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体外循环中白细胞释放调控机制与急性肺损伤

【关键词】 多形核白细胞；体外循环；急性肺损伤

急性肺损伤是体外循环后最常见的并发症之一，常表现为非心源性、顽固性低氧血症 (PaO2:FiO2 300mmHg)。如肺功能进一步降低，PaO2:FiO2200 mmHg时，称为急性呼吸窘迫综合征，其发生率为%～%，死亡率高达55%～%［1］。
全身炎性反应的激活是ALI/ARDS发生的主要原因［2］。炎性反应包括炎性细胞的活化和炎性介质的释放，两者相互促进，共同导致ECC相关肺损伤的发生。中性粒细胞是主要的炎性细胞，它通过释放多种细胞因子和蛋白酶造成组织损伤，因此在SIR中起重要作用［1］。
中性粒细胞的细胞核形态多样，成熟细胞的核呈分叶状，因此又称为Polymorphonuclear。正常情况下，98%～99%的PMN储存于骨髓内，在ECC刺激下，大量PMN从骨髓中释放出来，导致ALI。因此，研究ECC中骨髓释放PMN的调节机制及PMN参与肺损伤的病理生理过程对于减少肺部并发症具有重要意义。
1 PMN的分布
根据功能和部位的不同，PMN可分为髓内的增殖池、储存池和髓外的循环池、边缘池。骨髓中PMN含量为×109/kg，约占全身总量的98%～99%，其中40%为成熟的分叶核白细胞，其余60%为晚幼粒细胞。正常成人每天约有1×1010个成熟粒细胞由骨髓储存池释放入血，其中约44%随血液流动形成循环池，余56%粘附于小血管壁形成边缘池，循环池和边缘池内的粒细胞通过与血管壁的黏附与脱落进行互相转化。血液中老化的PMN最后在肝脏、脾脏、骨髓中被清除。
2 骨髓释放PMN的调节机制
　CXCR4/SDF-1介导机制 目前认为，PMN上表达的CXCR4与骨髓基质细胞上广泛表达的SDF-1的连接是调节PMN释放的主要因素［3］。CXCR4是趋化因子CXC亚家族的G蛋白偶联受体，通过与磷脂酶C耦联，经IP3/Ca和DAG/PKC双信号通路介导胞内信号传递。研究发现，如CXCR4/SDF-1的连接活性降低或CXCR4的表达减少，均能促进PMN的快速释放。而CXCR4对SDF-1的敏感性增加则造成骨髓释放PMN减少，如先天性髓样粒细胞缺乏症［4］。
CXCR4受多种细胞因子的调节，如G-CSF通过减少PMN细胞表面的CXCR4的表达及促使CXCR4的裂解而促进骨髓中PMN的释放［5］。促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α (TNF-α)，白介素1β能减少CXCR4的表达，而抗炎性细胞因子如IL-4、IL-10，则能增加CXCR4的表达。
遗憾的是，目前仍没有文献报道ECC对PMN表面CXCR4表达的影响，但不难推论，ECC引起的血浆内炎性细胞因子如TNF、IL-1β、INF-γ等水平提高，调节了SDF-1/ CXCR4的表达或连接活性，从而出现ECC后PMN数量显着增高。
　L-选择素介导机制 选择素是Ca2+依赖的黏附分子，分为P-选择素、E-选择素和L-选择素三类。L-选择素表达于大多数类型的白细胞上，其在骨髓释放PMN过程中具有重要调节作用［6］。在补体的刺激下，通过CR3即CD11b/CD18激活PMN，使黏附在胞内区的L-选择素近膜处的钙调蛋白脱落，同时L-选择素胞外区的构型改变，使其对内源性蛋白水解酶敏感性增加，从而靠近细胞膜部位的肽键被酶水解断裂，PMN细胞膜上表达的L-选择素脱落，PMN-骨髓窦状隙内皮细胞之间的粘附作用减弱，从而PMN穿过内皮细胞间隙进入外周血循环。但L-选择素在PMN释放过程的作用现仍存在异议［7］。
　蛋白酶作用 研究发现，IL-8可以导致骨髓内基质金属蛋白酶9、中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G表达增高［8］。体外实验表明，这些蛋白酶可以降解细胞粘附分子等，中性白细胞弹性蛋白酶可切断SDF的N末端，减少SDF的活性，进而减少SDF-1/CXCR4的结合，促进PMN的释放［9］。然而在缺乏MMP-9或NE和组织蛋白酶G的转基因小鼠动物模型上发现，其骨髓中PMN的释放与正常鼠相比无差别，甚至在基因敲除二肽基肽酶-1的小鼠，其PMN的释放与正常鼠相比无差别［10］，表明PMN分泌的蛋白酶对自身的释放无明显作用。但仍不能排除未知蛋白酶参与PMN释放作用。
3 PMN在肺脏的滞留机制
肺脏是唯一接纳全身血流的脏器，其组织结构极其疏松。肺泡上皮细胞与血管内皮细胞之间只有少量菲薄的结缔组织。肺毛细血管结构特殊，平均直径血管为 μm，其内皮细胞有许多直径为 μm、长为～3 μm的绒毛状突起［11］，这种特殊的组织结构增加了血液和气体的交换面积，使肺脏具有较强的气体交换能力。
PMN在血管内皮细胞上黏附过程分为滚动和紧密黏附两阶段，分别由L-选择素和β2整合素介导。β2整合素是表达于各类白细胞膜上的黏附分子，它有3种类型：αLβ2、αMβ2(CD11b/CD18，Mac-1，CR3)、CD11c/CD18，分别由不同的α亚单位和一个相同的β2亚单位构成。其中LFA-1表达于周围淋巴结细胞，而Mac-1和CD11c/CD18主要表达于PMN。ECC中内毒素的产生、补体系统的激活使PMN活化，活化后PMN细胞膜表面表达L-选择素、β2整合素，参与PMN在血管内皮细胞上滚动与粘附，导致PMN滞留增加。如Mac-1分子缺乏可造成白细胞粘附缺陷，PMN难以在炎性反应部位聚集［12］。体外实验也证实，经CD11抗体或CD18抗体处理的PMN，其粘附和迁移的能力均显着下降［13］。
然而，Doerschuk［14］的研究发现，PMN在肺血管内的粘附迁移不全依赖CD11/CD18。研究发现，97%的肺毛细血管直径介于2～15 μm之间，这些血管直径太小，PMN难以在血管壁上滚动，而在直径大于15 μm的肺毛细血管，才会发生滚动过程。用墨角藻聚糖封闭选择素仅使PMN在肺毛细血管内聚集减少15%～25% ［15-16］，1997年，Malawista［17］的实验证明，在直径大于14 μm的管腔中，PMN的粘附依赖CD11/CD18，但如果血管直径小于14 μm，尽管PMN上的CD11/CD18被封闭，粘附仍会发生。这表明肺血管的特点在PMN粘附迁移过程中发挥重要的作用。
肺毛细血管管腔狭窄，平均直径为 μm，且有绒毛状突起，流经肺血管的PMN平均直径为7～8 μm。正常生理状态下，PMN可经过变形顺利通过毛细血管。但在LPS及C5a等炎性介质作用下，PMN被活化，细胞内G肌动蛋白在F肌动蛋白丝中聚集，使膜边缘的细胞骨架形成增多，PMN的变形能力下降，难以进行有效的变形而通过狭窄的肺毛细血管。导致其在肺微循环中滞留［18-19］。
4 PMN致肺脏损伤的机制
　PMN游出肺毛细血管外 Mac-1与ICAM-1的结合导致PMN与内皮细胞紧密粘附，同时产生“外向内”的信号传递，引起血管内皮细胞钙离子浓度增加，肌球蛋白收缩，并激活P38激酶、SRC、Rho GTP酶家族，最终引起内皮细胞骨架的重组，内皮细胞间的细胞连接重新分布。PMN通过肌动蛋白的重组，使其形状改变，伸出伪足从细胞间隙迁移到毛细血管外的肺组织。在PMN分泌的蛋白酶等作用下，游出的PMN在细胞外基质中前行并发挥作用。运用冷冻蚀刻技术发现，ARDS患者的肺泡上皮紧密连接被破坏，血管内皮细胞间的紧密连接颗粒大小不均，排列不规则，可见节段性颗粒缺如，电镜下发现内皮细胞间分离现象［20］。
　氧自由基介导的肺损伤 在NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶(XO)等作用下，活化的PMN可产生和释放大量自由基等杀灭细菌，但在炎性反应失控时可破坏正常肺组织。
超氧阴离子、H2O2作用于MAPK上的敏感位点而激活MAPK家族信号转导通路：MAPK家族中的JNK信号转导通路进一步激活核因子AP-1造成肺泡上皮细胞出现胀亡，表现为细胞肿胀、体积增大、胞质空泡化、线粒体嵴消失［21］；NF-κB抑制物蛋白激酶的激活引起NF-κB的P65和P50分离，κB迅速移至核内,与特定的基因启动子序列结合诱导其转录，从而上调细胞因子如TNF-α和IL-1β、细胞间粘附分子等表达［22］。TNF-α和IL-1β表达增加则进一步激活NF-κB，形成恶性循环，引起炎性反应进一步扩大。
氧自由基除引起肺实质细胞的胀亡, 还能氧化蛋白酶抑制剂α1-AT 的活性中心蛋氨酸残基，使α1-AT 失去对PMN分泌的NE等抑制作用，从而破坏蛋白酶-抗蛋白酶平衡，使正常组织破坏。
　　　蛋白酶介导的肺损伤 滞留于肺内的PMN释放多种蛋白酶，它既可以杀灭致病菌，维系内环境稳定，也可以水解细胞外基质造成肺损伤。中性粒细胞弹性蛋白酶属丝氨酸蛋白酶家族，可降解细胞外基质中的弹性蛋白、胶原蛋白、钙黏附素等，从而破坏细胞间的紧密连接和基底膜的完整性，使肺血管通透性增加；NE还通过破坏基底膜硫酸乙酰肝素黏蛋白的完整性［23］，导致血管通透性增加和严重肺水肿。此外NE能分解肺泡表面活性物质的主要成分表面活性蛋白，损害肺泡舒缩功能，促进ALI/ARDS的发生。临床发现，严重ARDS的患者血浆和肺泡灌洗液中弹性蛋白酶活性显着高于症状不明显的患者，如使用弹性蛋白酶抑制剂可以减少白细胞相关的肺损伤［24］。
基质金属蛋白酶是一类含Zn2+ 的内源性蛋白水解酶。目前已发现的MMPs 家族成员有20多种,根据其底物的特异性和结构的差异分为四大类：间质胶原酶、明胶酶、基质溶解素和膜型金属蛋白酶(MT-MMPs)。PMN主要分泌MMP-8与MMP-9。现已证实，MMP-9基因启动子位于NF-κB、AP-1等多种核因子结合位点［25］，促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β可以通过MAPK-NF-κB通路上调MMP-9表达。临床发现ARDS患者肺泡上皮层液体的MMP-9浓度显着高于非ARDS的患者，运用其抑制剂可以减少ECC引起的肺损伤［26］，说明MMP-9参与了ECC相关的ALI。
　其它损伤机制 PMN -血小板-肺血管内皮细胞的粘附，造成肺毛细血管的物理性阻塞，导致弥散性肺泡灌注不良，解剖分流增加。ECC中，由于PMN凋亡时间延长造成的损害也不容忽视：促进细胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶活化被抑制，TNF-R1表达下调，及各种细胞因子如IL-1β、IFN-γ、IL-8、LPS刺激等，引起PMN凋亡延迟，使PMN持久存在于肺间质和肺泡腔，分泌过量蛋白酶并释放氧自由基，导致肺基质与肺泡上皮损伤加重［27］。
5 小结
ECC刺激下，PMN在体内的分布稳态被打破：骨髓中的PMN表面分子CXCR4/SDF-1、L-选择素等活性下降或数量减少，PMN释放增加。由于肺组织微血管床和活化PMN的特点， PMN更容易在肺脏微循环中滞留。PMN内NF-κB同时被激活，介导IL-1β、TNF-α等细胞因子以及黏附分子的转录和表达，进一步引起PMN在肺组织中的聚集与激活，形成炎性反应-肺损伤的恶性循环，最终导致ALI甚至ARDS的发生。PMN激活后从骨髓中释放是急性肺损伤发生的源头，因此ECC中PMN释放的调节机制可能成为防治肺损伤新的研究方向。
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