浅论大鼠脊髓鞘内注射阿米洛利及混合替扎尼定治疗炎症性疼痛的研究.docx

浅论大鼠脊髓鞘内注射阿米洛利及混合替扎尼定治疗炎症性疼痛的研究
【摘要】 【目的】 评价脊髓鞘内注射阿米洛利及混合替扎尼定对炎症性疼痛的治疗效能。【方法】 96只SD大鼠，质量250 ～ 300 g，随机分成16组(n = 6)：对照组、阿米洛利组( ～ 100 μg)、替扎尼定组( ～ 5 μg)、混合药物组(1/2、1/4、1/8、1/16)、各拮抗组。鞘内置管后7 d采用20 g/L的多聚甲醛溶液50 μL皮下注射方法制作炎症性疼痛模型。观察记录2时相大鼠缩足舔足次数。计算各药物的半数有效抑制剂量(ID50)及95%的可信区间。使用Isobolographic 分析评价药物的相互作用。【结果】 鞘内单独注射阿米洛利( ～ 100 μg)和替扎尼定( ～ 5 μg)可产生剂量依赖性的抗急性及慢性炎症性疼痛的作用。鞘内阿米洛利和替扎尼定混合，可以产生明显的协同效应。鞘内育亨宾预处理可以拮抗鞘内阿米洛利、替扎尼定及阿米洛利混合替扎尼定的抗炎症性疼痛的作用。【结论】 鞘内单独注射阿米洛利、替扎尼定可以产生明显的剂量依赖性的抗急性及慢性炎症性疼痛的作用。鞘内注射阿米洛利可以增强替扎尼定的抗炎症性疼痛的作用。鞘内注射阿米洛利产生的抗炎症性疼痛的作用可能与中枢?琢2-肾上腺素受体有关。
【关键词】 椎管内镇痛; 炎症性疼痛; 阿米洛利; 替扎尼定; 协同作用
　Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of intrathecal amiloride and its interaction with tizanidine on the treatment of inflammatory pain in a rat model. 【Methods】 Ninety-six male SD rats (250 ～ 300 g) were randomly divided into sixteen groups (n = 6)： control group; amiloride group; tizanidine group; amiloride + tizanidine group; and yohimbine group. Seven days after IT catheter placement， 50 μL of 5% formalin was injected subcutaneously into the dorsal surface of the right hindpaw using 27-gauge needle. Pain-related behavior was quantified by counting the number of flinches. Inhibitory effect (ID50) values and 95% confidence intervals were calculated. Isobolographic analysis of the amiloride and tizanidine interaction was conducted. 【Result】 Intrathecal amiloride ( ～ 100 μg) or tizanidine ( ～ 5 μg) alone produced dose-dependent treatment effect of acute and chronical inflammatory pain. Intrathecal mixtures (tizanidine + amiloride) produced dose-dependent treatment effect of acute and chronic inflammatory pain. Intrathecal pretreatment with yohimbine antagonized the treatment effect of amiloride， tizanidine and the combination of amiloride and tizanidine. 【Conclusion】 Intrathecal amiloride and tizanidine alone produced dose-dependent treatment effect of inflammatory pain. The enhancing effects were found between intrathecal amiloride and tizanidine. The treatment effect of inflammatory pain produced by intrathecal amiloride may due to ?琢2-adrenoceptor in the spinal.
　　炎症可分为感染引起的炎症和无菌性炎症，感染性炎症疼痛经抗感染治疗后基本可消除，而无菌性炎症所导致的疼痛，临床上广泛存在，比如风湿性关节痛、类风湿性关节痛、颈椎病、肩周炎等等，在临床上尚无特效的治疗药物和治疗方法。由于单一的用药存在各种各样的不良反应，比如：口服非甾体类解热镇痛药，对症治疗，可消除局部炎症，减轻疼痛，长期服用胃肠道不良反应大;糖皮质激素，可消除局部的炎症浸润，减少炎症介质的分泌，从而减轻疼痛，但是激素治疗的不良反应大，不能长期应用。因此，急需寻找新的、安全有效的抗炎症性疼痛的药物及联合治疗方法，此已成为广大麻醉工作者和药理学者研究的焦点。保钾利尿剂阿米洛利，具有抑制细胞膜上的Na+ 通道和Ca2+ 通道，以及抑制Na+，K+-ATP酶和Na+-H+ 交换等作用。我们前期的动物实验研究发现，鞘内阿米洛利产生抗神经病理性疼痛的作用[1]，以及鞘内α2-肾上腺受体激动剂产生抗炎症痛作用。本研究探讨大鼠鞘内阿米洛利及混合替扎尼定是否具有抗炎症性疼痛的作用。
　　1 材料与方法
　　实验动物、药品选择及分组
　　雄性SD大鼠(250 ～ 300 g)由中山大学动物中心提供，大鼠随机分为16组(n = 6)：对照组(生理盐水)，阿米洛利组(、25、50、100 μg)、替扎尼定组(、1、、5 μg)、混合药物组为1/2、1/4、1/8、1/16(阿米洛利ID50 + 替扎尼定ID50)，分别是阿米洛利50 μg + 替扎尼定2 μg、阿米洛利25 μg + 替扎尼定1 μg、阿米洛利 μg + 替扎尼定 μg、阿米洛利 μg+替扎尼定 μg)、拮抗组(育亨宾20 μg + 替扎尼定5 μg、育亨宾20 μg + 阿米洛利100 μg、育亨宾20 μg + 阿米洛利50 μg + 替扎尼定2 μg)。
　　鞘内置管
　　采用Zeng等的方法。腹腔注射100 mL/L水合氯醛 ( mL/kg)麻醉，在枕骨大孔上方暴露寰枕膜，用针尖挑破寰枕膜后将充满生理盐水的PE-10导管向尾段置入 ～　cm，至脊髓腰骶段。用20 mL/L利多卡因(10 μL)注入PE管来判断导管位置(如注射后30 s内大鼠出现双后肢麻痹现象说明导管位置正确)，每次注药后均用10 μL生理盐水冲洗PE管。大鼠苏醒后24 h观察其活动情况，剔除出现运动功能障碍的大鼠。术后常规使用抗生素，自然照明，自由饮水和摄食。
　　药物实验
　　实验药物为Sigma产品(St Louis，USA)。所有药物于实验前用生理盐水溶解，配成10 μL 溶液。在鞘内分别注射：阿米洛利，替扎尼定，阿米洛利与替扎尼定不同浓度比例混合，生理盐水(20 μL)。拮抗组在鞘内注射阿米洛利100 μg、替扎尼定5 μg及阿米洛利50 μg + 替扎尼定2 μg前10 min，鞘内注射育亨宾20 μg。所有药物注药后用10 μL的生理盐水冲管。
　　甲醛溶液痛模型的制备
　　鞘内给药10 min后皮下注射20 g/L的多聚甲醛溶液50 μL，注射完甲醛溶液后即将大鼠置于观测装置中，观测装置为30 cm × 30 cm × 20 cm底为细铁丝网的透明塑料箱，箱底另外设置一个倾斜45°的镜子，可从镜子内直接观察大鼠的足底情况。
　　行为学测试
　　伤害行为评定观察：观察记录1 ～ 2 min、5 ～ 6 min(第Ⅰ相)大鼠缩足舔足次数;10 ～ 60 min(第Ⅱ相)内每次间隔5 min，记录每1 min内大鼠缩足舔足次数。1 ～ 10 min为第Ⅰ相，10 ～ 60 min为第Ⅱ相。为计算药物的ED50，采用抗伤害效果评定采用抑制率(Inhibitory degree， ID)表示(实验组与对照组大鼠缩足舔足次数百分数)，在此用ID50表示ED50。
　　实验数据统计方法
　　使用SPSS 统计软件对实验组大鼠注射甲醛溶液后各时段的缩足舔足次数进行对比分析，并进行组间差异的比较：采用单因素方差分析。资料用均数 ± 标准误(x ± SE)表示，P　表示差异有统计学意义。
　　2 结 果
　　对照组注射甲醛溶液后可观察到完整的双相疼痛反应，即注射后即刻出现约3 ～ 5 min的急性疼痛时相(第Ⅰ时相)，中间约5 ～ 10 min静息期，随后出现可持续40 ～ 60 min的继发性疼痛时相(第Ⅱ时相)，静息期注射足可正常行走，无明显疼痛反应。
　　鞘内单独注射阿米洛利( ～ 100 μg)可产生抗急慢性炎症性疼痛的作用，有效抑制率跟剂量呈现明显剂量关系，最大缩足抑制率(ID)为40%(图1)。鞘内单独注射替扎尼定( ～ 5 μg)可产生抗急慢性炎症性疼痛的作用，有效抑制率跟剂量呈现明显剂量关系，最大缩足抑制率(ID)为30%(图2)。鞘内注射混合药物可产生剂量依赖性的抗急性及慢性炎症性疼痛的作用，阿米洛利50 μg + 替扎尼定2 μg即可产生显着的抗炎症性疼痛效果。经等辐射分析法分析显示：Ⅰ相、Ⅱ相TFV　1，鞘内阿米洛利和替扎尼定混合，可以产生明显的协同效应(图3)。育亨宾(20 μg)鞘内预处理，Ⅰ相、Ⅱ相阿米洛利100 μg，替扎尼定5 μg及混合组(阿米洛利50 μg + 替扎尼定2 μg)总的舔足缩足次数较非拮抗组明显增加(P　)，提示育亨宾具有拮抗单独阿米洛利、替扎尼定及混合组(阿米洛利 + 替扎尼定)的抗炎症性疼痛的作用(图4)。
　　3 讨 论
　　甲醛溶液实验是模拟临床急、慢性炎性痛的良好模型，广泛应用于疼痛机制的研究及镇痛药的筛选评价。大鼠后足皮下注射20 g/L多聚甲醛溶液50 μL出现痛反应和随后的痛觉过敏，表现为舔、摇和抬高注射足，对热刺激的耐受性下降，以及注射部位出现红、肿等炎性表现，即引起典型的甲醛溶液疼痛反应，表现为双相性，且两个反应时相的形成机制不同。目前认为局部致炎细胞因子与抗炎细胞因子在炎症性疼痛外周敏感化起着重要的作用因素。大量的致炎因子如TNF-α、白介素-1β和神经营养性因子的释放，这些物质作用于局部的神经纤维或背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)，初级传入神经元的兴奋性增强，引起炎症性疼痛[4-5]。
　　Haddad等发现阿米洛利能阻断促炎性因子IL-1β和TNF-α的产生，增加IL-10的抗炎反应。研究表明T型钙通道在脊髓水平参与了炎症性疼痛的维持[7-8]。Tang等发现阿米洛利能选择性的阻断T型钙通道。本研究结果表明，鞘内注射阿米洛利可以减轻炎症性疼痛大鼠机械性痛敏，其抗炎症性疼痛的作用可能与阻断T型钙通道有关。Leppik等[10]研究表明阿米洛利通过α2-肾上腺受体变构位点，发挥变构激动调节α2-肾上腺受体的作用。在本实验中，我们发现鞘内阿米洛利可以产生剂量依赖性的抗炎症性疼痛的作用，此作用可以被鞘内育亨宾预处理所拮抗。此结果显示，阿米洛利可能通过变构激活α2-肾上腺受体产生抗炎性疼痛的作用。替扎尼定是一种选择性α2-肾上腺素受体激动剂。其抗炎症性疼痛的机制可能与以下有关。
　　(1) α2-肾上腺素受体。α2-肾上腺素受体存在于脊髓后角突触前膜，是一种G蛋白偶联受体，被激活后能部分通过抑制腺苷酸环化酶(cAMP)形成而发挥作用，并通过电压依赖性的钙离子通道降低钙离子的传导，从而使相应的神经元钙通道依赖性的神经递质释放减少，导致此神经元释放的P物质减少。α2-肾上腺素受体激动剂还可以通过激活磷脂酶C第二信使系统和加速神经细胞膜的Na+/H+ 交换导致细胞碱化从而产生抗伤害作用[11]。本研究中鞘内注射替扎尼定可以减轻炎症性疼痛大鼠痛敏，其抗炎症性疼痛的作用可能与此有关。
　　(2) 乙酰胆碱受体。中枢胆碱能神经元在疼痛传导中起重要作用，脊髓内源性乙酰胆碱(acetylcholine， ACh)是疼痛传递的递质。鞘内注射α2-肾上腺素受体激动剂能增加脑脊液和脊髓背角中乙酰胆碱的浓度[12]，并且鞘内注射拟胆碱药物所产生的镇痛作用，可被M型受体拮抗剂所阻断[13]。Pan等[14]研究发现鞘内注射α2-肾上腺素受体激动剂所产生的抗炎症性疼痛的作用取决于其在脊髓水平与M/N型胆碱受体相互作用有关。在炎症性疼痛中，脊髓M型胆碱受体、N型胆碱受体通过一氧化氮在鞘内注射α2-肾上腺素受体激动剂产生的抗炎症性疼痛的作用中起着重要的作用。本研究表明鞘内注射替扎尼定可以减轻炎症性疼痛大鼠痛敏，其抗炎症性疼痛的作用可能与此有关。
　　在我们的研究中发现，鞘内注射阿米洛利可以增强替扎尼定的抗炎症性疼痛的作用，两者混合可以产生协同的抗炎症性疼痛的作用。鞘内育亨宾预处理可以拮抗鞘内单独阿米洛利、替扎尼定以及阿米洛利混合替扎尼定的抗炎症性疼痛的作用。Berebaum[15]认为作用于不同位点的药物可以通过共同的作用通道从而产生协同作用。如前所述，阿米洛利混合替扎尼定鞘内注射，两者抗炎性疼痛方面产生显着的协同作用，其协同作用能够被鞘内预注α2-受体拮抗剂育亨宾所拮抗，表明阿米洛利和替扎尼定通过共同作用通路，此外，研究表明激活α2-肾上腺素受体可以抑制钙离子通道[16-17]。目前发现钙离子通道参与了炎症性疼痛的形成和维持。鞘内单独注射阿米洛利或替扎尼定一方面可以通过直接激活α2-肾上腺素受体产生抗炎症性疼痛的作用，另一方面可以通过激活α2-肾上腺素受体进而抑制钙离子通道，从而抑制炎症性疼痛的形成和维持。
　　结论：鞘内单独注射阿米洛利、替扎尼定可以产生明显的剂量依赖性的抗急性及慢性炎症性疼痛的作用。鞘内注射阿米洛利可以增强替扎尼定的抗炎症性疼痛的作用。
【参考文献】
　　陈祥楠，邢 蔚，曾维安，等. 大鼠鞘内阿米洛利及混合可乐定对神经病理性疼痛的作用 [J]. 中山大学学报：医学科学版，2008，29(3)：274-277.
　　李 强，欧阳汉栋，何伟雄，等. 七叶皂苷和可乐定在大鼠鞘内注射的协同抗炎症痛作用 [J]. 中山大学学报：医学科学版，2009，30(6)：666-670.
　　Zeng W， Dohi S， Shimonaka H， et al. Spinal antinociceptive action of Na+-K+ pump inhibitor ouabain and its interaction with morphine and lidocaine in rats[J]. Anesthesiology， 1999， 90(2)： 500-508.
　　Campana WM， Li X， Shubayev VI， et al. Erythropoietin reduces Schwann cell TNF-alpha， Wallerian degeneration and pain-related behaviors after peripheral nerve injury[J]. Eur J Neurosci， 2006， 23(3)： 617-626.
　　Ruohonen S， Khademi M， Jagodic M， et al. Cytokine responses during chronic denervation[J]. J Neuroinflammation， 2005， 2： 26.
　　Haddad JJ， Land SC. Amiloride blockades lipopolysaccharide-induced proinflammatory cytokine biosynthesis in an I kappa B-alpha/ NF-kappa B- dependent mechanism. Evidence for the amplification of an antiinflammatory pathway in the alveolar epithelium[J]. Am J Respir Cell Mol Biol， 2002， 26(1)： 114-126.
　　陈志新，曾因明，王俊科，等. T型钙通道在大鼠炎症性疼痛维持中的作用 [J]. 中华麻醉学杂志，2006，26(1)：68-70.
　　Dogrul A， Gardell LR， Ossipov MH， et al. Reversal of experimental neuropathic pain by T-type calcium channel blockers [J]. Pain， 2003， 105(1-2)： 159-168.
　　Tang CM， Presser F， Morad M. Amiloride selectively blocks the low threshold (T) calcium channel[J]. Science， 1988， 240(4849)： 213-215.
　　Leppik RA， Birdsall NJ. Agonist binding and function at the human alpha (2A)-adrenoceptor： allosteric modulation by amilorides [J]. Mol Pharmacol， 2000， 58(5)： 1091-1099.
　　Childers MK. How alpha2 adrenergic agonists relieve pain//Use of alpha2 adrenergic agonists in pain management [M]. Columbia： Academic Information Systems Inc， 2001： 13-27.
　　Xu Z， Tong C， Pan HL， et al. Intravenous morphine increases release of nitric oxide from spinal cord by an alpha-adrenergic and cholinergic mechanism[J]. J Neurophysiol， 1997， 78(4)： 2072-2078.
　　Naguib M， Yaksh TL. Antinociceptive effects of spinal cholinesterase inhibition and isobolographic analysis of the interaction with mu and alpha2 receptor system [J]. Anesthesiology， 1994， 80(6)： 1338-1348.
　　Pan HL， Chen SR， Eisenach JC. Intrathecal clonidine alleviates allodynia in neuropathic rats： interaction with spinal muscarinic and nicotinic receptors[J]. Anesthesiology， 1999， 90(2)： 509-514.
　　Berenbaum MC. What is synergy? [J]. Pharmacol Rev， 1989， 41(2)： 93-141.
　　Diverse-Pierluissi M， Inglese J， Stoffel RH， et al. G protein-coupled receptor kinase mediates desensitization of norepinephrine-induced Ca2+ channel inhibition[J]. Neuron， 1996， 16(3)： 579-585.
　　Honma Y， Yamakage M， Ninomiya T. Effects of adrenergic stimulus on the activities of Ca2+ and K+ channels of dorsal root ganglion neurons in a neuropathic pain model [J]. Brain Res， 1999， 832(1-2)： 195-206.