聚酮合酶中模块的减少.docx

聚酮合酶中模块的减少1、聚酮化合物及其聚酮合酶聚酮化合物是一大类由细菌、真菌和植物将低级羧酸通过连续的缩合反应产生的天然产物，它包括许许多多具有抑制细菌、真菌、寄生虫、癌症等活性的化合物，有些抗真菌聚酮化合物同时还具有免疫抑制剂的活性，它被广泛地应用于医药、畜牧和农业。如今，这一化合物越来越为人们所重视，这主要是由于该化合物具有：无可比拟的生物学活性使之具有巨大的新药物开发潜力和商业价值，聚酮化合物所形成的药物已用于几乎所有重要的疾病治疗，每年的销售额超过了100亿美元；独特的结构和合成机制为人们研究酶催化的分子机制、分子识别和蛋白质的相互作用提供了空前的契机；聚酮合酶所具有的可塑性可以使人们方便地通过组合生物合成手段来获得新的化合物1。目前已发现了不少于10000种聚酮化合物，而由之衍生出的新产物更是难以记数。聚酮化合物是功能和结构最多样化的天然产物之一，它们的合成包括酰基辅酶A活化羧酸的一系列重复的醇醛缩合而形成有一定长度的聚酮链骨架，然后经过环化或者芳香化、或者与脱氧糖等结构单位连接等过程。尽管聚酮化合物的结构和特性千差万别，总的来说它可以分为两大类：芳香族聚酮化合物和复合聚酮化合物。前者是乙酸通过缩合形成的大部分酮基在酰基链的延伸和完成后都一直保持非还原状态，经过折叠和醇醛缩合形成六元环，芳香环随后被脱水还原，如放线紫红素、柔红霉素、四环素。复合聚酮化合物比芳香族聚酮化合物在结构变化上大的多，其构成单位有乙酸、丙酸和丁酸等，而且由于与芳香族聚酮化合物在合成化学、酮基还原过程、侧链的空间位阻上的本质差别，许多不经过折叠和芳香化，而是通过内酯化成环，还有一部分仍保持酰基链，如大环内酯抗生素红霉素和螺旋霉素、抗真菌抗生素雷帕霉素和两性霉素、聚醚类抗生素莫能霉素和南昌霉素、抗寄生虫抗生素avermectin等。聚酮化合物是通过聚酮合酶催化形成的，其催化过程类似于脂肪酸合酶催化的脂肪酸生物合成，即通过酰基CoA活化的底物之间的重复脱羧缩合而合成2，3，但两者在合成单位的选择、链装配过程中每个酮基还原程度的控制、以及芳香聚酮或复合聚酮链长的决定等方面也存在着明显的差异，主要体现在：FAS一般以乙酸作为起始单位，而PKS往往使用不同的起始单位，最为常用的有乙酸、丙酸，此外还有丁酸，杀假丝菌素使用的对氨基苯甲酸等，而avermectin所利用的起始单位可多达40余种；FAS一般只用乙酸为链延伸单位，而PKS除了利用乙酸作为链伸长单位外，还可利用丙酸或丁酸，在终产物中相应生成甲基或乙基侧链；PKS可以通过酮基选择性地还原和脱水，从而在终产物的相应位置形成酮基、羟基、双键或亚甲基等功能团，同时也决定了手性中心的立体化学构型。目前已经揭示的聚酮合酶可以分为三类：型、型和型4。研究和报道最多和较为透彻的是型PKS，它是由几个多功能的多肽组成，每一个多肽上都分别携带有参与聚酮生物合成所必需的各种酶的结构域，每个结构域只参与整个聚酮碳链构建中的一步生化反应，而参与一轮聚酮生物合成反应的所有结构域称为一个合成酶单位，编码这个合成酶单位的DNA称为一个模块。型模块结构的PKS就犹如在轨道上行驶的一列火车，在起点由特定的“搬运工”酰基转移酶把不同的起始单位装车后，通过“装配工”酮脂酰ACP合成酶经过缩合反应将不同的“原料”羧酸起始或延伸单位进行组装，随着火车的运行，不断地从一个“停靠装配站”酰基载体蛋白到下一个，聚酮链也不断地得到延伸，中途根据模块组成的不同和指令要求，在其它不同的“特殊工种装配工”脱水酶、烯醇还原酶的作用下相应地进行还原或脱水或进一步还原，直至到达终点，在“装卸工”硫酯酶的帮助下，完成最后的工序并将聚酮前体产物从PKS上卸载下来。这种PKS模块结构的发现有其非同寻常的意义。尽管各种聚酮化合物结构各异，PKS模块的底物特异性决定了I型PKS对起始单位和延长单位的选择，而PKS每个模块上还原结构域的种类则使聚酮产物得到不同程度的还原。复合聚酮化合物结构的多样性来自聚酮骨架组成单位的多样性和每个碳单位的不同还原程度，这意味着聚酮抗生素的结构具有相当大的可塑性，故可通过模块内或模块间的合理重组，设计出新基因组成或新的生物合成途径，这也是I型PKS作为组合生物学主要研究对象的重要原因之一。型PKS是一个多功能酶复合体，只包含一套可重复使用的结构域，每一结构域在重复的反应步骤中被多次地用来催化相同的反应，其首次报道是在1984年5。以来自的芳香族聚酮化合物tetracenomycinC研究的较多6，尽管已经发现了影响链长的两个链长决定因子KS和KS，但确切机制仍然不是十分清楚。对型PKS的研究近年来也取得了一些进展，如Bao等7对柔红霉素产生菌的研究结果显示，dpsC基因决定了生物合成的起始单位，DpsC专一性地使用丙酰CoA为起始单位，一般来说，型PKS的起始单位均为乙酰CoA。另外，Bisang等8找到了型PKS和型PKS的链长因子之间的共同点，这是型和型PKS有机联系的一个切入点。他们发现型PKS的KSQ及型PKS的CLF和型PKS的KS结构域类似，惟一的区别是KS的活性中心残基半胱氨酸被高度保守的谷氨酰胺代替，这个氨基酸对这一结构域的脱羧酶活性以及聚酮化合物的合成具有重要的作用。和型PKS相比较，型PKS在起始单位和延长单位的选择方面变化不大，所以它的结构多样性主要是来自于聚酮合成后的修饰步骤。1999年，日本东京大学的Funa等9发现了一种类似苯基苯乙烯酮合成酶的PKSRppA，后来被称为型PKS。RppA是一个在链霉菌中发现的与芳香族聚酮化合物苯基苯乙烯酮合成相关的酶，它是一种同二聚体酶并可重复进行缩合反应，催化芳香族聚酮化合物淡黄霉素生物合成。催化苯基苯乙烯酮形成的苯基苯乙烯酮合成酶被认为是植物所特有的，然而来自的rppA基因所编码的一个372个氨基酸的蛋白却与苯基苯乙烯酮有着很大的同源性，它以丙酰CoA作为起始物，进行4个延伸反应将五肽释放和环化成为1，3，6，8四羟基萘，THN将会被氧化成淡黄霉素，然后聚合成各种有色的化合物。由RppA催化合成的THN不仅是黑色素还是各种含萘醌环的次级代谢产物的中间产物。型PKS和其它两种PKS迥然不同，它们不依赖于作为酰基载体的ACP及其上的4磷酸泛酰巯基乙胺。型和型PKS常常通过ACP活化酰基CoA的底物，而型PKS直接作用于酰基CoA活化的简单羧酸。尽管结构和机制不相同，但所有类型的PKS都是通过酰基CoA的脱羧缩合和KS结构域或亚基催化CC键的形成。在进化关系上型PKS与其它PKS及已知的FAS也相距甚远。在过去的十年里，随着生物合成基因簇克隆方法学的创新以及DNA测序技术和生物信息学的不断发展和研究成果的不断积累，人们对于PKS的认识越来越全面，也越来越深入，但人们不禁还是想知道我们究竟对PKS了解多少？如今越来越多的报道显示型、型和型PKS并不能完全囊括不断涌现出的新的聚酮合酶4。从结构的角度来看，有些型PKS的结构域也可以是被重复使用的，如AviM、CalO5、NcsB、SgcE和CalE8等；有些型PKS的结构域也可以是不能被重复使用的，如NonJKPQU；有些PKS似乎是型PKS和型PKS的杂合体，如LnmIJ/LnmG和PedFG/PedCD。从机制的角度来看，有些PKS依赖ACP，而有些PKS不依赖ACP。从合成的角度来看，有些PKS即可以催化形成CC键，也可以催化形成CO键，如NonJK。也许，我们眼前所发现和利用的PKS只是整个PKS庞大家族中的小小一员，更多更精彩的内容正等待人们去揭示。2、聚酮合酶的组合生物合成自从以英国约翰英纳斯中心的DavidAHopwood为先驱的研究人员在链霉菌模式菌种天蓝色链霉菌中建立和发展遗传操作系统以来，链霉菌的分子遗传学一直成为国际生命科学领域的一个热点。经过三十年广泛而深入的研究，其中抗生素生物合成基因的克隆在抗生素领域已产生了深远的影响。首先，这些基因的克隆和测序使我们对抗生素的特征有了新的认识，例如，对抗生素生物合成基因成簇排列规律的发现极大地帮助了新基因簇的克隆和分析。现代分子生物学技术使人们对抗生素有了更深入的了解的第二个方面是对聚酮类抗生素的认识。已知抗生素结构种类繁多，然而它们当中的最庞大的一类，包括大环内酯类、聚醚类、多烯类、蒽环类等都是通过聚酮合酶途径合成的，聚酮链合成的底物选择、还原程度和产物的立体化学构型都是由PKS上相应模块中的结构域决定的，每个结构域的功能都一一对应在最终产物的结构上，这种多功能模块化PKS中催化活性中心和化学合成步骤及终产物化学结构的一一对应关系，使得通过编辑生物合成基因来设计杂合产物成为可能，并由此产生出一个崭新的研究领域聚酮合酶的组合生物学。聚酮合酶的组合生物学就是通过基因工程等相关技术人为地对产生抗生素等微生物次级代谢产物合成途径进行合理的改造，由此产生非天然的杂合基因或基因簇，从而形成新的非天然的天然聚酮化合物，与传统组合化学的主要区别是它是在基因水平上由微生物来合成自然界原本并不存在的新化合物，而且这种化合物的数量是惊人的。可以从理论上来推算一下通过聚酮合酶的组合生物学所衍生的聚酮化合物的潜力10。CP=ATLATE4MATL代表负责加载不同起始合成单位的AT结构域；ATE代表负责加载不同延伸合成单位的AT结构域；4代表由酮基的经不同结构域催化形成产物的可能性；M代表基因簇中模块的数目。这还不包括AT两种立体化学可能性、KR结构域两种立体化学可能性、加尾酶等其它可能增加产物数量可能性的因素。以一个像红霉素这样典型的包含6个模块的PKS基因簇为例，若含有3种类型的AT，那么可能形成的聚酮化合物的理论值就接近10000000，这就为聚酮库的建立奠定了坚实的理论基础。纵览聚酮合酶特别是型PKS组合生物学近十年来的发展，归纳起来采用技术有如下几种1132。聚酮合酶中模块的减少聚酮链的构成单位与催化它形成的PKS模块是一一对应的，因此，聚酮链的长度可以通过改变延长单位模块的数目来完成，前提是最后一个模块和环化酶结构域必须能够识别非天然的中间产物。如前所述，在红霉素PKS中，除了融合于模块1中的两个起始加载结构域和模块6中的TE结构域外，有六个链延伸模块分别位于DEBS1、DBS2和DEBS3中，红霉素合成过程中内酯环的大小由DEBS中模块数决定，利用基因工程方法重新调整TE的位置，使TE重新和一个、两个、三个或五个DEBS模块组合，结果产生了新的截短了的PKS，并合成了预期的二酮、三酮、四酮和六酮化合物，除二酮外，其它的几个聚酮化合物都以内酯环形式存在18，3336。这些实验表明，环化酶具有较广的底物特异性，它的重新定位可以产生各种链长的聚酮。聚酮合酶中模块的增加在基因中添加模块直至2001年才获得成功。Rowe等将来自合成雷帕霉素PKS的模块2、模块5分别插入截短的DEBS1TE模块1和模块2之间，合成了在相应位置多出一个结构单位的四酮化合物；将雷帕霉素PKS的模块2、模块5分别插入全长DEBS的模块1和模块2之间，则合成了多出一个结构单位十六元环的聚酮化合物36。聚酮合酶中模块的替换在红霉素DEBS1模块1的N端，存在两个起始加载结构域，它们负责红霉素合成第一步反应6dEB生物合成起始物丙酰CoA的选择和加载，因此这两个结构域也被称为起始加载模块。已知不同的起始加载模块对底物的选择性不同，avermectin的起始加载模块对起始物要求非常宽松，它可加载多达40余种不同化合物作前体37。Marsden用avermectin的起始加载模块取代红霉素的起始加载模块构建的糖多孢红霉菌突变体，通过添加不同的前体合成了新的C13位为异丙基、2丁基等红霉菌A、B和D衍生物38。Pfeifer用来源于合成利福霉素的起始加载模块替换红霉素的起始加载模块也合成了在C13位结合苯环的红霉菌衍生物39。模块中结构域的减少关于PKS基因工程改造的第一例成功的报道就是对红霉素PKS模块5中KR结构域的缺失失活。在红霉素PKS模型提出时，为验证模型的正确性，Donadio等通过同源重组同框缺失DEBS3中模块5的KR5结构域的80个氨基酸，正如预料的那样，突变体合成了新的在C5位是酮基的红霉素衍生物5，6dideoxy3mycarosyl5oxoerythronolideB39。这不仅证实了6dEB生物合成模型的正确性，还给人们以极大的启示：在DEBS中结构域的功能和结构是相对应的；DEBS以及6dEB后修饰酶对底物的要求并不十分严格，突变产生的中间产物能被下游的结构域有效的加工利用。另一个类似的实验是针对DEBS2模块4中烯酰基还原酶结构域的功能失活，它衍生的大环内酯中C6C7由单键变成了双键40。此外，还有一些关于使结构域功能丧失的成功报道，但主要是集中于与还原功能有关的KR、ER、DH结构域，这是因为它们决定了相应碳单位不同的还原程度，通过改变酮基的还原程度可以产生更多的杂合聚酮。模块中结构域的增加酮基的还原程度不但影响聚酮碳骨架的多样性，而且影响内酯化的方式和以羟基为中介进行的其A：红霉素全长DEBS；B：只包含模块1、2和TE结构域的截短了的红霉素DEBS；C：只包含模块1、2、3和TE结构域的截短了的红霉素DEBS；D：只包含模块1、2、3、4、5和TE结构域的截短了的红霉素DEBS图1聚酮合酶中模块减少示意图A：只包含模块1、2和TE结构域的截短了的红霉素DEBS；B：在截短了的红霉素DEBS模块1、2之间增加了一个来自雷帕霉素PKS的模块2；C：在截短了的红霉素DEBS模块1、2之间增加了一个来自雷帕霉素PKS的模块5；D：红霉素全长DEBS；E：在全长红霉素DEBS模块1、2之间增加了一个来自雷帕霉素PKS的模块2；F：在全长红霉素DEBS模块1、2之间增加了一个来自雷帕霉素PKS的模块5它官能团与聚酮的结合。KR结构域的增加或KRDH结构域的增加或KRDHER结构域的增加，都有可能影响酮基的不同程度的还原而改变其它基团连接以及改变内酯环化的位点。McDaniel等将红霉素PKS的模块2的KR替换为来自于雷帕霉素PKS的模块4的DHKR，相当于模块2比原来多增加了一个DH结构域，使原有的羟基发生了脱水，形成了C=C双键16。同样，Kao等将DEBS模块2的KR替换为雷帕霉素PKS模块l的DHERKR也得到了一个新的八元环化合物。用来自雷帕霉素PKS的模块4的DH4KR4双结构域替换只包含模块1、2、3和TE的截短了的红霉素DEBS的KR2结构域。模块中结构域的替换不同PKS模块选用不同的聚酮链延伸单位，延伸单位的选择是由每个模块的AT结构域控制的，AT结构域的替换也可以导致新的聚酮化合物的产生41，例如，用RAPS模块2中具有丙二酰CoA特异性的AT2替代DEBS1TE中模块1中具有甲基丙二酰CoA特异性的AT1，产生了预期的两个新的三酮内A：只包含模块1、2和TE结构域的截短了的DEBS；B：将avermectin的起始加载模块取代红霉素的起始加载模块；C：红霉素全长DEBS；D：将利福霉素的起始加载模块取代红霉素的起始加载模块图4聚酮合酶模块中结构域减少示意图图5聚酮合酶模块中结构域增加示意图酯，这两个新产物在内酯环的C4位都缺少了一个甲基42。在另外一个实验中，用丙二酰CoA特异性的三个异源AT结构域来替代甲基丙二酰CoA特异性的DEBSAT1或AT2结构域，也产生了新的红霉素衍生物。Lin等第一次尝试在全长的PKS中进行结构域的替换，他们将红霉素PKS模块6的甲基丙二酰专一性AT替换成来自于雷帕霉素PKS模块2的丙二酰专一性AT，结果在产物中产生在C2位缺少一个甲基侧链的新化合物。在6dEB的立体结构中，其羟基有S和R两种构型，而羟基的构型由相应模块中的KR酶域决定，通过替换KR酶域可以改变6dEB的立体结构。例如用雷帕霉素KR2替换红霉素DEBS3中的KR6合成了3位羟基差向异构的6dEB衍生物22。前体指导下的新聚酮化合物的合成除上述方法外，还可用破坏PKS模块1的KS结构域活性，再通过添加适当前体合成新的聚酮化合物43，44。Jacobsen等尝试了用不同前体产生化合物的构想44，他们首先获得了红霉素合成途径中第一步缩合步骤被阻断的突变株，然后再通过外加不同的人工合成的小分子化合物，得到不同的聚酮化合物。3、展望自1990和1991年英国剑桥大学的PeterLeadlay和美国Abbott实验室的LeonardKatz在红霉素生物合成途径中第一次揭示基因和酶所具有的模块特征以来45，46，通过遗传工程对模块PKS基因进行可预测的人工改造已被各国研究人员所证实，利用模块或结构域增加、减少、替换等多种组合生物学手段设计和改造基因簇，形成一系列非天然的天然性化合物，在药物创新方面取得了一系列突破，这种突破不仅具有其重要的基础理论的价值，也具有潜在的应用前景，但仍然存在许多未解之谜和艰难挑战值得人们进行更深入研究和探索。一个重要的挑战就在于尽管目前人们可以有的放矢地对PKS模块或结构域进行基因的定向操作，但要面临和解决的问题是这些发生了生物合成途径变化所产生的新的结构中间体如何被下游的模块或结构域或后修饰基因所“一视同仁”予以接纳而发挥作用？这直接影响整个流水线的顺利运转和最后产量。随着人们的努力，越来越多的呈模块结构的聚酮生物合成途径被发现，但仍然还不清楚哪些模块或结构域必须存在于同一个多肽中才能发挥作用？哪些模块或结构域可以以单个蛋白的形式来发挥功能？在这样一条装配线上，如果可以装配的单个部件越多，那么可以想象通过排列组合所形成的产品的种类就越丰富。尽管如此，某个改造的特定的生物合成途径目前只能产生一个或少数若干个新的产物，它仍然属于低通量，还无法“随心所欲”、“轻而易举”地产生一整套包含多个不同突变的PKS，从而一次性地获得结构特定而且种类繁多的新的聚酮化合物库，这还有待于人们对聚酮中间物在PKS不同模块之间转运规律的深入揭示。此外，许多聚酮化合物在合成的初期往往是没有生物学活性的，只有当其从PKS装配线上释放下来后经过一系列不同的后修饰，如氧化、糖基化等过程才最终完成。因此，这也为通过组合生物合成创造新产物提供了机会，例如可以通过改造和替换相应的后修饰基因来实现产物创新。除了对现有基因的人为改造之外，人们还在继续从自然界中寻找更多、结构更新颖、活性更特别的新的“原材料”，在这些新的原材料发现的同时，也可能伴随着新的生物合成途径的揭示，这无疑也为新的非天然“天然产物”的创造带来新的设计蓝图。另一个挑战来自于从技术和应用的角度可用于聚酮化合物高效表达的宿主系统的发展和应用。聚酮合酶中模块的减少