超声波辅助高氯酸法提取牛肝中左旋肉碱工艺优化.pdf

第 28 卷第 21 期农 业 工 程 学 报Vol.28No.212802012 年11 月Transactions of the Chinese Society of Agricultural EngineeringNov.2012超声波辅助高氯酸法提取牛肝中左旋肉碱工艺优化孙娜1，余群力1，曹晖2（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州 730070；2.陕西秦宝牧业发展有限责任公司，宝鸡 721000）摘要：为探索超声波处理对左旋肉碱提取效果的影响，找出最佳的处理技术参数，以牛肝脏为原料，用超声波辅助酸提法提取左旋肉碱，在超声功率、超声时间和料液比 3 个单因素试验的基础上，采用二次回归通用旋转组合试验设计对左旋肉碱超声波辅助提取工艺进行优化。结果表明，试验中所选参试因子对左旋肉碱提取得率的影响大小顺序为超声波功率、料液比、超声时间。最优工艺条件为：原料用量为 100 g，在超声功率 437 W，超声时间 15 min，料液比 15 g/mL 时，左旋肉碱提取得率达 38.37 mg/kg。该研究表明超声波技术在左旋肉碱提取工艺中具有较高的应用价值和指导作用。关键词：超声波，提取，优化，牛肝脏，左旋肉碱doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2012.21.039中图分类号：TS251.95文献标志码：A文章编号：1002-6819(2012)-21-0280-07孙娜，余群力，曹晖.超声波辅助高氯酸法提取牛肝中左旋肉碱工艺优化J.农业工程学报，2012，28(21)：280286.Sun Na,Yu Qunli,Cao Hui.Optimizing of ultrasonic wave-assisted extraction process of L-carnitine from bovine liverJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2012,28(21):280286.(inChinese with English abstract)0引言陕西秦宝牧业股份有限公司是西部肉牛产业带上最大的现代化肉牛企业，伴随着企业的发展，每年有大量牛肝脏没能得到有效地利用，处理牛肝脏已成为屠宰场的一大难题，合理利用这些副产品，将成为企业增效的另一重要途径。秦宝牛由国际顶级日本和牛与中国五大黄牛之尊秦川牛杂交培育形成，继承了秦川牛个体大，肉质细嫩、肉味香浓等优点，而其肝脏含有丰富的左旋肉碱活性成分，具有营养保健功能，有一定的开发利用价值。左旋肉碱（L-carnitine 亦称 vitamin BT），是一种相对分子量小的类蛋白质分子，化学名为 L-羟基-三甲胺丁酸（-hydroxy-Y-butyrobetaine），分子式为 C7H15NO31。其主要功能是促进脂类代谢，将长链脂酰基带入线粒体基质，同时将线粒体内产生的短链脂酰基输出，调节线粒体内外酰基CoA/CoA（辅酶 A）的比率。左旋肉碱缺乏将干扰脂肪酸的代谢而导致能量合成不足，出现易疲劳，收稿日期：2012-01-09修订日期：2012-10-11基金项目：国家现代农业(肉牛牦牛)产业技术体系资助（CARS-38）作者简介：孙娜（1988），女，甘肃庆阳人，研究方向为畜产品贮藏加工。兰州甘肃农业大学食品科学与工程学院，730070。Email：SUNNA通信作者：余群力（1962），男，甘肃兰州人，教授，博士生导师，主要从事畜产品贮藏加工研究。兰州甘肃农业大学食品科学与工程学院，730070。Email：Y肌肉无力，心慌等症状，严重者出现代谢紊乱，昏迷甚至死亡2-8。左旋肉碱在食品、营养、饲料以及医药等领域广泛应用，有广阔的应用前景，目前左旋肉碱仅有瑞士、意大利、日本等少数国家能够生产，国内需求全靠进口，价格昂贵（3 000 元/kg），国内对该产品的研究开发甚少。肉碱有 3 种光学异构体，即左旋肉碱、右旋肉碱和消旋体肉碱，但只有左旋肉碱在动物体内具有生物活性；右旋肉碱和消旋体肉碱都是合成物质，生物体中不存在，采用天然提取法，避免了右旋肉碱和消旋体肉碱产生，可得到纯天然的左旋肉碱制品，具有一定的开发前景9-11。目前，国内外对牛肝中左旋肉碱的提取主要采用高氯酸法提取和均质机辅助高氯酸法提取12，应用超声波技术辅助提取左旋肉碱的研究还未见报道。超声波技术用于天然活性成分的提取具有明显的优势，利用超声波产生的强烈振动、空化效应、搅拌作用等可以加速活性成分进入溶剂，提高提取率，有效缩短提取时间13-20。本研究首次将超声波提取技术应用在左旋肉碱提取工艺中，以牛肝脏为原料，利用超声波破壁技术，通过对超声功率、超声时间、料液比 3 因素进行单因素试验，研究不同条件下对左旋肉碱提取得率的影响，从而得出超声波提取左旋肉碱的较优单因素条件，并以此为基础，利用响应面优化得出左旋肉碱最佳提取条件，为牛肝中左旋肉碱的提取提供参考。第 21 期孙娜等：超声波辅助高氯酸法提取牛肝中左旋肉碱工艺优化2811材料与方法1.1材料与仪器牛肝脏（购自陕西秦宝牧业发展有限责任公司）。左旋肉碱标准品、5,5二硫代双-（2-硝基苯甲酸）、肉碱乙酰辅酶 A（购自美国 Sigma 公司）；乙二胺四乙酸二钠（购自天津颧洋生物制品科技公司）；三羟甲基氨基甲烷（购自北京奥博星生物技术公司）；盐酸、氢氧化钠、高氯酸均为国产分析纯。JY92-IIDN 超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份公司；TGL-16M 高速台式冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器公司；756P 紫外可见分光光度计，上海光谱仪器公司；LE-52 系列旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。1.2试验方法1.2.1左旋肉碱提取方法左旋肉碱提取具体操作如下：100 g 牛肝样品中加入 500 mL 3%（体积分数）高氯酸，匀浆 5 min，转移至烧杯，超声波破壁处理10 min，处理液在0冰浴上保持 0.5 h，促使左旋肉碱充分溶于高氯酸溶液中，以 4500 r/min 离心处理 10 min，取上清液，沉淀加 400 mL 的 3%（体积分数）高氯酸，同样匀浆 5 min 后，超声 10 min，再次离心分离取上清液，合并 2 次上清液，用 NaOH 调 pH 值至 7.8，旋转蒸发浓缩至 45 mL 左右后真空抽滤，定容至 50mL21-24。1.2.2标准曲线的绘制精密称取左旋肉碱标准品，置于容量瓶中，溶解、定容，配制成质量浓度分别为 10，20，40，60，80 mg/L 的溶液。精密量取混合用液 180L（含 0.4 mmol/L 5,5二硫代双-（2-硝基苯甲酸）、1.33 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠和 pH 值为 7.5 的 266.7 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸），分别加入 5 支编号试管中并用蒸馏水稀释至 2.5 mL，再分别加入浓度为 10、20、40、60、80 mg/L 的标准液 20 L，混匀后，在每支试管中加入 0.0176 mmol/L 肉碱乙酰辅酶 A 溶液157 L，35加热 10 min 后，测定反应液在 412 nm处的吸光度，左旋肉碱浓度在 1080 mg/L 的范围内 呈 一 定 的 线 性 关 系，线 性 回 归 方 程 为y=0.0054x+0.0097，其决定系数 R2=0.9987。1.2.3左旋肉碱提取得率的计算左旋肉碱的提取得率(mg/kg)=1000CVm（1）式中，C 为根据标准曲线得出提取液中左旋肉碱的质量浓度，mg/L；V 为提取液定容后的体积，mL；m 为所用牛肝脏的质量，g。1.3左旋肉碱提取的单因素试验1.3.1超声波功率对左旋肉碱提取得率的影响100g 牛肝样品，在料液比为 15g/mL，高氯酸体积分数为 3%，超声时间为 10 min 的条件下，研究超声功率分别为 200，300，400，500，600 W时对左旋肉碱提取得率的影响。1.3.2超声时间对左旋肉碱提取得率的影响100g 牛肝样品，在料液比为15g/mL，高氯酸体积分数为3%，超声功率为400 W 的条件下，研究超声时间分别为 5，10，15，20，25 min 时对左旋肉碱提取得率的影响。1.3.3料液比对左旋肉碱提取得率的影响100 g 牛肝样品，在高氯酸体积分数为 3%，超声时间 10 min，超声功率 400 W 的条件下，研究料液比分别为 13，14，15，16，17 g/mL时对左旋肉碱提取得率的影响。1.4左旋肉碱提取工艺的优化在单因素试验基础上，根据 Box-Behnken 的中心组合试验设计原理，选取超声功率、超声时间和料液比对左旋肉碱提取影响显著的 3 个因素，以左旋肉碱提取得率为响应值，通过响应曲面分析（response surface analysis，RSA）进行提取条件的优化，试验因素与水平设计见表 1。表 1Box-Behnken 设计试验因素水平编码Table 1Factors,levels and code of Box-Behnken design test因素编码水平超声功率X1/W超声时间X2/min料液比X3/(g mL-1)-13005160400101515001514注：牛肝样品为 100 g。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1超声功率对左旋肉碱提取得率的影响注：牛肝样品为 100g，料液比 15 g/mL，高氯酸体积分数 3%，超声时间 10 min。图 1超声波功率对左旋肉碱提取得率的影响Fig.1Effects of ultrasonic power on L-carnitine yield农业工程学报2012 年282由图 1 可知：超声波功率在 200400 W 范围之内时，随着功率提高左旋肉碱提取得率上升，功率为 400 W 时左旋肉碱提取得率最高，功率再升高，提取得率略有下降，这是因为超过 400 W 的超声功率产生空化气泡塌陷，破坏了左旋肉碱的基本结构，导致左旋肉碱的分解，使左旋肉碱提取得率下降。所以，选择 400 W 为较佳超声功率。2.1.2超声时间对左旋肉碱提取得率的影响由图 2 可知，左旋肉碱提取得率在超声时间为510 min 内显著上升，超声时间为 10 min 时达到最大，但当超声时间超过 15 min 后左旋肉碱的提取得率下降趋势却趋于平缓。这是因为超声波是通过一个发射针传到液体中的，发射针的快速振动会产生大量的热，在短时间内这部分热能有利于提高颗粒内部的温度和压力，使扩散速率加快，从而有利于左旋肉碱的浸出；但是超声时间超过10 min 后，产生的热因为急剧增加而无法扩散，导致液体内部热量积累使活性成分分解，同时太高的热量很容易在发射针附近产生多个空穴，反而降低超声效率，影响破壁效果25。所以，选择10 min 为较佳超声时间。注：牛肝样品为 100 g，料液比 15 g/mL，高氯酸体积分数 3%，超声功率 400 W。图 2超声时间对左旋肉碱提取得率的影响Fig.2Effects of ultrasonic time on L-carnitine yield2.1.3料液比对左旋肉碱提取得率的影响注：牛肝样品为 100g，超声时间 10 min，高氯体积分数 3%，超声功率400 W。图 3料液比对左旋肉碱提取得率的影响Fig.3Effects of solid-liquid ratio on L-carnitine yield从图 3 可以看出，料液比范围在 1315g/mL 之间时，左旋肉碱提取得率上升最为迅速，这主要是由于牛肝处理量越大，在相同条件下提取所得左旋肉碱越多所致。当料液比达到 15 g/mL 时，左旋肉碱提取得率最高。当料液比超过 15 g/mL时，左旋肉碱提取得率有略微下降，这是因为超声波破碎是通过振动波传送到液体中形成的剪切力对细胞进行破碎，在超声功率和超声时间相同时，一定的剪切力作用于颗粒密度过大的溶液，其破坏力也相应减弱。所以，从成本和提高工作效率的角度考虑，选择 15 g/mL 为较佳料液比。2.2响应面分析法对左旋肉碱提取工艺的优化对牛肝左旋肉碱超声功率(X1)、超声时间(X2)、料液比(X3)进行了 3 因素 3 水平响应面分析，超声波辅助提取左旋肉碱的三因素二次回归旋转组合试验方案及结果见表 2 和表 3。表 2响应面分析试验及结果Table 2Arrangement of central composite design andcorresponding test values of L-carnitine yield试验号超声功率 X1超声时间 X2料液比 X3L-肉碱提取率 Y/(mg kg-1)10-1127.4321-1035.98300041.79410-136.4350-1-124.326-10-114.03701137.73810132.049-1-1020.4510-11028.041100040.411200039.721300041.6314-10126.711500039.031611035.321701-123.85注：共有 17 个试验，其中 12 个为析因试验，5 个为中心试验以估计误差，牛肝样品为 100 g。表 3Box-Behnken 试验方差分析Table 3Variance analysis of Box-Behnken design test方差来源平方和自由度均方F 值P 值模型1074.639119.4043.410.0001X1319.291319.29116.070.0001X235.11135.1112.760.0091X379.88179.8829.040.0010X1X217.02117.026.190.0418X1X372.85172.8526.480.0013X2X329.00129.0010.540.0141X12141.611141.6151.480.0002X2295.77195.7734.820.0006X32231.461231.4684.140.0001残差19.2672.75失拟项13.5434.513.160.1479纯误差5.7241.43总回归1093.8816注：P0.05 为影响显著，P0.10 为影响不显著。第 21 期孙娜等：超声波辅助高氯酸法提取牛肝中左旋肉碱工艺优化283根据表2的结果应用SAS 软件进行编程计算，通过其响应面回归（RSREG）程序进行数据分析，得出回归模型。回归方程为Y=40.52+6.32X1+2.09X2+3.16X3 2.06X1X24.27X1X3+2.69X2X3 5.80X12 4.77X22 7.41X32（2）式中，Y 为 L-肉碱提取得率，单位为 mg/kg；X1为超声功率，单位为 W；X2为超声时间，单位为 min；X3为料液比，单位为 g/mL。由表 3 可知，该模型达到极显著水平（P0.01）。方程一次项（X1、X2、X3）、二次项（X12、X22、X32）的影响都是极显著的（P0.01），交互项（X1X2、X1X3、X2X3）的影响是显著的（P0.05），其决定系数 R2=0.9791，试验值与预测值非常接近。方差分析表明，试验所选参试因子对左旋肉碱提取得率影响大小顺序为超声波功率、料液比、超声时间。模型的失拟项不显著（P0.05），以上回归方程较好的拟合了试验数据，试验误差小，可以用于牛肝超声破壁提取左旋肉碱实验的理论预测。对超声功率（X1）、超声时间（X2）、料液比（X3）3 因素，两两作交互作用分析，对其作响应曲面及等高线，如图 4a、图 4b 和图 4c。响应面可以直接反映各试验因子对响应值影响的大小，由等高线图得到最优条件下各试验因子的取值。如果一个响应曲面坡度非常的陡峭，表明左旋肉碱提取得率对于各试验因子的改变非常敏感；反之，如果一个响应曲面坡度相对平缓，表明左旋肉碱提取得率可以忍受试验因子的变异，而不影响响应值的大小。等高线的形状反映交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著。图 4a、图 4b 和图 4c 中响应曲面坡度非常的陡峭且等高线呈椭圆形，故超声功率和超声时间两因素之间、超声功率和料液比两因素之间、超声时间和料液比两因素之间的交互作用显著。通过对回归模型进行数学分析可知，牛肝脏超声波破壁辅助提取左旋肉碱的最优工艺参数为超声功率 437 W、超声时间 15 min、料液比为 15g/mL，在此优化条件下，牛肝中左旋肉碱提取得率的理论值 38.62 mg/kg。为了进一步验证响应面分析法的可靠性，采用上述最优条件进行左旋肉碱提取，实际测得左旋肉碱提取得率为 38.37 mg/kg，与理论值相比，相对误差为 0.65%。传统酸提法左旋肉碱提取得率为 33.00 mg/kg17，与传统酸提法相比，超声波辅助酸提法提取得率提高了 5.37 mg/kg。因此，采用响应面分析优化得到的超声波破壁条件参数准确可靠，可用于实际操作。注：料液比为 15 g/mLa.超声功率与超声时间响应曲图和等高线注：超声时间为 15 minb.料液比与超声功率响应曲图和等高线农业工程学报2012 年284注：超声功率为 437 Wc.料液比与超声时间响应曲图和等高线图 4左旋肉碱提取得率响应面分析Fig.4Response surface analysis on L-carnitine yield3结论1）利用单因素和响应面法对牛肝中左旋肉碱的超声波辅助提取条件（超声功率、超声时间、料液比）进行了优化研究，结果表明超声功率、超声时间、料液比 3 个因素对牛肝中左旋肉碱的提取得率均有显著影响，各因素对左旋肉碱提取得率的影响大小顺序为超声波功率、料液比、超声时间；2）原料用量为 100 g 时，超声波辅助提取牛肝左旋肉碱最佳工艺优化参数为超声功率 437 W，超声时间 15 min，料液比 15 g/mL，左旋肉碱提取得率可达 38.37 mg/kg。该研究说明超声波技术在动物活性成分提取方面具有较好的应用效果，可为牛肝中左旋肉碱的提取提供参考。参考文献1王鸳鸯，赵彦华.L-肉碱的研究现状及其应用J.中国食品添加剂，2006，16(1)：136139.Wang Yuanyang,Zhao Yanhua.Current situation aboutthe study of L-carnitine and its applicationJ.ChinaFood Additives,2006,16(1):136139.(in Chinese withEnglish abstract)2张钟元，王强.L-肉碱的生理功能及其应用研究进展J.现代生物医学进展，2008，8(6)：11811183.Zhang Zhongyuan,Wang Qiang.Research advance ofphysiological function and application of L-carnitineJ.Progress in Modern Biomedicine,2008,8(6):11811183.(in Chinese with English abstract)3Sethumadhavan Savitha,Jayavelu Tamilselvan.Oxidativestress on mitochondrial antioxidant defense system in theaging process:role of DL-lipoic acid and L-carnitineJ.Clinica Chimica Acta,2005,355(2):173180.4Fausi Rassoul,Heinz Loster,Volker Richter.Effects ofL-camitineonsucrose-inducedhyperlipidaemiaJ.Monatshefte fur Chemie,2005,136(8):15011507.5Werbach MR.Nutritional strategies for treating chronicfatigue syndromeJ.Alternative Medicine Review 2000,5(2):93108.6Bellinghieri G,Santoro 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