外周血PSA、PSA-mRNA联合检测在前列腺癌诊断中的临床应用.docx

外周血PSA、PSA mRNA联合检测在前列腺癌诊断中的临床应用【摘要】 目的 探讨利用外周血PSA、PSA mRNA联合检测诊断前列腺癌的临床应用及意义。方法 运用酶联免疫分析和巢式RTPCR检测22例PCa、10例良性前列腺增生患者，5例健康男性和5例健康女性外周血中PSA、PSA mRNA的情况。结果PCa患者血清PSA的水平与临床分期、Gleason评分有关，而与年龄无关；外周血PSA、PSA mRNA与临床分期、内分泌治疗有关，而与年龄、Gleason评分无关；22例PCa标本中PSA mRNA阳性表达15例，阳性率68%，10例BPH和10例阴性对照标本无表达。结论 利用外周血PSA、PSA mRNA联合检测是一种早期发现PCa微转移，判断其临床变化过程、分期、预计复发和评价疗效的方法。【关键词】 前列腺特异抗原；前列腺癌；前列腺增生；逆转录聚合酶链式反应临床上大约有50%的前列腺癌(PCa)病人在确诊时就已经发生了转移,病变已属晚期，预后不良13。国外报道血清游离PSA与外周血PSA mRNA联合检测PCa在鉴别良、恶疾病上有一定优越性4，5。国内这方面报道较少。应用RTPCR技术检测外周血中存在的少量癌细胞，可以发现微转移，对肿瘤的复发、转移、预后及临床治疗具有指导意义6，7。本研究采用酶联免疫技术和巢式RTPCR技术联合检测外周血PSA和PSA mRNA，以提高PCa微转移的诊断效率、监测复发、预测肿瘤分期及预后。1 材料与方法11 病例资料PCa组：选择20052006年佳木斯大学附属第一医院、佳木斯市中心医院门诊和住院病人。22例均为初诊PCa患者，均经前列腺穿刺病理诊断，年龄6482岁，平均72岁。22例PCa患者中有15例接受了内分泌治疗，7例未接受。BPH组：10例均为行前列腺经尿道电切术后病理证实患者，年龄3481岁，平均65岁。阴性对照组：5例男性健康志愿者和5例女性健康志愿者，血液学指标均正常，年龄2545岁，平均38岁。12 仪器及材料Ficoll淋巴细胞分离液购自中国医学科学院天津血液病研究所，总RNA提取RNAiso试剂盒、两步法RTPCR试剂盒购自大连生物工程有限公司，引物由上海生物工程服务技术有限公司合成，PSA定量试剂盒购自美国博检生物试剂有限公司。Biometra Tg PCR 仪：华粤企业集团有限公司；DU800核酸蛋白分析仪：Beckman公司；免疫分析仪器：DNM9602G型酶标分析仪。13 引物序列PCR引物：外引物：PSA494：5TACCCACTGCATCAGGAACA3；PSA960：5CCTTGAAGCACACCATTACA3。内引物：PSA559：5ACACAGGCCAGGTATTTCAG3；PSA894：5GTCCAGCGTCCAGCACACAG3。actin 上游：5CGGGAAATCGTGCGTGACAT3；下游：5GAACTTTGGGGGATGCTCGC3。扩增目的片段长度为712 bp。14 血清的提取抽取空腹静脉血5 ml，立即2 000 r/min离心10 min，分离血清置-20保存，1 w内完成实验。15 外周血单个核细胞的提取抽取5 ml静脉血肝素抗凝，用Ficoll淋巴细胞分离液分离白细胞置-80冰箱保存，提取过程按其说明书操作。16 总RNA的抽提及质量鉴定用Trizal试剂提取总RNA，提取过程按其说明书操作。提取产物用12%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量。紫外分光光度计下测OD260、OD280，测定RNA纯度和浓度。取OD260/OD280值在1820范围内的标本进行逆转录。所有实验中的塑料制品及实验用具均经01%DEPC水处理后高压灭菌。17 RTPCR取1 g总RNA进行逆转录反应；取逆转录产物2 l和PSA上下游外、内引物各1 l，使用20 l反应体系进行2次PCR，同时扩增PSA、actin和阴性对照cDNA。具体循环参数为：94 4 min，94 45 s，55 30 s，72 45 s；25个循环之后，72延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用EB染色，经凝胶成像系统拍照。18 血清PSA的检测PSA定量检测由专人严格按说明书进行操作。19 统计学处理应用SPSS100软件对数据进行处理，采用t检验、2检验。2 结果21 PCa组、BPH组、阴性对照组血清PSA检测结果 见表1。表1 PCa组、BPH组、阴性对照组血清PSA的检测结果22 PCa组血清PSA检测结果与临床参数的关系见表2。表2 PCa组血清PSA与临床参数的关系(略)PCa组血清PSA的水平在3个年龄分组中总体比较无显着性差异，在3个临床分期中总体比较有显着性差异，在3种Gleason评分中总体比较有显着性差异。23 PCa组、BPH组、阴性对照组外周血PSA mRNA表达情况PCa病人外周血标本经PSA巢式PCR外、内引物两次扩增后，产物在同一琼脂糖上得到PSA的RTPCR特异性条带。PSA经巢式PCR扩增最终可得到特异性条带。PCa组、BPH组、阴性对照组外周血PSA mRNA表达情况见表3。表3 PCa组、BPH组、阴性对照组外周血PSA mRNA表达情况 PCa组PSA mRNA阳性表达明显高于BPH组，差异有显着性意义。24 PCa组外周血PSA mRNA表达情况与临床参数的关系见表4。表4 PCa组外周血PSA mRNA表达情况与临床参数的关系 PSA mRNA表达情况在3个年龄分组中总体比较差异无显着性，在3种Gleason评分中总体比较无显着性差异，在3种临床分期中总体比较差异有显着性，在是否内分泌治疗分组中总体比较差异有显着性。 17泳道为第1次PCR阳性结果，长度为466 bp；814泳道为第2次PCR阳性结果，长度为335 bp；15泳道为 DL2 000 Maker3 讨论 目前对PCa诊断的方法主要有直肠指检、影像学、针吸细胞病理学、前列腺穿刺活检以及PCa肿瘤标志物PSA检测等。而这些方法很难诊断PCa的早期转移,因此人们努力寻找能早期发现肿瘤,监测微转移的方法。转移是恶性肿瘤的一个重要标志，是肿瘤术后复发、放疗和化疗失败的主要原因，也是肿瘤患者治愈率得不到提高的主要影响因素。许多肿瘤在淋巴结、外周血、骨髓中微转移灶的检出对肿瘤的诊断、分期、复发和预后的判断、手术、综合治疗的选择具有明显的指导意义8。 PSA是一种独特的酶9，是由前列腺上皮细胞分泌的糖蛋白10，是前列腺上皮细胞的特异标志物，而不是PCa的特异标志物。PSA mRNA在正常人外周血中不表达,只在前列腺组织特异性表达；当表达PSA mRNA的癌细胞脱落进入血液循环后,外周血中才能检测出PSA mRNA,只有PCa才能出现这种情况11。血清PSA的敏感性为46%，特异性为91%；与外周血PSA mRNA联合检测，敏感性为81%，特异性为95%。而对健康男性、BPH患者和女性的检测结果均为阴性，PCa和BPH患者的血清PSA水平有部分的重叠5，12，这将使部分PCa患者漏诊或使部分BPH患者遭受不必要的穿刺活检。 在本实验中PCa组血清PSA水平明显高于BPH组，但是B期PSA的水平与BPH比较无显着性差异。PSA巢式PCR的敏感性高，能够检出1/106个目的细胞，所以当表达PSA mRNA的癌细胞脱落进入血液循环时，就可以被检测到。22例PCa标本中PSA mRNA阳性表达15例，阳性率68%，低于国内相关文献报道的结果13。可能与检测例数较少和循环血中的癌细胞受到体内多种免疫调控机制、癌细胞水平和入血时间等多种因素的影响有关13。10例BPH和10例阴性对照标本无表达。所以将RTPCR方法检测血中PSA mRNA与血清PSA检测联合起来要比单纯检测血清中的PSA，更有助于鉴别PCa和BPH。由于PCa明确的病理分期关系着患者的治疗方案和治疗的预后，本研究深入探讨了PSA和PSA mRNA与年龄、临床分期、病理分级之间的联系。发现血清PSA的水平与临床分期、Gleason评分有关，而与年龄无关；临床分期越晚、病理分化越差者PSA的水平越高。还发现PSA mRNA与临床分期、内分泌治疗有关，而与年龄、病理分级无关。7例B期PCa患者中有4例PSA mRNA表达阳性，阳性率57%，较早的发现了PCa细胞的微转移。15例已有转移的患者中有11例表达阳性，阳性率73%，说明RTPCR方法能够较好的监测微转移，预测预后。22例PCa患者中有15例接受了内分泌治疗，7例未接受。在接受内分泌治疗组中PSA mRNA表达阳性为33%，而未接受内分泌治疗组中PSA mRNA表达阳性为57%，差别有显着意义，证明内分泌治疗有明显的作用，如能防止内分泌耐受细胞的生成，将有效的延长患者的生命并提高生活质量。利用外周血PSA、PSA mRNA联合检测可以提高Pca的检出率，是一种早期发现微转移、判断临床变化过程、分期、预后和评价疗效的无创方法。【参考文献】 1Dijkman GA，Debruyne FMEpidemiology of prostate cancerJEur Urol，1996；30:28195 2 Umekita Y ，Hiipakka RA，Koklontis 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