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浅论对培美曲塞耐药胰腺癌Patu8988细胞株克隆、侵袭能力及相关耐药基因的研究
【摘要】 　　目的：探讨对培美曲塞耐药的胰腺癌Patu8988细胞株相对于亲本株在细胞克隆、侵袭能力及多药耐药相关蛋白1(MDR1)、ABC多药转运蛋白G家族成员2(ABCG2)、ABC多药转运蛋白C家族成员3(ABCC3)耐药基因的变化。方法：采用双层软琼脂克隆实验分别在无药及加入500 μmol·L-1培美曲塞的环境下测定胰腺癌Patu8988耐药株及亲本株克隆生成能力的改变；采用Transwell侵袭小室检测两种条件下胰腺癌Patu8988侵袭能力的差异；采用RTPCR法检测胰腺癌Patu8988细胞MDR1、ABCG2、ABCC3的mRNA表达水平,Wersten blot检测ABCG2和ABCC3的蛋白表达水平,免疫荧光及激光共聚焦检测ABCG2的表达及分布。结果：在无药及加入500 μmol·L-1培美曲塞的环境下,对培美曲塞耐药胰腺癌Patu8988细胞株的增殖克隆能力均与其亲本株有差异(P＜),而两种培养条件下胰腺癌Patu8988细胞株的侵袭能力变化差异无统计学意义(P＞)。RTPCR检测显示,在耐药株中ABCG2、ABCC3 mRNA表达分别是其亲本株的倍和倍左右,而MDR1 mRNA表达仅提高到倍；Werstenblot结果显示蛋白表达为其亲本株的倍和倍。免疫荧光检测结果显示,耐药株中ABCG2的荧光强度较强,而其亲本株细胞较弱。激光共聚焦显示，耐药株中ABCG2表达主要分布于细胞膜，细胞质内也有少量分布。结论：相对于亲本株，对培美曲塞耐药的胰腺癌Patu8988细胞株克隆能力加强,而侵袭能力无明显改变。多药耐药基因表达均有不同程度的提高,以ABCG2基因表达提高尤为明显,而且其在耐药株中主要分布在细胞膜,细胞质内也有分布。
【关键词】 胰腺肿瘤； 获得性耐药； 培美曲塞； ABC多药转运蛋白G家族成员2
　　［Abstract］ Objective:To investigate the cloning capability,invasion and associated multidrug resistance genes:MDR1(Pgp),ABCG2,ABCC3 of Patu8988 human pancreatic cancer cells resistance to the pemetrexed compared with it′s parental :The cloning capability of Patu8988 human pancreatic cancer and it′s parental strain were detected in condition free or adding 500 μmol·L-1 pemetrexed by soft agar cloning　invasion ability betweent them were detected by transwell invasion　mRNA expression of MDR1,ABCG2 and ABCC3 were determined by RTPCR,ABCG2 and ABCC3 protein expression levels were detected by Wersten blot,the expression and distribution of ABCG2 were detected by immunofluorescence and laser scanning confocal :The cloning capability between drugfree and adding 500 μmol·L-1 pemetrexed was significantly different(P＜),whereas there was no significant changes of the invasion ability between them(P＞).RTPCR and Wersten blot showed the mRNA and protein levels of ABCG2,ABCC3 were almost 250% and 150% in the drugresistant cells than their parental cells, while the expression of MDR1 mRNA increased only 20%.Immunofluorescence showed drugresistant cells of ABCG2 stronger fluorescence intensity than their parental　confocal detection of drugresistant cells showed ABCG2 expression was mainly distributed in the cell membrane,also a small amount of the :The cloning capability is significantly different between Patu8988 human paucreatic cancer cells resistance to the pemetrexed and it′s parental strain, whereas invasion ability is no　is particularly increase than other multidrug resistance genes and it is mainly distributed in the cell membrane and distribution．
　　［Key words］ pancreatic neoplasms； acquired resistance； pemetrexed； ABCG2

　　本实验室前期通过体外多次大剂量冲击诱导法成功诱导出对培美曲塞耐药的胰腺癌Patu8988细胞株［1］(IC50=倍),通过Affymetrix基因芯片比对分析发现某些与耐药相关基因的变化。本研究旨在鉴定对培美曲塞耐药的胰腺癌Patu8988细胞株生物学行为的改变,并验证相关耐药基因的变化,为下步针对相关耐药基因的逆转措施提供实验室前提保障。

　　1 材料与方法

　　材料

　　胰腺癌Patu8988细胞株及其经培美曲塞诱导产生的耐药细胞株由东南大学医学院中心实验室提供。主要试剂:高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰酶等购自Gibcol公司,培美曲塞为法国礼来公司产品(批号：A512938H)。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Takala RTPCR试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司产品。Wersten blot相关试剂为海门碧云天公司产品。ABC多药转运蛋白G家族成员2(ABCG2)、ABC多药转运蛋白C家族成员3(ABCC3)、βactin一抗为Santa Cruz产品,HRP(辣根酶)标记二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司,异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记二抗为美国KLP公司产品。主要大型仪器：德国Eppendorf公司梯度PCR扩增仪,美国Pharmacia公司VDS型凝胶自动成像仪,日本Olympus公司MF51倒置荧光显微镜,德国Leica公司TCS SP5激光共聚焦显微镜。

　　方法
　　胰腺癌细胞体外培养
　　胰腺癌Patu8988细胞亲本株及耐药细胞株分别置入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液中,常规培养于37 ℃、体积分数为5％的CO2培养箱中,细胞单层贴壁生长,至70％～80％融合时胰蛋白酶消化传代。
　　双层软琼脂克隆实验
　　亲本株和耐药株培养至80%融合后胰酶消化传代,分别加入两块6孔培养板中,设3复孔。第一块板每孔加入2 ml含%软琼脂和10%胎牛血清的DMEM培养基,待凝固后,在其上加入2 ml含3×103个细胞及%软琼脂的含血清培养液；第二块板除同上处理外,在上层琼脂细胞混合液中另加入培美曲塞(终浓度为500 μmol·L-1),待凝固后放入37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱21 d后,将含有50个以上细胞的集落判定为一个克隆,每个孔随机选5个视野(×100倍),计算细胞克隆形成数。实验重复3次。
　　Transwell小室侵袭实验
　　亲本株和耐药株细胞培养至70%～80%融合后胰酶消化传代,调整细胞密度为2×108个·L-1,将500 μl细胞悬液加入预先铺好Matrigel基质胶及FN的Transwell小室,6孔板下室加入2 ml完全培养基培养24 h。95%乙醇固定细胞20 min,以%结晶紫溶液行细胞染色，倒置显微镜下计数移到膜下层的细胞,每张膜分别计数5个随机视野(×250倍)的穿膜细胞,计算平均数。每组实验重复3次。
　　RTPCR法检测ABCG2、ABCC3、MDR1的RNA表达
　　分别收集亲本株和耐药株人胰腺癌Patu8988细胞约5×106个,按RNA抽提试剂盒说明提取细胞总RNA,采用两步法进行RTPCR,测定ABCG2、ABCC3、MDR1 mRNA的表达。引物序列、扩增产物片段大小、退火温度及循环数见表1。PCR完成表1 ABCG2、ABCC3和MDR1的RNA引物
　　Western blot检测ABCG2、ABCC3蛋白的表达
　　分别收集亲本株和耐药株胰腺癌Patu8988细胞约5×106个,加入裂解液提取蛋白,BCA法测定蛋白浓度。取等体积的蛋白样品与电泳上样液混合后高温水浴处理10 min,行10％SDSPAGE,分离蛋白,采用半干转法转移蛋白至膜上,室温封闭2 h后,用TBST漂洗3次,分别加入一抗(小鼠抗人ABCG2单克隆抗体1∶400稀释,小鼠抗人ABCC3单克隆抗体1∶300稀释，小鼠抗人βactin抗体1∶400稀释)4 ℃反应过夜,TBST漂洗3次后,加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000稀释),室温摇床反应2 h,ECL显色、X线胶片曝光,以Quantity One图像分析软件进行分析。
　　免疫荧光及激光共聚焦检测ABCG2的表达及分布
　　(1) 免疫荧光检测。亲本株和耐药株细胞在24孔板中培养至70%～80%融合后,以4%多聚甲醛固定,室温下静置30 min；PBS洗涤后加入% Triton X100，室温下作用10 min；PBS洗涤后加入封闭血清室温下作用30 min；加入小鼠抗人ABCG2,1∶100一抗稀释液50 μl,置湿盒内4 ℃过夜；PBS漂洗后加FITC标记的二抗(山羊抗小鼠),置避光湿盒内室温下1 h；PBS漂洗,荧光显微镜下在同一光线强度照相观察、成像。(2) 激光共聚焦检测。耐药株细胞在铺盖玻片的6孔板中培养至70%～80%融合后,取出盖玻片,4%多聚甲醛固定,室温下静置30 min；PBS洗涤后加入% Triton X100室温下作用10 min；PBS洗涤后加入封闭血清室温下作用30 min；加入小鼠抗人ABCG2,1∶100一抗稀释液50 μl,置湿盒内4 ℃过夜；PBS漂洗后加FITC标记的二抗(山羊抗小鼠),置避光湿盒内室温下1 h；PBS漂洗后滴加DAPI,室温下暗处10 min；PBS漂洗后加入抗荧光淬灭剂封片；激光扫描共聚焦显微镜观察、成像。

　　统计学处理

　　数据以x-±s表示,采用SPSS 统计软件进行数据分析,配对资料采用t检验,P＜表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　胰腺癌Patu8988亲本株和耐药株的双层软琼脂克隆能力的差异
　　21 d后显微镜下每视野(×100倍)计数克隆形成数：在未加药组中亲本株和耐药株平均每视野克隆平均计数分别为(±)个和(±)个(P＜)；在加药组中亲本株和耐药株平均每视野克隆数分别为(±)个和(±)个(P＜)。说明耐药株相对于其亲本株细胞在两种环境下克隆能力均增强(见图1、2)。

　　Transwell实验检测胰腺癌Patu8988亲本株和耐药株的侵袭能力
　　24 h后显微镜下每视野(×250倍)亲本株和耐药株穿孔细胞平均数分别为(±)个和(±)个,两者侵袭能力差异无统计学意义(P＞)(图3、4)。

　　RTPCR法检测人胰腺癌Patu8988亲本株和耐药株ABCG2、ABCC3、MDR1的mRNA表达
　　ABCG2、ABCC3的mRNA表达在耐药株中明显升高,经Quantity One灰度软件测定分别是其亲本株的和倍,而MDR1升高不如前二者,仅为其亲本株的倍(图5)。
　　Western blot检测ABCG2、ABCC3蛋白的表达

　　亲本株与耐药株中ABCG2、ABCC3的蛋白表达水平与RTPCR结果吻合,在耐药株中明显升高,经Quantity One灰度软件测定,耐药株蛋白表达分别为其亲本株的和倍(图6)。

　　免疫荧光及激光共聚焦检测

　　亲本株及耐药株中均表达ABCG2蛋白,主要分布于细胞膜,细胞质中也有分布,与亲本株相比,ABCG2在耐药株中荧光强度高，表达量多(图7、8，见封三)。

　　3 讨论

　　胰腺癌对化疗不敏感除了与胰腺癌组织伴有大量纤维组织增生以及血胰屏障阻止化疗药物进入胰腺癌细胞有关外,肿瘤细胞对化疗药物的耐药现象也是化疗过程中的巨大障碍。尽管新化疗药不断出现,但胰腺癌化疗预后仍差,原因在于肿瘤细胞在化疗过程中发生多药耐药。如何提高胰腺癌化疗的疗效成为延长胰腺癌患者生存期、提高其生活质量亟待解决的问题。

　　培美曲塞(pemetrexed)是2004年美国食品与药品管理局批准应用于临床的一种多靶点抗叶酸合成的药物。基础研究显示,培美曲塞能抑制胰腺癌细胞的增殖,与吉西他滨联合对抑制胰腺癌细胞生长具有协同治疗作用［2］。Ⅱ期的临床研究表明,培美曲塞对晚期胰腺癌疗效突出,且不良反应小［3］。用培美曲塞作为二线化疗药物,能显着提高患者的生存时间,改善预后［4］。

　　本研究结果显示,在对胰腺癌Patu8988细胞株使用培美曲塞进行多次大剂量冲击诱导模拟化疗过程后,胰腺癌细胞发生了某些改变,耐药株细胞相对于其亲本株在无论有无加药的软琼脂中培养3周,其克隆能力都有所增强,说明了在加药环境下耐药株胰腺癌单细胞对化疗产生抵抗性,而且在无药环境下耐药株单细胞的生发能力较其亲本株也有提高。

　　有研究［5］结果显示,肿瘤细胞发生耐药性的原因之一是一个高度保守的ABC跨膜转运蛋白家族某些成员的过度表达。前期本实验室通过基因芯片的筛选,对ABC家族中所有基因的变化进行了汇总,选取了变化最为明显的3个基因ABCG2、ABCC3、MDR1进行验证。通过RTPCR及Wersten blot发现,在对培美曲塞耐药的胰腺癌Patu8988细胞株中，ABCG2提高至倍,而经典的MDR1(Pgp)的提高仅约倍。这可能与所选取的化疗药物的特性有关。

　　已有多篇文献报道，ABCG2高表达常为肿瘤不良预后的标志。Burger等［6］应用RTPCR对59例接受氟尿嘧啶、阿霉素、环磷酰胺等化疗药物系统治疗的原发性乳腺癌患者进行分析,结果表明,在这些接受治疗的患者中,ABCG2高表达的患者平均生存时间明显少于低表达者。Benderra等［7］研究结果表明：在新诊断急性白血病组中ABCG2基因的阳性表达率达％；ABCG2 mRNA阴性和阳性患者化疗后的首次完全缓解率分别为％和％；复发组中ABCG2 mRNA的水平明显高于新诊断组,而在正常个体和长期存活的白血病患者中,ABCG2基因的表达水平非常低。ABCG2 mRNA的高表达直接导致临床耐药的发生,对急性白血病的预后是一个不良的因素。另外有文献［8］报道,ABCG2在“侧群细胞”(side population cells,SP cells)中高表达。SP细胞群具有肿瘤干细胞的特性,对化疗药物有高抵抗性。Zen等［9］在人肝癌标本中分离出了少量的SP细胞,这种SP细胞能进行不对称分裂生成，具有无限增殖能力的SP和有限增殖能力的非SP细胞同时高表达耐药蛋白ABCG2,对细胞毒性药物有很强的抵抗性,对化疗不敏感。而本实验中耐药株的克隆能力增强也可能是由于经过药物的筛选高表达ABCG2的SP细胞的比例增高导致。

　　以上文献与本次实验均提示，在化疗后选择性高表达的ABCG2等与肿瘤细胞耐药紧密联系。通过本研究发现胰腺癌耐药细胞株与亲本株生物学行为上的差异。发现ABC家族，特别是ABCG2基因的上调可能是胰腺癌化疗过程中产生获得性耐药机制的重要原因。国外很多研究［10］表明，ABC膜转运蛋白已成为抗肿瘤耐药的靶向之一。以上实验为下步针对ABC膜转运蛋白进行相关逆转胰腺癌耐药来提高化疗疗效的实验提供基础。
【参考文献】
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