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AIHA患者外周血Th1／Th2、Tc1／Tc2亚群的研究及意义

　　作者：吴伟全，孙炎华，邱少玲
【关键词】 自身免疫性溶血性贫血
　　［摘要］ 目的：研究自身免疫性溶血性贫血(autoimmune haemolytic anaemia，AIHA)患者外周血Th1／Th2、Tc1／Tc2亚群极化状态，分析AIHA的免疫学发病机制，为AIHA的临床治疗提供新的理论依据。方法：收集AIHA患者及健康对照组外周抗凝静脉血，分离纯化T细胞。以Cy5标记的抗CD4、CD8单抗和PE标记的CD30单抗作双色流式细胞术，分析AIHA患者Th／Tc、Th1／Th2、Tc1／Tc2亚群的比例变化。结果：与正常对照组相比，AIHA患者外周血CD4+细胞百分率显着降低(P0．05)，CD8+细胞百分率无明显变化(P0．05)，CD4+/CD8+比例明显降低(P0．05)，CD4+CD30-T、CD4+CD30+T细胞百分率明显下降，CD4+CD30-T／CD4+CD30+T和CD8+CD30-T／CD8+CD30+T比例均明显升高(P0．05)，而CD8+CD30-T及CD8+CD30+T细胞百分率无明显变化(P0．05)。结论：AIHA患者外周血存在细胞免疫功能失调，T细胞亚群极化状态发生改变，呈明显Th1／Tc1型细胞优势；Th1／Tc1型细胞介导的细胞免疫可能与AIHA的免疫学发病机制有关。
　　［关键词］ 自身免疫性溶血性贫血；T细胞亚群；研究
　　Study on Th1／Th2、Tc1／Tc2 Subsets on Peripheral Blood of the Patients with Autoimmune Haemolylic Anaemia and It‘s Significance
　　Abstract:Objective To investigate the change of Th1like and Th2like cells balance in autoimmune haemolytic anaemia(AIHA)patients．Methods The ratios of Th／Tc，Th1／Th2 and Tc1／Tc2 inperipheral blood T cells were analyzed by immunofiuorescence staining and bicolor flow cytometry(FCM) in vitro．Results Compared with the ratios of Th1／Th2 (48．76％±6．17％)and Tc1／Tc2(18．90％±4．12％)in healthy people，the ratios of Th1/Th2 (56．21％±5．95％)and Tc1／Tc2(23．09％±3．31％) in AIHA patients increased obviously．FCM analysis showed that average percentages of Th，Th1，Th2，Tc，Tc1 and Tc2 are (22．31％±6．51％)，(21．92％±6．42％)，(0．37％±0．14％)，(32．12％±6．15％),(30．95％±5．45％) and (1．34％±0．84％) in AIHA patients versus (38．24％±5．82％)，(38．01％±5．47％)，(0．90％±0．16％)，(31．25％±5．63％)，(29．72％±5．20％) and (1．52％±0．68％) in healthy people．The average percentages of Th,Th1 and Th2 decreased obviously．While the average percentages of Tc,Tc1 and Tc2 did not changed．Conclusion The ratios of Th1／Th2 and Tc1／Tc2 in peripheral blood T cells were increased obviously in AIHA patients．It suggested that cellular immunity in AIHA patients is shifted to Th1 typeimmunity，which may relate to the mechanism of AIHA．
　　Key words：Autoimmune haemolytic anaemia； T cell subsets; Study
自身免疫性溶血性贫血(autoimmune haemolytic anaemia，AIHA)是一种器官特异性的自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全明了。研究发现AIHA的发生发展与患者体内T细胞的极化状态有关。目前研究认为CD30可能是Th2、Tc2特异性表面标志物之一，本研究应用PE标记的抗CD30单抗和Cy5标记的CD4、CD8作双色流式细胞术，检测AIHA患者及健康人群外周血T细胞各亚群的百分率。分别以CD4+CD30-T、CD4+CD30+T、CD8+CD30-T及CD8+CD30-T细胞代表Th1、Th2、Tc1及Tc2细胞，并进一步探讨Th1类／Th2类细胞极化漂移在AIHA发病机制中的作用。
　　1 材料与方法
　　1．1 研究对象 35例AIHA患者取自本院及广东医学院附属医院血液科，男15例，女20例，年龄3岁~69岁，中位年龄45岁，均符合AIHA诊断标准，并于用药前取外周抗凝血；正常对照35例为健康人群，排除AIHA及其他自身免疫性疾病，其中男16例，女19例，年龄5岁~57岁，中位年龄37岁。
　　1．2 主要试剂和仪器 AntiCD4Cy5、AntiCD8Cy5(EB公司)、AntiCD30-PE、MslgG1Cy5、MslgG1PE(Miltenyibiotec公司)、小牛血清、溶血素(0．85％NH4Cl溶液)、hCD3+Tcell Enrichment Column、淋巴细胞分离液(AXISSHIELD公司)、EPICSXL型流式细胞仪(Beckman公司)。
　　1．3 研究方法
　　1．3．1 外周血T细胞的分离 无菌采集患者及正常人外周静脉血4 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得单个核细胞。无菌玻璃培养皿37 ℃培养30 min，去除黏附于玻璃培养皿的单核细胞，以获取悬浮的淋巴细胞。加入0．85％NH4Cl溶液溶解红细胞，经T细胞分离富聚柱(hCD3+T Cell Enrichment Column)采用负筛选法获得纯化的T淋巴细胞。用20％的小牛血清RPMI1640培养液调整细胞浓度约2×106/ml。FCM法检测其纯度大于98％，台盼蓝拒染法检测其活性大于97％。
　　1．3．2 Th、Tc、Th1、Th2、Tc1、Tc2亚群的测定 取3支试管，各加入100 μl T细胞悬液，3管分别加入小鼠抗人单克隆IgG1PE和小鼠抗人单克隆IgG1Cy5(阴性对照管)、抗CD4Cy5和CD30-PE(CD4+管)、抗CD8-Cy5和抗CD30PE(CD8+管)，各种标记抗体均15 μl，混匀，4℃避光30 min，PBS洗涤2次，各管加入0．5 ml缓冲液，上流式细胞仪检测。
　　1．4 统计分析 所有结果以±s表示，两两比较采用成组t检验，经SAS8．22软件分析，取P0．05有统计学意义。
　　2 结果
　　2．1 Th、Tc、Th／Tc细胞的检测结果 AIHA患者外周血Th细胞百分率及Th／Tc比例明显下降，与正常人群比较差别有统计学意义(P0．05)；Tc细胞百分率无明显变化，与正常人群比较差别无统计学意义(P0．05)(见表1)。
　　表1 AIHA患者及正常人外周血Th、Tc细胞的检测(略)
　　注：与正常对照组比较，*P0．05；**P0．05
　　2．2 Th1、Th2、Tc1、Tc2、Th1／Th2、Tc1／Tc2的检测结果 AIHA患者外周血Th1、Th2细胞百分率明显下降，与正常人群比较差别有统计学意义(P0．05)：Tcl、Tc2细胞百分率无明显变化，与正常人比较差别无统计学意义(P0．05)；Th1／Th2及Tc1／Tc2比例升高，与正常人比较差别有统计学意义(P0．05)，见表2。
　　表2 AIHA患者及正常人群外周血Th1/Th2、Tc1／Tc2细胞的检测(略)
　　注：与正常对照组比较，*P0．05；**
　　3 讨论
　　自身免疫病是临床上常见的一类疾病，然而引起自身免疫病的原因和机制十分复杂，目前尚未完全明了。可能与自身抗原的出现、免疫调节异常、Fas／FasL表达异常等多种因素有关，根本原因可能是自身成分具有免疫原性和／或自身免疫耐受的破坏，发生持久和过度的自身免疫应答。
　　目前研究资料表明，Th／Ts(CD4+／CD8+)细胞的平衡在自身免疫病的发生发展过程中起重要作用。CD4是T辅助／诱导细胞(Th／Ti)的表面标志，CD4+T细胞具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能。起辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。CD8是抑制／杀伤T细胞(Ts／Tc)的表面标志，CD8+T细胞具有细胞毒效应及抑制T细胞活化、抑制B细胞产生抗体，起抑制细胞及体液免疫的作用。Th／Ts(CD4+/CD8+)比例变化反映了机体的免疫功能状况，比例升高表明免疫功能亢进，比例降低表明免疫功能低下。本研究发现，AIHA患者CD4T百分率及CD4+／CD8+比例均明显降低，CD8+T百分率无明显变化。结果提示，AIHA患者Th／Ti数量及比例降低，反应了AIHA患者体内存在细胞免疫调节异常，AIHA患者可能存在T细胞免疫功能低下，但是自身反应性T细胞可能是异常活化的。
　　人类CD4+T细胞根据其分泌的细胞因子不同至少可分为Th0、Th1、Th2三个亚群。其中Th1亚群可分泌IL2、IFNγ等细胞因子，促进细胞免疫，激活细胞毒T细胞，巨噬细胞，吞噬杀伤靶细胞，也可分泌TNFα、β等细胞因子作用于靶细胞；Th2亚群主要分泌IL4、IL5、IL10等细胞因子而促进体液免疫反应。近年来研究发现，人类CD8+T细胞至少可分为Tcl、Tc2两个亚群。Tc1与Th1相似，可分泌IL2、IFNγ等细胞因子：Tc2与Th2相似，可分泌IL4、IL5、IL10等细胞因了［3］。Mosmann等［4］将Th1／Tc1、Th2／Tc2细胞分别称为Th1类、Th2类细胞。Th细胞间的平衡状态与多种疾病的发生发展密切相关，Alves等认为Th1／Th2细胞间的平衡，是体内体液免疫及细胞免疫间重要的调节枢纽。因此，建立一种准确、灵敏、快速的检测Th的方法十分必要。目前检测Th1／Th2的方法有多种，其基本原理都是外周血淋巴细胞经刺激后，检测培养液中细胞因子的含量，或者检测细胞内细胞因子的表达。但是它们都无法判断所分泌的细胞因子是来自CD4+T细胞或是其他单个核细胞，所以并不能真正地检测出Th细胞的极化状态。
　　Thl类／Th2类细胞间的平衡状态对研究包括AIHA在内多种自身免疫病有重要意义，然而，长期以来，一直缺乏一种特异性表面标志以区别Th1类／Th2类细胞。近年来有研究发现CD30是检测Th2和Tc2细胞可靠的表面标志，DelPrete等［1］研究发现Th1细胞克隆基本上不表达CD30 mRNA，其CD30膜结合形式及可溶性形式水平也检测不到，而在Th2细胞克隆，CD30m RNA及CD30膜蛋白结合形式则大量表达，并释放出大量的sCD30。Chilosi等［5］从一名类Omenm综合征(OLS)患者外周血中分离出的CD30+T细胞形成的集落中，绝大多数具有Th2细胞特征，而CD30T细胞集落多数是Th1细胞。Nakamura等［6］研究发现，IL4能施用诱导CD30在活化的CD4+T细胞上表达，在内源性IL4缺失的状态下，Th2细胞会失去CD30表达的能力。目前国外相关研究均表明CD30是Th2细胞的标志之一。本研了以PE标记的抗CD30单抗测得的正常人外周血T细胞中CD4+CD30+T(Th2)细胞为(0．80±0．16)％，与Nagata等［7］的结果相似。因此我们可以运用CD30或sCD30的表达水平来分析Th2细胞在一些疾病发病机制中的作用，可为疾病的活动性、预后评估等方面提供一定的帮助，但其价值还有待进一步研究。
　　AIHA是一种常见的自身免疫性疾病，临床上以溶血性贫血为主要特征。主要是由于服用药物或病毒感染后，使红细胞膜表面成分发生改变，从而刺激机体产生抗红细胞的自身抗体，这种抗体与自身改变的红细胞结合导致红细胞破坏增加所致。然而，越来越多的资料显示，除体液免疫机制外，细胞免疫起着非常重要的作用。本研究应用流式细胞术检测纯化的外周血T细胞，分别以CD4+T细胞，CD8+T细胞代表Th、Tc细胞，以CD30区分Th1类和Th2类细胞。我们的结果发现AIHA患者外周血Th1类／Th2类细胞间失衡，呈现明显Th1类优势，这一结论与Fagiolo等［8，9］的报道一致。同时，我们发现，尽管AIHA患者Th细胞下降，Tc细胞无明显变化，然而Th1／Th2及Tc1／Tc2比例均明显升高，提示在AIHA的发病过程中，Th1类／Th2类比例较Th和Tc细胞数所起的作用更为明显。AIHA患者体内Th1类／Th2类比例升高，提示机体自身反应性细胞免疫功能亢进。在AIHA发生发展过程中，Th1细胞可通过分泌IL2、IFNγ等细胞因子，激活细胞毒T细胞、巨噬细胞，杀伤红细胞；而活化的Tc1细胞，也就是通常所说的Tc细胞，则能通过分泌穿孔素、颗粒酶特异性地杀伤红细胞［10，11］。
　　本研究表明，通过对Th1类/Th2类细胞平衡在AIHA中的作用的研究，不仅有助于阐明AIHA的发病机制，而且有可能为我们提供治疗AIHA的新方法，即通过调节Thl类/Th2类细胞的动态平衡，来调节过强的体液免疫或细胞免疫，达到治疗自身免疫病的目的［12］。
　　参考文献：
　　［1］ Del Prete G，Carli M，D’Elios MM，et　signaling promotes the develo Pment of human T helper type 2like T cells［Ｊ］．Jxep Med,1995,182(6)：16651669．
　　［2］ 张之南.血液病诊断及疗效标准［M］．第2版.北京：北京科学出版社，1998．
　　［3］ Woodland DL，Dutton　of CD4(+)and CD8(+)T cells［Ｊ］．Curr Opin Immunol．2003,15(3)：336342．
　　［4］ Mosmann TR，Sad　expanding universe of Tcells ubsets：Th1，Th2 and more［J］.Immunol Today,1996，17(3)：138146．
　　［5］ Elios MM，Romagnani P，Scaletti C，et al．In vivo CD30 expression in diseases with predominant activtion of Th2like T cell［Ｊ］．J leikoc Biol,1997,61(5)：3943．
　　［6］ Nakamura T，Lee RK，Nam SY，et al．Reclprocal regulation of CD30 expression on CD4+T cell by lL4 and IFNgamlna［Ｊ］．J Immunol，1997,158(5)：20902097．
　　［7］ Nagata K，Tanaka K，Ogawa K，et al．selective expression of a novel surface molecule by human Th2 cells in vivo［J］．J Immunol,1999,162(3)：12781286．
　　［8］ Fagiolo E，TorianiTerenzi C．Th1 and Th2 cytokine modulanon by IL10／JL12 imbalance in autoimmune haemolytic anaemia(AIHA)［Ｊ］．Autoimmunity．2002,35(1)：3944．
　　［9］ TorlanlTerenzi C，Fagjolo E．Th2 cytokine role in autoimmune haemolytic anaemia (AIHA) pathogenesis［Ｊ］．Panminerva Med．2001,43(1)：15．
　　［10］ Lwase O，AOki I，Kurlyama Y，et al．Analysis of T cell subsets in autoimmune hemolytic anemia patients［Ｊ］．Rinsho Ketsueki，1995,36(1)：18．
　　［11］ Barcellini W，Clerlcl G，Montesano R，et　quantification of antired bloodcell antibody Production in idiopathic autoimmune haemoxytic anaemia：effect of mitogen and cytokine stimulaion［Ｊ］．Br J Haematol，2000,11(2)：452456．
　　［12］ Youssef AR，Sllen CR，Lin CL，et al．IL4and IL10 modulate autoimmune haemolytic anaemiain in NZB mice［Ｊ］．Clin Exp Immunol,2005,139(1)：8489．