Cav1.2和Cav3.1在犬左心室不同部位中表达的比较.docx

Cav1.2和Cav3.1在犬左心室不同部位中表达的比较

　　【关键词】 腺病毒,犬；电异质性；逆转录聚合酶链反应
【Abstract】 AIM: To investigate the expressions of mRNA of ICaL and ICaT across the canine left ventricular wall and to explore the possible molecular mechanism and significance of electrical heterogeneity. METHODS: The mRNA expressions of the ICaL αsubunit , ICaT transcript　were quantified by semiquantitative RTPCR in tissue sections obtained from different regions of canine left ventricle including epicardium (Ep), midmyocardium (M) and endocardium . RESULTS: The mRNA of　was expressed much more strongly in M and in En than that in Ep , but there was no significant difference between M and En ().　mRNA was almost absent in Ep, while just a little in M and En. CONCLUSION: There are considerable variations of calcium channels across the canie left ventricular wall,which may be the molecular basis of the distribution of ICaL and ICaT, and may play an important part in the occurence and drug treatment of reentry arrhythmias.
【Keywords】 adenoviruses, canine；electrical heterogeneity；RTPCR
【摘要】 目的：研究犬左心室三层心肌L型钙通道、T型钙通道主要亚单位mRNA的表达情况，探讨其复极异质性的可能分子基础及意义. 方法：应用RTPCR半定量分析犬左心室外、中、内三层心肌ICaL α亚单位、ICaT主要的亚单位 mRNA的表达量. 结果： mRNA的表达在左心室中层、内层均明显高于外层，但在中层和内层之间无统计学差异().　mRNA在外层几乎缺如，在中层、内层也只有少量表达且无明显统计学差异(). 结论：， mRNA在犬左心室三层心肌中表达存在明显的差异，这种差异可能构成左心室三层心肌ICaL及ICaT分布差异的分子基础，在折返性心律失常的产生及药物治疗中可能起着重要的作用.
【关键词】 腺病毒，犬；电异质性；逆转录聚合酶链反应
0引言
近年来大量的电生理研究证实，在大多数哺乳动物的左心室存在明显的跨室壁复极离散，而且认为瞬间外向钾电流是决定其电异质性的一个重要决定因素，这种复极异质性在某些折返性心律失常的产生中起着重要的作用［1-2］. 有报道［3］认为KchIP2基因是决定犬及人类左心室Ito异质性分布的基础. 最近又有研究发现,L型钙通道(ICaL)和T型钙通道(ICaT)在犬的左心室也存在明显的异质性分布，并认为也是形成左室电异质性的一个重要因素［4］，但构成左室ICaL，ICaT异质性的分子基础尚不甚明确. 我们旨在探讨ICaL的α亚单位及ICaT的主要亚单位 mRNA在犬左心室三层心肌中的表达情况，以明确其分子基础及意义.
1材料和方法
材料健康成年杂种犬 6只；Taq DNA聚合酶、100 bp DNA marker ；DEPC ；Trizol ；RNasin ；dNTPs；琼脂糖、AMV逆转录酶、寡聚六核苷酸随机引物；PCR仪(PE2480，美国).
方法
组织总RNA的提取将犬用30 g/L戊巴比妥钠以30 mg/kg静脉注射麻醉后迅速取左心室内、中、外层心肌，左心室三层组织定位按如下进行［5］: 外膜至其下 mm为外膜层;外膜下～ mm为中层;内膜表面至其下 mm为内膜层. 洗净吸干后置于液氮中保存,用Trizol按一步法分别提取外层、中层、内层心肌的总RNA: 每100~150 mg组织加1 mL Trizol,匀浆;加 mL氯仿摇匀, 12 000 g离心15 min;水相移至新管,加 mL异丙醇, 12 000 g离心15 min;弃上清,加750 mL/L乙醇1 mL,清洗, 7500 g离心5 min,无RNase水溶解RNA. 所提的总RNA在A260 nm/A280 nm为～之间, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察18S与28S条带清晰且密度比值约等于2,并无基因组污染时可用.
扩增引物设计与合成根据GenBank的序列,参考文献［6-7］,分别设计，及βactin(表1),由上海生物工程技术服务有限公司合成.表1PCR引物序列及PCR反应条件
逆转录反应取2 μg总RNA,分别加入随机引物 μg;加无RNase水至12 μL,混匀后70℃变性5 min,迅速冰上冷却5 min. 最后加入MMLV buffer 5 μL; dNTPs 5 μL; RNasin　μL; MMLV酶1 μL并加无RNase水至使总反应体系为25 μL. 上述混合物在42℃反应90 min后，置于-20℃保存待用.
扩增反应取以上逆转录产物1 μL,分别加入以下成分: Taq buffer 5 μL; dNTPs 5 μL;特异引物上游1 μL、下游1 μL; Taq酶 μL;加去离子水使整个反应体系为25 μL. 用以下条件进行PCR反应：βactin(内对照)反应条件为：起始变性94℃ 5 min,循环时94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 45 s,共进行32轮循环,最后延伸72℃ 10 min. 基因反应条件为：起始变性94℃ 5 min, 循环时94℃ 30 s, 54℃ 30 s, 72℃ 45 s,共进行35轮,最后延伸72℃ 10 min. 基因反应条件为：起始变性94℃ 5 min, 循环时94℃ 30 s, 52℃ 30 s, 72℃ 45 s,共进行35轮,最后延伸72℃ 10 min.
电泳成像分别将，与βactin等量的PCR扩增产物5 μL一起上样,经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，用全自动凝胶成像分析系统对凝胶成像，用ImageTool 分析各电泳条带灰度积分,以βactin的灰度积分作为标准校正. 产物的相对量=电泳条带灰度积分/βactin电泳条带灰度积分；产物的相对量=电泳条带灰度积分/βactin电泳条带灰度积分.
统计学处理： 所有数据以x±s表示,应用SPSS 统计软件,组间均数比较用F检验及q检验, 认为有统计学意义.
2结果
在犬左室三层心肌中的表达的mRNA表达在左心室中层、内层均明显高于外层，但在中层和内层之间无统计学差异(，图1，表2).
1: Marker; 2:内层; 3:中层; 4:外层.
图及βactin mRNA在犬左室三层心肌中的表达
表， mRNA在犬左室三层心肌中的比较
在犬左室三层心肌中的表达的mRNA表达在外层几乎缺如，在中层、内层也只有少量表达且无统计学差异(，图2，表2).

3讨论
左心室肌存在明显的电异质性现象，内层心肌较外层心肌具有更长的动作电位时程，以往的研究表明Na＋Ca2＋交换电流可能是一个重要的原因. 我们发现犬的左室三层心肌ICaL，ICaT亚单位mRNA在表达上存在明显的不同，在某种程度上与ICaL，ICaT电流密度在三层心肌中的分布一致. 正常情况下，心室肌细胞L型钙电流开放后引起钙经RyR2从肌浆网释放，实现心肌的兴奋收缩耦联. ICaL还是心肌细胞重要的复极电流，参与2相平台形成，是形成心律失常的重要离子流基础. Wang等［4］对犬左心室肌钙通道异质性研究后发现，L型钙电流密度在心内膜明显高于心外膜，并认为这是心内膜APD明显大于外膜APD及左心室电异质性的一个主要原因. 我们发现ICaL的α亚单位 mRNA在犬的左室三层心肌表达上存在明显的差异：外层表达明显少于内层，而中层和外层几乎相当. 这种变化在某种程度上与其L型钙电流密度在上述部位的变化一致，可能是内层心肌L型钙电流密度较大的基础，也是左室电异质性形成的基础之一. 但是有研究［8］表明ICaL的β亚单位能单独提高钙电流密度, 因此其β亚
　　单位在心室肌不同部位的表达情况还有待进一步研究. 另外ICaL在心肌中的表达是否涉及到其他因素的调控如自主神经系统和有关的信号转导都有待进一步研究.
ICaT被认为在心脏自律性、细胞生长和心血管重塑中起关键性的作用. Wang等［4］研究发现犬左心室心内膜细胞具有很少的T型钙电流，而在外膜细胞ICaT几乎不出现，并认为在左心室壁内外膜钙通道的密度和特性的不同亦可能是整个跨膜电不均一性的部分原因. 已知道，及是编码心肌T型钙通道的三种基因，而在左心室肌主要表达［7］. 我们发现 mRNA在犬左心室三层心肌也存在明显差异：在心内膜及中层心肌有少量表达，在心外膜心肌几乎没有表达. 这与T型钙电流密度在上述部位中的差异在某种程度上一致，可能也构成了T型钙电流密度在内层稍大及左室电异质性的分子基础之一. 正常情况下，心室虽存在电异质性却较少有心律失常的发生，在某些病理情况下电异质性增大，因此增强了钙内流的药物敏感性、易形成早期后除极、延迟后除极及其介导的触发活动从而导致折返性心律失常的发生［9］. 我们的结果提示，基因在三层心肌中表达的差异可能是构成上述病理现象的基础. 因此进一步对左室心肌电异质性及其分子基础的研究必将为折返性室性心律失常疾病机制的阐明和治疗药物的开发开辟广阔的前景.
【参考文献】
［1］ Stankovicova T, Szilard M, De Scheerder I, et al. M cells and transmural heterogeneity of action potential configuration in myocytes from the left ventricular wall of the pig heart［J］. Cardiovasc Res, 2000, 45(4):952-960.
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［3］ Rosati B, Pan Z, Lypen S, et al. Regulation of KChIP2 potassium channel βsubunit gene expression underlies the gradient of transient outward current in canine and human ventricle［J］. J Physiol, 2001, 533(Pt 1):119-125.
［4］ Wang HS, Cohen IS. Calcium channel heterogeneity in canine left ventricular myocytes［J］. J Physiol, 2003, 547(Pt 3): 825-833.
［5］ Antzelevitch C, Sun ZQ, Yan GX, et al. Cellular and ionic mechanisms umderlying erythromycin induced long QT intervals and Torsade de Pointes［J ］. J Am Coll Cardiol, 1996, 28(7):1836-1848.
［6］ Yue LX, Melnyk P, Gaspo R, et al. Molecular Mechanisms Underlying Ionic Remodeling in a Dog Model of Atrial Fibrillation［J］. Circ Res, 1999, 84(7):776-784.
［7］ Han W, Bao WS, Wang ZG, et al. Comparison of Ionchannel subunit expression in canine cardiac Purkinje fibers and ventricular muscle［J］. Circ Res, 2002, 91(9): 790-797.
［8］ Wei SK, Colecraft HM, Demaria CD, et al. Ca2+ channel modulation by recombinantauxillary beta subunits expressed in young adult heart cells［J］. Circ Res, 2000, 86(2):175-184.
［9］ Antzelevitch C. Electrical heterogeneity within the ventricular wall［J］. Basic Res Cardiol, 2001, 96(6):517-527.