QTRAP培训班D3.pdf

02/20/20102010 ASC1基础应用培训培训日程第三天第三天上午上午9:00-下午下午4:009:00-10:30，定量分析思路与成功液质分析的经验10:30-10:40，茶歇，茶歇10:40-11:30 Analyst软件的使用（电脑模拟演示）常用Script功能简介 Analyst软件的使用（电脑模拟演示）计算器、数据库功能及其他问题解答12:00-1:30，工作午餐，工作午餐1:30-4:00，实验操作练习 定量方法建立的基本流程成功定量分析的经验与体会02/20/20102010 ASC3基础应用培训 了解被分析物的基本信息，分子量、溶剂、分子极性等 了解被分析体系的色谱分析条件：等度/梯度分离、色谱柱与流动相类型等 了解化合物提取方法 溶剂包括水的纯度，最好色谱纯以上 新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净,某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中，用溶剂清洗 质谱仪须校准，预热时间要足够长，气流的稳定也很重要，液N2阀开度要注意，达到稳定程度查阅文献：02/20/20102010 ASC4基础应用培训首先，确定离子化方式：ESI or APCI，Pos or Neg标准溶液进样，Q1 Scan 察看存在哪些离子，要能够看到待测的母离子，应明显比周围的噪声离子高，通过改变DP，观察离子的增减，若为Pos方式，看M+1，M+18，M+23等等，初步判断分子离子，如看不到则可能是浓度太低或离子化方式不合适，或选择的溶剂体系不合适母离子选M+H，或M-H最好，但有时只有M+NH4，M+Na等，这样CAD能量可能需要高些，选择M+H+，还是+NH4，+Na等，要由化合物决定。加合离子若稳定，则可用，不稳定则可能需换流动相，但+H通常好些，所需碰撞能量低，灵敏度高；如含Cl可选择2个母离子峰MS条件优化先定性后定量02/20/20102010 ASC5基础应用培训MS条件优化先定性后定量（续）再根据上一步确定的母离子进行Product Scan，确保所有碎片离子都来自待测化合物，而不是溶液中的杂质，找出较强的碎片离子信息。还可改变CE，从中选定MRM需要测定的一对或更多离子对，为最后LC-MS/MS联用做准备做Product Scan时，注意小数点后的位数，MRM输入要准，灵敏度才高先多选几个离子对，待出现基质干扰时可换，最后根据法规要求确定离子对数目MRM方式优化仪器，通过优化仪器参数，使MRM灵敏度最高。只检测一对离子时根据TIC的强度来确定仪器参数，一次优化多对离子时，要根据每对离子的XIC强度来分别确定仪器参数02/20/20102010 ASC6基础应用培训MS条件优化先定性后定量（续）先用注射泵优化Compound项下的参数，如DP、CE及CXP等，再接通LC，用FIA优化其他参数如温度，气流和IS电压及离子源位置，或接一个三通，样品仍由注射泵进入离子源，同时LC保持需要的流量，然后进行MRM测定。分辨率的选择：当样品较纯，Q3可选Low，提高灵敏度，若选Low后本底噪声太高则意义不大。02/20/20102010 ASC7基础应用培训 色谱柱长度可根据分离的要求而定，定量分析在能有效排除离子抑制干扰情况下尽量短，以提高效率 注意流速大小应与色谱柱内径大小相匹配 不同牌号色谱柱，效果很可能不同 pH的影响：正离子方式pH要低些，负离子方式pH要高些，除对离子化有影响外，还影响LC的峰形，以至定量误差。流动相添加微量的乙酸铵可以增加体系离子强度，对大部分的测定有利，浓度一般控制在25mmol/LLC条件优化02/20/20102010 ASC8基础应用培训LC条件优化（续）用流动相配的标样，初步优化确定LC条件是否合适标准品工作液现配现做，尤其是较低浓度，时间长了可能因吸附分解等降低进样顺序要先稀后浓洗针液要常换，进过浓样后要进12针空白，检验是否有残留污染顺序：纯样-添加样-实际样品 流动相液优化后，空白提取液配制标准再优化，考察干扰情况；空白添加再提取，考察回收率 用空白提取液配制标准品，或在空白样品中加入标准品进行提取，制做标准工作曲线，可以有效排除样品前处理过程的干扰因素02/20/20102010 ASC9基础应用培训前处理方法的优化LC、MS参数都优化过，还是不行，需更换样品提取方法离子抑制：改变前处理方法或LC条件内标选择原则：分析药代实验数据时多采用内标，尽量选择待测物的同系物作为内标，最好使用稳定同位素标记化合物做内标。内标物与被测物的化学性质有区别时，要注意干扰基质可能对他们的离子化效率影响程度不同衍生化：有时有助于得到加强且稳定的信号，例如硝基呋喃类，衍生化后分子量增加，同时碱性增加，提高离子化效率而容易测定；体内氨基酸的分析也存在类似情况，用正丁醇酯化后，灵敏度会大大提高02/20/20102010 ASC10基础应用培训 最低检出限，信噪比3:1，定量限10:1 同一物质几对离子的比例应相对恒定，误差不超过15%，峰面积比峰高准确 当浓度低，信号弱，自动积分不准时可对峰面积手动积分 平滑次数与峰宽因子、保留时间等设置都会影响积分值数据处理02/20/20102010 ASC11基础应用培训LC-MS 联用的方法开发 质谱条件的优化 色谱条件的优化 样品预处理的优化影响LC/MS联用的主要因素 样品结构和性质 气流和温度 合适的电压 流动相的组成 流速的影响 色谱柱温度、直径 等度还是梯度 杂质的影响02/20/20102010 ASC12基础应用培训离子源的选择-ESI优点 适合范围广:分析离子型/极性化合物、难挥发或热不稳定性化合物多电荷离子的形成，可以分析高分子量化合物 灵敏度高缺点 在溶液中必须形成离子 流动相中缓冲盐的种类和浓度对灵敏度均有显著影响，因此流动相的选择非常重要 具有流速依赖性 基质抑制现象较为明显 放电现象02/20/20102010 ASC13基础应用培训适合于ESI分析的化合物(食品安全分析)正离子模式分析样品 碱性或含碱性基团的化合物 碱性杀虫剂 硝基呋喃 孔雀石绿/隐性孔雀石绿 偶氮染料 三嗪类除草剂 丙烯酰胺 氨基甲酸酯 真菌毒素 有机磷杀虫剂 苯基脲类(Phenyl Urea)除草剂02/20/20102010 ASC14基础应用培训负离子模式分析样品 酸性或含酸性基团的化合物 酸性杀虫剂 氯霉素 偶氮染料-Orange II 真菌毒素 全氟辛酸盐（PFOA）及全氟辛烷磺酸盐（PFOS）等水中残留的表面活性剂适合于ESI分析的化合物(食品安全分析)ESI 可分析食品安全的样品种类可分析食品安全的样品种类 80%02/20/20102010 ASC15基础应用培训离子源的选择-APCI优点 有一定挥发性的中等极性或低极性的小分子化合物 对溶剂选择、流速和添加物的依赖性较小缺点 有可能发生热裂解 样品需要有一定的挥发性 适合分析分子量小于2000 Da 的样品02/20/20102010 ASC16基础应用培训 多环芳烃类化合物 甾体类化合物(类固醇)激素类 阻燃剂 兴奋剂(-受体拮抗剂)适合于APCI分析的化合物(食品安全分析)02/20/20102010 ASC17基础应用培训参数优化喷针位置通常高于导管0.5至1mm根据流动相的比例和流速大小优化参数，高含水比例的流动相需要更高的温度和气流，离子源温度太低时易形成溶剂簇离子气帘气在不影响灵敏度的前提下可设定较高值，以保障仪器的抗污染及方法的重现性02/20/20102010 ASC18基础应用培训参数优化02/20/20102010 ASC19基础应用培训M+H+,M+Na+,2M+H+,2M+Na+221.150100150200250300350400450500m/z020406080100Relative Abundance463.1441.2439.2322.2 360.5213.890.3145.0243.24,7-二甲氧基二甲氧基-5-甲基香豆素甲基香豆素(MW 220)加合离子加合离子尝试调节流动相尝试调节流动相(pH,缓冲盐缓冲盐)降低加合现象，定量首选降低加合现象，定量首选M+H+，如果加合离子信号高且稳定，也可使用，如果加合离子信号高且稳定，也可使用02/20/20102010 ASC20基础应用培训常见的加合离子正离子方式常出现如下离子:-Na 22 Da.higher than M+H-K 38 Da.higher than M+H-Li 9 Da.higher than M+H-NH4 17 Da.higher than M+H-ACN 40 Da.higher than M+H 2M+H,2M+Na等负离子方式常出现如下离子:-TFA 114 Da.higher than M-H(113 and 227 background)-Acetate 60 Da.higher than M-H-Formic 46 Da.higher than M-H-Cl 36 Da.higher than M-H02/20/20102010 ASC21基础应用培训LC-MS中常见的本底离子m/z 15-150,溶剂离子，(H2O)nH+，n=3-112 m/z 102,H+乙腈+乙酸,C4H7NO2H+,102.0549m/z 149,管路中邻苯二甲酸酯的酸酐,C8H4O3H+,149.0233m/z 288,2mm 离心管的产生的特征离子m/z 279,管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+,279.1591m/z 316,2mm 离心管的产生的特征离子m/z 384,瓶的光稳定剂产生的离子m/z 391,管路中邻苯二甲酸二辛酯,C24H38O4H+,391.2843m/z 538,乙酸+氧+铁（喷雾管）,Fe3O(O2CCH3)6,537.879302/20/20102010 ASC22基础应用培训LC-MS 联用的方法开发质谱条件的优化色谱条件的优化样品预处理的优化影响LC/MS联用的主要因素离子源的选择正/负离子模式APCI/ESI的优缺点及应用喷针位置的优化方法优化最佳样品浓度气流和温度参数DP电压优化原则几种常见的离子02/20/20102010 ASC23基础应用培训 串联质谱具有高选择性，为什么需要液相分离串联质谱具有高选择性，为什么需要液相分离 离子化过程中的离子化过程中的基质效应基质效应 基质物质与分析物共同流出喷雾针时，可影响待分析物的雾化、挥发、裂分、化学反应及带电过程，导致进入质谱的离子减少（离子抑制）或增多（离子增强），从而影响定量结果的可靠性和准确性，以及方法的重现性及线性基质物质与分析物共同流出喷雾针时，可影响待分析物的雾化、挥发、裂分、化学反应及带电过程，导致进入质谱的离子减少（离子抑制）或增多（离子增强），从而影响定量结果的可靠性和准确性，以及方法的重现性及线性 改善线性和准确性改善线性和准确性 提高灵敏度提高灵敏度 更好的专属性更好的专属性为什么需要液相分离02/20/20102010 ASC24基础应用培训色谱条件的优化流动相流动相?有机相的选择，甲醇有机相的选择，甲醇/乙腈乙腈?缓冲盐的选择，在缓冲盐的选择，在ESI正离子模式下铵盐的浓度在正离子模式下铵盐的浓度在2-10mmol/L，在负离子模式下为，在负离子模式下为2-50mmol/L。酸性添加剂的浓度为。酸性添加剂的浓度为0.1-0.5%，三氟乙酸浓度低于，三氟乙酸浓度低于0.01%?pH的选择，正离子模式加酸降低的选择，正离子模式加酸降低pH值，负离子模式加碱提高值，负离子模式加碱提高pH值值,不仅仅对灵敏度有影响不仅仅对灵敏度有影响,同时同时pH的调节对色谱峰峰型的调节对色谱峰峰型,以及方法的重现性均有一定的影响以及方法的重现性均有一定的影响?有机相与水相比例的选择有机相与水相比例的选择02/20/20102010 ASC25基础应用培训色谱条件的优化?流速 API2000/3000：APCI，0.1 to 2 mL/min，最优化流速1 mL/min；ESI，10 to 2mL/min，最优化流速200 500l/min API3200/4000,APCI,0.1 to 3mL/min,最优化流速1 mL/min；ESI，10 to 3mL/min，最优化流速200 500L/min辅助气，确保辅助气，确保辅助气，确保辅助气，确保离子化效率离子化效率离子化效率离子化效率02/20/20102010 ASC26基础应用培训?色谱柱的选择色谱柱的选择通常来说低的色谱柱内径在相同流速下可以获得更窄的峰宽更高的灵敏度更短的分析时间，然而内径大的色谱柱可以提供高流速及大上样量的分析，分析寿命优于低内径色谱柱通常来说低的色谱柱内径在相同流速下可以获得更窄的峰宽更高的灵敏度更短的分析时间，然而内径大的色谱柱可以提供高流速及大上样量的分析，分析寿命优于低内径色谱柱Column I.d.(mm)Flow rate Capillary 10 l/min1.0 40-50 l/min2.1 0.1-0.5 ml/min3.0 0.5 ml/min4.6 1.0 ml/min色谱条件的优化02/20/20102010 ASC27基础应用培训?色谱柱类型色谱柱类型根据化合物性质进行选择，疏水性根据化合物性质进行选择，疏水性/亲水性亲水性,pKa 或者是否成盐或者是否成盐?疏水性化合物疏水性化合物:C18柱柱?弱疏水性化合物弱疏水性化合物:C8，C4柱柱?芳香族化合物芳香族化合物:苯基柱苯基柱?极性化合物极性化合物:氰丙基柱氰丙基柱色谱条件的优化?梯度的运用梯度的运用改善峰型，减小分离时间，样品净化改善峰型，减小分离时间，样品净化02/20/20102010 ASC28基础应用培训LC-MS 联用的方法开发 质谱条件的优化 色谱条件的优化 样品预处理的优化影响LC/MS联用的主要因素 样品结构和性质 气流和温度 合适的电压 流动相的组成 流速的影响 色谱柱温度、直径 等度还是梯度 杂质的影响02/20/20102010 ASC29基础应用培训样品预处理消除样品中的基质物质消除样品中的基质物质减少离子抑制减少离子抑制提高样品利用率提高样品利用率A 什么基质什么基质B样品结构与性质样品结构与性质C选择合适的样品预处理方法选择合适的样品预处理方法02/20/20102010 ASC30基础应用培训通常基质包含：盐类、脂质类，蛋白质类、细胞组成物质通常基质包含：盐类、脂质类，蛋白质类、细胞组成物质样品预处理02/20/20102010 ASC31基础应用培训常用方法常用方法 直接进样直接进样 蛋白沉淀蛋白沉淀 超滤超滤 液液提取液液提取 固相萃取固相萃取 通过样品的结构，推测样品在各通过样品的结构，推测样品在各pH范围内是以离子状态还是中性分子状态存在于溶液中，以及有可能的化学反应范围内是以离子状态还是中性分子状态存在于溶液中，以及有可能的化学反应NHCOOH CH3ONHOOC样品预处理02/20/20102010 ASC32基础应用培训样品预处理02/20/20102010 ASC33基础应用培训?沉淀蛋白法沉淀蛋白法样品预处理02/20/20102010 ASC34基础应用培训?液液提取液液提取样品预处理02/20/20102010 ASC35基础应用培训Matrix effects-基质效应 通常来说，基质效应是由于与被分析物一起流出的其它内源性物质造成的（例如：盐类、胺类、脂肪酸、甘油酸酯等）。这些物质与分析物共同流出喷雾针可影响待分析物的雾化、挥发、裂分、化学反应及带电过程，导致进入质谱的离子减少（离子抑制）或增多（离子增强），从而影响定量结果的可靠性和准确性。02/20/20102010 ASC36基础应用培训解决方案 内标选择 首选：同位素内标（色谱行为、质谱规律、提取性质）；次选：结构类似物 色谱分离（与内源性物质分离，内标和分析物保留时间尽量一致，尝试不同的色谱柱，不同的流动相有机相、缓冲盐、有机相比例，改变洗脱方式）提取条件（降低内源性物质提取率，液液萃取，固相萃取，沉淀蛋白法）质谱优化 离子源的选择（APPI,APCI,ESI）；检测方式（正/负）；其它参数02/20/20102010 ASC37基础应用培训怎样判定基质效应 峰面积比较法 待分析物标准溶液加入空白基质提取物中，在同一色谱条件下与同浓度的标准溶液产生信号相应值相比较 优点：能明确表示出待分析物基质效应的程 缺点：费时方法提取后信号面积标准溶液信号面积离子抑制率(%)正己烷液-液提取6390858026再次提取902085800C18固相提取6090103124102/20/20102010 ASC38基础应用培训怎样判定基质效应 稀释法 将样品成倍稀释后所得峰面积与原峰面积比，由于存在基质效应，二者的峰面积比例不符合其稀释倍数，由此可判定是否存在基质效应及其程度。通常，我们发现峰面积下降比例低于稀释倍数，因此，在灵敏度足够的情况下，该方法可用于消除/减少基质效应！结束