浅论抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定.docx

浅论抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定
【摘要】 目的:纯化rVVC免疫家兔，制备并纯化多克隆抗体。观察复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合作用肝癌细胞SMMC7721后，肝癌细胞SMMC7721形态学和活性变化，评估抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC772的保护作用。方法:纯化重组蛋白rVVC免疫日本大耳兔获得多克隆抗体，多克隆抗体经过硫酸铵盐析、Sephadex G25除盐和DEAE-Sephadex G100层析纯化并进行 Westerm Blot鉴定和抗体效价分析。复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合物作用肝癌细胞SMMC7721后，显微镜观察并以MTT法确定抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC7721的保护作用。结果:兔抗重组rVVC多克隆抗体经盐析法、分子筛和阴离子交换层析法纯化后，得到较纯的IgG分子。免疫印迹结果显示，抗重组rVVC蛋白多克隆抗体与纯化抗原呈现特异性反应条带。显微镜观察和MTT结果表明，纯化多克隆抗体能够阻断重组rVVC活性蛋白对肝癌细胞SMMC772的损伤。结论:成功制备了具有保护和阻断作用的兔抗重组rVVC多克隆抗体，为以后rVVC促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。
【关键词】 创伤弧菌溶细胞素；多克隆抗体；保护作用；阻断作用
Abstract: Objective: To prepare and purify rabbit polyclonal antibody against rVVC，to evaluate the protection of polyclonal antibody by observing the morphology and activity changes of SMMC7721 cells acted by purified rVVC，purified polyclonal antibody，the mixture of rVVC and polyclonal antibody. Method: Rabbit polyclonal antibody against rVVC prepared by immunning rabbit was purified by persulfate，Sephadex G25 and DEAE-Sephadex G100 followed by analysis of Western Blot hybridization and antibody titer. After SMMC7721 cells were acted by purified rVVC， purified polyclonal antibody and the mixture of VVC and polyclonal antibody， rabbit polyclonal antibody protection were observed under microscope and with MTT method. Result: Rabbit polyclonal antibody against rVVC was purified successfully by methods of Persulfate， Sephadex G25 and DEAE-Sephadex G100. Polyclonal antibody showed high immunoreactivity. The results of MTT and microscope observatien indicated that polyclonal antibody could block up the damage of SMMC7721 cells acted by rVVC. Conclusion: Rabbit polyclonal antibody against rVVC with functions of protection and blockade is prepared successfully， thus to provide a significant blocking agent for further study on mechanism of inflammation，stress and signal transduction of rVVC.
Key words: vibrio vulnificus cytolysin；polyclonal antibody；protection；blockage
创伤弧菌是一种致病性极强的嗜盐性细菌，能引起严重的伤口感染和败血症，发病急、病死率高，发展到败血症，则病死率高达55%以上，其确切致病机制至今尚未完全阐明。创伤弧菌溶细胞素作为创伤弧菌唯一分泌至细胞外、具有创伤弧菌种属特征性的外毒素，其活性和毒性都很强，现在认为它是创伤弧菌感染最重要的毒力因子，在创伤弧菌感染过程中发挥重要致病作用[1]。此前，我们已经成功构建了原核表达载体pET28a(+)-vvhA，并对重组蛋白rVVC表达、纯化和复性条件进行优化。本研究中，我们利用纯化重组蛋白rVVC免疫日本大耳兔，进行多克隆抗体制备并纯化，成功制备了兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体，并对其保护、阻断作用进行了评价，为后续rVVC的促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。
1 材料和方法
　材料
　载体与细胞：重组原核表达载体pET28a(+)-vvhA为本课题组构建，肝癌细胞SMMC7721为温州医学院细胞与分子生物学研究所保存，日本大耳兔［4个月大小、雄性、健康，体重kg］由温州医学院实验动物中心提供，兔红细胞利用心脏采血法取自健康家兔心脏。
　主要试剂与试剂盒：IPTG、3S NTA RESIN树脂、盐酸胍购于上海申能博彩生物科技有限公司。羊抗兔HRP-IgG抗体、ECL发光试剂购于上海普飞生物技术有限公司。DMEM高糖培养液购自吉泰科技有限公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。青霉素/链霉素抗生素液为美国Invitrogen公司产品。pH 磷酸盐缓冲液、%胰蛋白酶、2%台盼兰染液自配。
　方法
　重组蛋白rVVC的表达、纯化、Western blot 分析和柱上复性：参照本课题组已经建立的方法表达、纯化重组rVVC蛋白。重组蛋白rVVC的Western blot分析按文献进行。将纯化重组蛋白rVVC用PBS溶液稀释成浓度小于1 mg/ml，4 ℃条件下，取1 ml样品加到Ni-NTA亲合层析柱中，流速控制在15 ml/h左右，进行蛋白质挂柱。层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗脱，流速控制在30 ml/h左右。再分别用3倍NTA体积的、、、、、、、、、、 mol/L盐酸胍洗脱，流速控制在15 ml/h左右。3倍NTA体积的NTA-1 000 Buffer洗脱，收集洗脱液并用PBS溶液透析24 h，期间要求多次更换透析液。取透析好的蛋白溶液于4 ℃、12 000 r/min离心取上清液，以考马斯亮蓝进行蛋白质定量分析，滤过除菌， -70 ℃冻干保存。
　重组蛋白rVVC溶血活性检测：将一定量复性重组rVVC蛋白加入1 ml %兔红细胞悬液中，再加PBS-BA缓冲液至2 ml，37 ℃水浴20 min，显微镜观察细胞形态学变化。2 500 r/min离心5 min，取上清于545 nm处测吸光度值，以使%兔红细胞悬液中的血细胞溶血一半时所需的蛋白质的量定义为一个溶血单位来计算其溶血活性。
　兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备、提纯、Western blot和抗体效价分析：纯化重组rVVC蛋白与完全福氏佐剂充分混匀，皮下多点免疫日本大耳兔，2周后，再与不完全福氏佐剂混匀，皮下加强免疫，1周后，收集血清，ELISA法检测抗体效价。免疫血清经饱和硫酸铵、50%硫酸铵、33%硫酸铵溶液盐析沉淀。盐析纯化后的免疫血清再经Sephadex G25除盐纯化、DEAE-Sephadex G-100柱层析纯化。纯化后的兔抗重组rVVC多克隆抗体参照文献进行Western blot分析。选取10μg/ml纯化重组rVVC蛋白包被酶标板，兔抗重组rVVC蛋白多克隆抗体和免疫前阴性对照血清均按1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1 600、1:3 200、1:6 400、1:12 800、1:25 600、1:51 200等浓度倍比稀释，采用ELISA法于450 nm处检测其效价。
　SMMC7721细胞培养和活性检测：SMMC7721细胞用DMEM高糖培养基置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞密度达到80%～90%后，用%胰蛋白酶消化10 min，加DMEM培养液终止消化，收集细胞并用DMEM培养液吹打为单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/ml，加于96孔培养板，每孔100μl，置于37 ℃、5% CO2条件下培养12 h后，再分别加入重组rVVC蛋白，使其浓度分别为、、、、、、、 HU/ml，并设阴性对照和培养液对照，置37 ℃、5% CO2条件下培养12 h后，加入10μl MTT(5 mg/ml)，37℃继续培养4 h后，小心吸弃培养液，每孔加入100μl DMSO溶解formazon，用波长630 nm检测各孔吸光度值(每一组设3个重复孔)。
　　　MTT法检测兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的保护和阻断作用：选择对数生长期SMMC7721细胞，用%胰酶消化10 min，调整细胞浓度为1×106/ml，加于96孔培养板，每孔100μl，于37 ℃、5% CO2条件下培养12 h后，分别用上述不同浓度重组蛋白rVVC与1:1 000纯化多克隆抗体混合物、不同稀释度纯化多克隆抗体(1:1、1:10、1:100、1:1 000、1:10 000) 作用SMMC7721细胞，并设置阴性对照和培养液对照。于37 ℃、5% CO2条件下培养12 h后，加入10μl MTT(5mg/ml)，37 ℃继续培养4 h后，小心吸弃培养液，每孔加入100μl DMSO溶解formazon。在波长630 nm处检测各孔吸光度值。
2 结果
2．1 重组蛋白包涵体的复性和溶血活性分析 纯化重组蛋白rVVC经Ni-NTA亲合层析柱柱上复性后，其复性得率高达96%。利用VVC蛋白的溶细胞特性，将纯化复性的重组rVVC蛋白作用于兔红细胞，并检测其溶血活性，结果发现，复性重组rVVC蛋白具有较强的溶血活性。将测得吸光度值与溶血标准曲线比较，得出rVVC蛋白的溶血活性为μg/HU(见图1、图2)。
　兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备、提纯和Western blot分析 兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体经盐析法、分子筛和阴离子交换层析法纯化后，得到较纯的IgG分子。经Bandscan软件分析，多克隆抗体经过硫酸铵盐析纯化，其纯度达70%，再经Sephadex G25除盐、DEAE-Sephadex G100纯化后，其纯度高达到85%以上(见图3)。 免疫印迹分析证实纯化多克隆抗体具有较好的免疫反应性(见图4)，其效价为1：12 800(见图5)。
　SMMC7721细胞活性检测 SMMC7721细胞分别被不同浓度的重组rVVC蛋白作用12 h，利用MTT法检测吸光度值。细胞活性百分率用被作用细胞和阴性对照细胞吸光度平均值的比值来表示。利用Graphpad Prism 软件进行制图。从图6可知，肝癌细胞SMMC7721被 HU/ml的活性rVVC蛋白作用12 h后，细胞活性百分率仍大于50%，其IC50小于 HU/ml。
　兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的保护、阻断作用检测 SMMC7721细胞分别被不同浓度的重组rVVC活性蛋白、重组rVVC活性蛋白和多克隆抗体混合物作用12 h后，MTT法检测SMMC7721细胞OD值，利用Graphpad Prism 软件进行作图分析。结果显示，兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体完全阻断了重组rVVC活性蛋白对SMMC7721细胞的损伤。单独兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体对SMMC7721细胞无损伤作用，为保护性抗体。
3 讨论
创伤弧菌溶细胞素作为创伤弧菌感染重要的毒力因子之一，在感染过程中通过多种机制发挥重要的致病作用。经研究发现，VVC不仅具有很强的溶细胞作用，诱导内皮细胞产生大量超氧阴离子、在靶细胞膜上形成微孔，介导钙离子内流及刺激细胞形成的NOS(一氧化氮合酶)大量释放，引起细胞凋亡，而且也可以诱导肥大细胞中组胺释放，造成皮肤和肺组织的损害，但其确切致病机制至今尚未完全阐明[4-7]。我们的研究也发现，复性重组rVVC活性蛋白能够对肝癌细胞SMMC7721造成损伤，这种损伤随重组rVVC活性蛋白浓度增加而加强。为了进一步弄清对肝癌细胞SMMC77212造成损伤只是重组rVVC活性蛋白本身而非其他因素所致，本研究利用纯化重组rVVC蛋白为抗原，免疫日本大耳兔，成功制备了兔抗重组rVVC蛋白多克隆抗体，利用过硫酸铵盐析、Sephadex G25除盐、DEAE-Sephadex G100柱层析进行了纯化，得到纯度较高的多克隆抗体，该抗体经ELISA法检测其效价为1:12 800。通过Western blot分析证实该纯化多克隆抗体具有较好、较特异的免疫反应性。利用纯化多克隆抗体单独作用肝癌细胞SMMC7721，发现其对肝癌细胞并没有损伤作用，将其和复性rVVC活性蛋白共同作用肝癌细胞SMMC7721，其完全阻断了复性rVVC活性蛋白对肝癌细胞SMMC7721的损伤。这说明对肝癌细胞SMMC造成损伤的就是复性rVVC活性蛋白，同时也说明纯化兔抗重组rVVC多克隆抗体是具有保护和阻断作用的抗体。此多克隆抗体的成功制备，为后续的rVVC的促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。
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