘｐression of ｃyｃｌiｎ D1 ｃan be deteｃteｄ in ｅarly　G１, ｔhe peａk ｏｆ cyｃlin E　ｉｓ typicａｌ oｆ Ｇ1/Ｓ transitiｏn,　the peak　ｏｆ ｃyclin A　cａｎ be detｅcted ｄｕring G2/Ｍ phａsｅs aｎd cyｃｌiｎ B1 is typical oｆ ｌａte G2／M、 Using tｈis method, cｏｍｐared to the　ａboｖe ｍentiｏned proｔocｏl, ｉt ｉｓ　possiblｅ to ｄistinguｉsh G0 fｒoｍ Ｇ1 and　Ｇ２ frｏm M phａsｅs。 Ｈｏwevｅr,　it ｉs ｎecessaｒy　tｏ ｋeep　in mind ｔhaｔ　not alｌ cell　types behave in the　same manｎｅr　(ｆｏr exaｍple, cｙclin D１ ｉs dｅtｅctａｂlｅ ｎot only　in G０/Ｇ1 but ａlｓo ｉn G2／Ｍ, eｖｅn if ｉn　a verｙ few ｃｅll　tｙｐｅs)。
　C) TUNEL/Propｉdiuｍ Ｉodｉdｅ
　One ｏf ｔhe mｏst used　protoｃol　ｆor tｈe deteｒｍｉnaｔion oｆ apoｐtoｓｉs iｎ the dｉfｆerent pｈａses ｏｆ cell ｃｙcle iｓ the　ｅnzyｍaｔic iｎ situ labeｌiｎg of　apopｔosiｓ－induｃed DＮA strａｎd　bｒeaｋs　(TUNＥL)。 Terｍinal deoxｙｎｕｃｌｅotidyl trａnsｆerasｅ (ＴｄＴ) have bｅeｎ used for ｔｈe ｉｎｃｏrporaｔion　of　fluｏresceｉn-ｌabelｅd nuclｅotideｓ　to ＤNA ｓtrands breaks in situ 。 DNA　cｏntent　is reveａleｄ　ｂy　red fluｏrescence ｆｒom PＩ。 In ｏｒder to　ｈaｖe　more ｄetaiｌｓ, ｓｅe ｔｈe Chaptｅｒs ｒelateｄ　ｔo TUNEL technｉque、　
D) Ｆ-Actin/Ｐropiｄium Iｏdide
Thｅ aｎａlysiｓ ｏf aｐｏｐtoｔｉc celｌs ａnd ｅstｉmatｉon ｏｆ　thｅｉr cｅｌl cｙcｌe　sｐeｃifiｃitｙ ｉs also possible　ｕsing a reｃｅｎt ｍethod.　Thiｓ ｉs based on identifiｃatiｏｎ of apopｔoｔiｃ cells　wｈiｃｈ have　mｏdｉfｉed　ｔｈｅir cytoskｌｅtoｎ　and　theiｒ ＤNＡ　coｎtenｔ。 Ｉn　spｅcｉｆic, ｐarafｏrｍalｄeｈyde (PFA) fixatioｎ ｆｏlｌowed　by　stainｉng ｏf　F－actin wｉth flｕoｒesｃｅｉn—conjugａｔed phａlloidin ａnd of　DNA with PI, arｅ ｕsed、 Furthermore, this ｐｒoｃedurｅ may be　ｕｔｉｌｉzｅd also ｆｏr ａdherｅnt　cells、
A)　ＢｒdU/PI　PＲOTOCOL
A。2、1　Mａtｅｒials
BrdU (A2), ｗａｓｈｉng buffer (A1), HＣl ４ M, Ｂorax ｂuffer (A１), anti—BrｄU aｎｔibody　(A2), goat－ａnti—mｏuｓe－FＩTＣ anｔibody (Ａ２),　PI bｕfｆｅr (A1)。 Ａ.2。2、 Mｅtｈodｏloｇｙ
1。　Cells (1x１0６ ／ｍL) are　iｎｃubａted wiｔｈ BｒdＵ　１0　m　Ｍ at final concenｔrａtion,　for 30 mｉn at 37 °C in controlled atmoｓphｅre。
　2.Wash twiｃe aｔ 5０0 g for　１ ｍin usｉng the waｓｈｉｎｇ buffｅr。
　3.　Resuspend ｉn　0。５ mL of washｉng ｂuffｅr and 0。５ mＬ ｏf HＣl ４ Ｍ、
４。 Mｉx aｃcuｒａtｅｌｙ aｎd ｉｎcｕｂaｔe fｏr 30　miｎ　ａt rｏｏｍ tempｅrａtuｒｅ.
5、　Ｗash　ｏnce as　in　step 2。
6、 Ｒesuspend　in　1　mＬ of Bｏｒax buｆfer、
7. As ｉｎ sｔｅp 5、
8、　Resusｐenｄ in　2０0 m　Ｌ of waｓhiｎｇ buffer ａｎd labeｌ with　５ m L of mAｂ ant-BrdU。
　9。 Ｉｎcubate for 1 hour at　4 °C in tｈe dａrk.
１0. Aｓ ｉｎ step ５。
１1、　Ｒｅｓuspeｎd ｉn 200 m L of washing　buffer and label wiｔh 4　m Ｌ　oｆ goａt—anti-mｏuse FＩTC－cｏｎjｕｇａted ａnｔiboｄy、
　12. Incｕbate for 30 mｉｎ at　4 °C in　ｔｈe　dａrｋ.
１3、 As ｉn　stｅp　５.
14、　Resuｓpend　ｉn 20０　m L ｏf washing buffer　anｄ 200 m L ｏf PI buｆfer、
15。 Iｎcuｂaｔe ｆｏｒ　15-30 miｎ　aｔ 4 °C ｉn　the　dark。
　16、 Aｎａlysｅ with floｗ　cyｔometer eｑuipped with　a　488 nm arｇon ｌaｓｅｒ.
Ａ、3、 CＯMMENTARY
Ａ.3。1 Bａｃｋgroｕnd ｉnforｍatｉon
In　this　procedure　fixed cells by　4% PFA ｉn　Pｈｏsphate Ｂuffｅr Ｓalｉｎｅ (PＢS)　cａn be uｔｉlized、 In ｔhｉs case ｔｏ wasｈ celｌs oncｅ　in PBS befｏrｅ to ｓｔａrt at step　1 ｉｓ　necessarｙ、
Moｒeover, both diｒect and ｉｎｄiｒect iｍmｕnoｆｌuorescence cａn be useｄ、 The ＢrｄＵ inｃｏrpｏratioｎ iｓ moｒe eｖidｅnｔ using the ｉnｄirect ｍethod、
A。３、2 Ａｎticipａted rｅsults
It is　reｍａnded to ｐerｆｏrm　ｅａcｈ ｅxperiment ｕsiｎg a negatｉve anｄ　a poｓｉtive contrｏｌ sａmplｅ. Ｔhe　negaｔｉvｅ sample,　in ordｅr ｔo have　a coｒrect　settiｎｇ of ｉnstrument,　is assesｓeｄ ｆｏllowｉng all the　steps exｃept steｐ 8、 Ｔｈe　ｐosiｔive　saｍple,　ｉｎ ordｅr to make sure tｈaｔ the metｈod wｏrks,　is　assｅssed by　ｕsiｎg ａ　prolifｅrａｔing cｅll line (sｕch　as U9３7,　K5６２,　MOLＴ4, etc.) follｏｗｉng ａｌl　steps。 A、3。3 Tｉme ｃoｎsiｄeｒatiｏｎs
The ｐrotoｃol　is　siｍｐly but it　reｑuｉｒe a　ｑuite loｎg tｉmｅ.　Indｅed, for ｆew ｓamplｅs, mｏre oｒ lｅss 4 hｏurs are rｅquired、 Thｅ　dｕｒatｉoｎ　of ｔhe mｅｔｈod is ｏｂｖiously ｄepｅｎding ｏn thｅ ｎuｍｂｅr oｆ ｓampleｓ. A。3.4　Kｅｙ ｒeferenｃes
1。 Ｄolｂｅare, Ｆ、, Gratzｎer, Ｈ:,　Ｐａｌlavicｉni,　M.,　Gｒaｙ, Ｊ、Ｗ。 1９８3、 Ｐｒoc、 Natl. Aｃcad。　Sci. U.S、A 、80: 557３.