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第一章第一章分子生物学基础知识分子生物学基础知识一、核酸分子的基本组成一、核酸分子的基本组成(deoxyribonucleic acid,DNA)(ribonucleic acid,RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸核苷酸核苷酸核苷核苷碱基碱基磷酸磷酸戊糖戊糖核糖核糖脱氧核糖脱氧核糖嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶(一一)碱碱 基基1 1、特性：、特性：共轭性分子结构，共轭双键，共轭性分子结构，共轭双键，260nm260nm处有最大吸收处有最大吸收嘌呤嘌呤(purine)弱碱性，低弱碱性，低PHPH值时可接受质子值时可接受质子嘧啶嘧啶(pyrimidine)碱基间存在疏水堆积力碱基间存在疏水堆积力2 2、种类和结构：、种类和结构：嘌呤嘌呤腺嘌呤腺嘌呤(adenine,A)鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine,G)嘧啶嘧啶胞嘧啶胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine,T)(二二)戊戊 糖糖（构成（构成DNA）2 2、脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)（构成（构成RNA）123451 1、核糖核糖(ribose)2 2OH OH 亲水极性集团亲水极性集团 易水解易水解 易受攻击易受攻击RNARNA不稳定性不稳定性无无2 2OHOH，DNADNA相对稳定相对稳定(三三)核核 苷苷戊糖戊糖C1C1嘌呤嘌呤N9N9嘧啶嘧啶N1N1糖苷键糖苷键/糖甙键糖甙键核糖核苷核糖核苷脱氧核糖核苷脱氧核糖核苷11(四四)核苷酸核苷酸1 1、核苷酸、核苷酸 核苷核苷+磷酸磷酸 磷酸酯键磷酸酯键 戊糖戊糖+碱基碱基+磷酸磷酸2 2、游离核苷酸、游离核苷酸ADPADPATPATPAMPAMP(五五)核酸的一级结构核酸的一级结构1 1、定义、定义核酸中核苷酸的排列顺序。核酸中核苷酸的排列顺序。由由于于核核苷苷酸酸间间的的差差异异主主要要是是碱碱基基不不同同，所所以以也也称称为为碱碱基序列基序列。55端端3端端CGA2 2、核苷酸链的方向性：、核苷酸链的方向性：PO4OH55端端33端端3 3、一级结构的表示方法、一级结构的表示方法 结构式结构式/线条式线条式/字母式字母式A G P5 P T PG PC PT P OH 3 5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 55端端3端端CGA磷酸基团磷酸基团3 35 5磷酸二酯磷酸二酯键键羟基羟基DNA一级结构的基本特点一级结构的基本特点4种种dNTP以以3、5磷酸二酯键相连构成一个没有分磷酸二酯键相连构成一个没有分枝的线性大分子。它们的两个末端分别称枝的线性大分子。它们的两个末端分别称5末端（游末端（游离磷酸基）和离磷酸基）和3末端（游离羟基）。末端（游离羟基）。(六六)DNA与与RNA在组成上的区别在组成上的区别DNARNA碱基碱基 A G C T A G C U戊糖戊糖 脱氧核糖脱氧核糖 核糖核糖结构结构 双链双链 大多单链，局部双大多单链，局部双链链配对配对 AT AU G C G C 二、二、DNA的空间结构的空间结构(一一)DNA的二级结构的二级结构 双螺旋结构双螺旋结构1 1、特征、特征反向平行的双螺旋反向平行的双螺旋a.a.反向平行反向平行b.b.配对规律配对规律c.c.疏水碱基平面处于内侧，亲水疏水碱基平面处于内侧，亲水戊糖与磷酸骨架处于外测戊糖与磷酸骨架处于外测右手螺旋右手螺旋a.a.右手螺旋右手螺旋b.b.每周每周1010个碱基，每对碱基个碱基，每对碱基3636，碱基平面距离，碱基平面距离0.34nm0.34nmc.c.存在大沟、小沟存在大沟、小沟(大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。较大沟槽和较小沟槽。)稳定因素稳定因素a.a.横向：氢键横向：氢键b.b.纵向：碱基疏水堆积力纵向：碱基疏水堆积力2 2、双螺旋结构的多样性、双螺旋结构的多样性ABZ(二二)DNA)DNA的三级结构的三级结构 超螺旋结构超螺旋结构超螺旋结构超螺旋结构(superhelix(superhelix 或或supercoil)supercoil)DNADNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋正超螺旋(positive supercoil)(positive supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNADNA双螺旋方同相同双螺旋方同相同 负超螺旋负超螺旋(negative supercoil)(negative supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNADNA双螺旋方向相反双螺旋方向相反 多级螺旋模型多级螺旋模型压缩倍数压缩倍数 7 6 40 5 （8400）DNA 核小体核小体 螺线管螺线管 超螺线管超螺线管 染色单体染色单体 2nm 10nm 30(10)nm 400nm 210m 一级包装一级包装 二级包装二级包装 三级包装三级包装 四级包装四级包装三、三、DNA的功能的功能(一一)DNA的基本功能的基本功能:1.1.以基因的形式荷载遗传信息，作为基因复制的模板，是以基因的形式荷载遗传信息，作为基因复制的模板，是生命遗传的物质基础。生命遗传的物质基础。2.2.是转录的模板，是个体生命活动的信息基础。是转录的模板，是个体生命活动的信息基础。(二二)基本概念基本概念:1.1.基因基因(gene)(gene)：携带遗传信息的：携带遗传信息的一段特定的核苷酸序列一段特定的核苷酸序列，可自，可自我复制并指导转录。我复制并指导转录。2.2.基因组基因组(genomic)(genomic)：一个生物体所包含的全部遗传信息的总：一个生物体所包含的全部遗传信息的总和，即全部和，即全部DNADNA序列。序列。3.3.遗传密码遗传密码(genetic code)(genetic code)：DNADNA碱基序列与蛋白质的氨基酸碱基序列与蛋白质的氨基酸序列之间存在的对应关系。序列之间存在的对应关系。起始密码起始密码(ATG)(ATG)AUG AUG 终止密码：终止密码：UAA UAG UGAUAA UAG UGA四、四、RNA的结构的结构(一一)RNA的结构特征的结构特征:1.1.组成：核糖组成：核糖 碱基碱基A A U U C G C G2.2.单链，局部形成双链。单链，局部形成双链。3.3.含稀有碱基较多含稀有碱基较多DHU(DHU(二氢尿嘧啶二氢尿嘧啶)，T T（假尿嘧啶），（假尿嘧啶），甲基化，甲羟化，乙酰化等甲基化，甲羟化，乙酰化等(二二)RNA的种类的种类:1、参与基因表达的、参与基因表达的RNA信使信使RNA（mRNA）：遗传信息的传递，翻译模板）：遗传信息的传递，翻译模板转运转运RNA（tRNA）：氨基酸载体）：氨基酸载体核糖体核糖体RNA（rRNA）：提供蛋白质合成的场所）：提供蛋白质合成的场所2、核不均一、核不均一RNA（hnRNA）:mRNA的前体的前体3、核内小、核内小RNA（snRNA）：参与）：参与hnRNA的剪接、转运的剪接、转运4、核仁小核仁小RNA（snoRNA）：参与）：参与rRNA的加工修饰的加工修饰 5、胞质小、胞质小RNA（hnRNA）:运输新合成的运输新合成的Pr到高尔基体加工到高尔基体加工6、小片段干扰、小片段干扰RNA（siRNA）：诱发外源）：诱发外源mRNA的降解的降解五、核酸的理化性质及应用五、核酸的理化性质及应用(一一)一般理化性质一般理化性质1、粘度、粘度 DNA RNA2、沉降系数、沉降系数 DNA RNA3、酸碱性质、酸碱性质 DNA pI 44.5，pH 4.0 11.0 稳定，稳定，提取提取pH8.0 RNA pI 22.5 提取提取pH4.5左右，混有很少左右，混有很少DNA污染污染(二二)紫外吸收特征紫外吸收特征1、碱基的行为表现、碱基的行为表现 共轭双键在共轭双键在260nm有最大吸收有最大吸收2、应用、应用 测定浓度测定浓度 OD260=1.0 相当于双链相当于双链DNA 50g/mL 单链单链DNA（或（或RNA）40g/mL 寡核苷酸寡核苷酸 20g/mL 判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度 DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8 RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0 测定是否变性测定是否变性（增色效应增色效应）DNA完全变性完全变性 增加增加 2540 RNA变性变性 增加增加 1.1左右左右增色效应增色效应(hyperchromic effect)由于DNA变性引起的光吸收增加称增色效应,也就是变性后 DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA 分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础，但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。变性DNA的双链解开，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。4 4、复性：变性的、复性：变性的DNADNA在适当的温度、一定离子强度条件下，给在适当的温度、一定离子强度条件下，给以足够的时间重新缔合形成双螺旋的过程，称为复性。以足够的时间重新缔合形成双螺旋的过程，称为复性。5 5、影响复性的因素：、影响复性的因素：T T：Tm Tm 20202626 离子强度：降低带同种电荷单链间的排斥离子强度：降低带同种电荷单链间的排斥 DNA DNA浓度浓度 DNA DNA复杂程度复杂程度6 6、分子杂交：不同来源的具有互补序列的两条核酸单链，在、分子杂交：不同来源的具有互补序列的两条核酸单链，在一定条件下可以按碱基互补原则形成双链的过程。一定条件下可以按碱基互补原则形成双链的过程。六、遗传中心法则六、遗传中心法则转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译DNADNARNARNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质逆转录逆转录逆转录逆转录基因基因基因基因表型表型表型表型控制控制控制控制基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。蛋白质分子的过程。蛋白质分子的过程。蛋白质分子的过程。基因表达基因表达(gene expression)translationDNADNAmRNAmRNAproteinproteintranscriptionDNADNARNARNAtranscriptionDNADNA无组织特异性无组织特异性无组织特异性无组织特异性基因表达有组织特异性基因表达有组织特异性基因表达有组织特异性基因表达有组织特异性核酸生物合成的一般规律核酸生物合成的一般规律1 按照碱基互补配对原则，以按照碱基互补配对原则，以DNA为模板，逆转录为模板，逆转录以以RNA为模板为模板2 5 3方向，通过磷酸二酯键连接方向，通过磷酸二酯键连接3 特异的聚合酶催化特异的聚合酶催化4 聚合酶的底物核苷酸要求是聚合酶的底物核苷酸要求是5核糖或脱氧核糖核糖或脱氧核糖5 RNA聚合酶进行聚合反应时，可从头合成聚合酶进行聚合反应时，可从头合成RNA DNA聚合酶进行聚合反应时，要有聚合酶进行聚合反应时，要有3-OH末端末端(一一)DNA的复制的复制复制复制(replication)是指遗传物质的传代，以亲代是指遗传物质的传代，以亲代DNA为模板，以为模板，以dNTP为原料，按为原料，按照碱基互补原则合成子链照碱基互补原则合成子链DNA的的过程过程。15N链链14N链链重氮环境重氮环境15N轻氮环境轻氮环境14N3 5 3 5 解链方向解链方向35335领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)1 1、复制的方式：、复制的方式：母链双螺旋解链，以母链的两条单链为模板，母链双螺旋解链，以母链的两条单链为模板，半保留复制半保留复制以四种以四种dNTP为原料为原料碱基互补配对规律碱基互补配对规律子代子代DNA双链与母链碱基序列一致双链与母链碱基序列一致5 3方向，通过磷酸二酯键连接方向，通过磷酸二酯键连接2 2、复制的条件：、复制的条件：substrate:dATP,dGTP,dCTP,dTTPtemplate:解开成单链的解开成单链的DNA母链模板母链模板primer:提供提供3-OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合enzyme：a、DNA聚合酶聚合酶 b、DNA连接酶连接酶 c、引物酶引物酶 d、解螺旋酶和拓扑异构酶解螺旋酶和拓扑异构酶(三三)转录转录转录转录(transcription)生物体以生物体以DNA为模板合成为模板合成RNA的过程的过程。mRNA把遗传信息从染色体内贮存的状态转送至胞把遗传信息从染色体内贮存的状态转送至胞质，作为蛋白质合成的直接模板。质，作为蛋白质合成的直接模板。转录转录RNADNA 七、氨基酸七、氨基酸蛋白质是生物功能的主要载体，而氨基酸是蛋白质的构件分子。自然界存在的成千上万种蛋白质，在结构和功能上的惊人的多样性主要由氨基酸的内在性质造成的。(一一)氨基酸的分类氨基酸的分类:生物体中发现的氨基酸生物体中发现的氨基酸180180多种，大多数是多种，大多数是不参加蛋白质组成，这些称为非蛋白质氨不参加蛋白质组成，这些称为非蛋白质氨基酸。基酸。蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸只有只有2020种种，称为，称为蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸。存在某些蛋白质的不常见氨基酸都是肽链存在某些蛋白质的不常见氨基酸都是肽链上由常见氨基酸修饰转化而来。上由常见氨基酸修饰转化而来。常见的蛋白质氨基酸常见的蛋白质氨基酸苏氨酸 ThreonineThr T半胱氨酸 Cystine CysC蛋氨酸 MethionineMetM天冬酰胺Asparagine Asn N谷氨酰胺 Glutarnine GlnQ天冬氨酸 AsparticacidAspD谷氨酸Glutamicacid Glu E赖氨酸LysineLysK精氨酸ArginineArgR组氨酸HistidineHisH中文名称中文名称英文名称英文名称三字母缩写三字母缩写单字母符号单字母符号甘氨酸Glycine Gly G丙氨酸 AlanineAlaA缬氨酸ValineValV亮氨酸LeucineLeuL异亮氨酸 Isoleucine IleI脯氨酸ProlineProP苯丙氨酸 Phenylalanine PheF酪氨酸TyrosineTyrY色氨酸Tryptophan TrpW丝氨酸 Serine SerS中文名称中文名称英文名称英文名称三字母缩三字母缩写写单字母符单字母符号号按按R基的化学结构分类基的化学结构分类 1.脂肪族脂肪族aa（1）中性）中性aa 甘氨酸甘氨酸 丙氨酸丙氨酸 缬氨酸缬氨酸 亮氨酸亮氨酸 异亮氨酸异亮氨酸含羟基或硫含羟基或硫aa 丝氨酸丝氨酸 半胱氨酸半胱氨酸 苏氨酸苏氨酸 甲硫氨酸甲硫氨酸胱氨酸由两个半胱氨酸通过侧链上的胱氨酸由两个半胱氨酸通过侧链上的-SH-SH基氧基氧化成共价的二硫键连接而成化成共价的二硫键连接而成（）酸性（）酸性aaaa及其酰胺及其酰胺 天冬氨酸天冬氨酸 谷氨酸谷氨酸 天冬酰胺天冬酰胺 谷氨酰胺谷氨酰胺（）碱性（）碱性aaaa 赖氨酸赖氨酸 精氨酸精氨酸 、芳香族、芳香族aaaa 苯丙氨酸苯丙氨酸 络氨酸络氨酸 色氨酸色氨酸、杂环、杂环aaaa 组氨酸组氨酸 脯氨酸脯氨酸(三三)氨基酸的酸碱性质氨基酸的酸碱性质:如果如果AAAA在晶体或水中主要以兼性离子（偶极离子在晶体或水中主要以兼性离子（偶极离子)形式存在，不带电荷的中性分子为数极少，就很形式存在，不带电荷的中性分子为数极少，就很好解释这个问题了。好解释这个问题了。静电吸引静电吸引 范德华力范德华力 兼性离子形式的兼性离子形式的AA是强极性分子是强极性分子(四四)AAAA的光学活性和光谱性质的光学活性和光谱性质 1.AA 1.AA的光学活性和立体化学的光学活性和立体化学 a-a-氨基酸的氨基酸的a-a-碳是一个不对称原子（除了甘氨酸），因此具有碳是一个不对称原子（除了甘氨酸），因此具有旋光性。也分为两种构型旋光性。也分为两种构型D D型和型和L L型型苏氨酸，异亮氨酸，羟脯氨酸和羟赖氨酸除了苏氨酸，异亮氨酸，羟脯氨酸和羟赖氨酸除了a-a-碳碳原子外，还有第二个不对称碳原子。因此有四种光原子外，还有第二个不对称碳原子。因此有四种光学异构体。它们分别称为学异构体。它们分别称为L-L-，D-D-，L-L-别别-，D-D-别别-氨氨基酸。基酸。L-苏氨酸苏氨酸 D-苏氨酸苏氨酸 L-别别-苏氨酸苏氨酸 D-别别-苏氨酸苏氨酸氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性氨基酸的旋光符号和大小取决于它的氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R基性质，并且与测定的溶基性质，并且与测定的溶液液pH有关，这是因为在不同的有关，这是因为在不同的pH条件下氨基和羧基的解离状况条件下氨基和羧基的解离状况不同。不同。pH对对L-亮氨酸（蓝）和亮氨酸（蓝）和L-组氨酸（红）的组氨酸（红）的aD25值的影响值的影响 比旋是比旋是a-氨基酸的物理常数之一，是鉴别氨基酸的一种根据氨基酸的物理常数之一，是鉴别氨基酸的一种根据2.氨基酸的光谱性质氨基酸的光谱性质紫外吸收光谱紫外吸收光谱可见光区：无吸收可见光区：无吸收远紫外和红外区：都吸收远紫外和红外区：都吸收近紫外区（近紫外区（200200400nm400nm）：芳香族氨基酸）：芳香族氨基酸 Tyr/Trp/Phe Tyr/Trp/Phe 才有吸收才有吸收 原因：含有苯环共轭原因：含有苯环共轭p p键系统键系统-C=C-C=C-C=C-C=C-C=C-C=C-C=C-C=C-蛋白质最大吸收蛋白质最大吸收 在在280nm280nm 蛋白质含量测定蛋白质含量测定Trp 280nmTrp 280nmTyr 275nmTyr 275nmPhe 257nmPhe 257nm分光光度法定量原理分光光度法定量原理e:摩尔吸收系数，c:浓度；l:吸收杯的内径或光程厚度；I0：入射光强度；I：透射光强度核磁共振波谱核磁共振波谱核磁共振应用核磁共振应用 最初最初,核磁共振技术主要用于核物理研究方面核磁共振技术主要用于核物理研究方面,用它测量各种原子用它测量各种原子核的磁矩核的磁矩,误差仅是误差仅是0.003%0.005%;迄今迄今,它已广泛应它已广泛应用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域,已成为在已成为在这些领域开展研究工作的有力工具这些领域开展研究工作的有力工具,甚至是某些领域甚至是某些领域(如如:化学、化学、医学诊断、药物学等医学诊断、药物学等)常规分析中不可缺少的手段。常规分析中不可缺少的手段。1985 年年,维特里希等人公布了第一次利用维特里希等人公布了第一次利用NMR 法测定的溶液中蛋白质法测定的溶液中蛋白质蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂IIA(proteinase inhibitor IIA)的结的结构构(如图如图 所示所示)。1990 年用年用NMR 测定的蛋白质结构有测定的蛋白质结构有23 个个,而到而到1994 年一年测定的蛋白质结构数上升到年一年测定的蛋白质结构数上升到100个个。