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基于尼龙膜的点杂交条件的建立及优化

　　【关键词】 斑点杂交
　　［关键词］斑点杂交 ；糖基转移酶；基因
　　［摘 要］ 目的：进行基于尼龙膜的点杂交条件的建立及优化。方法：采用带正电荷的尼龙膜对斑点杂交的每一步骤进行优化，包括预杂交液，杂交液，洗涤和封闭液等及各步反应时间，并采用最终确立的条件检测糖基转移酶基因多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAcT2)在K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株中的差异表达以验证膜杂交条件的可行性。结果：建立并优化了膜斑点杂交的条件，本底清晰，结果可靠。结论：建立的斑点杂交技术经济简便，切实可行。
　　Establishment and Optimization of Dot Blot Technique
　　Abstract:Objective To establish and optimize the dot blot　We used the positively charged nylon membranes to optimize experiments for the dot blot including prehybridization solution，hybridization solution，washing buffer，blocking solutionetal，and the times of every step．In order to validate its feasibility，we analyzed the expression of ppGalNAcT2 in different tumor cell lines by dot blot assay using the established hybridizationsystem．Results we established and optimized the dot blot technique which had reliable results and low background．Conclusion The established dot blot technique is practicable and economical．
　　Key words:Dot blot;Glycosyltransferase; Gene
基因的表达分析研究是分子生物学实验中较为常用的手段，主要有Northern blot和斑点杂交(dot blot)等，因斑点杂交无需转膜，且DNA或RNA相对固定在一定的区域内，实验要求相对简单，因此斑点杂交更易为实验者所接受。目前一般均用商品化的试剂盒，但其价格昂贵，不是一般实验室所能普及，因此我们采用自配的试剂建立并优化了一套斑点杂交方法，无需特殊设备，经济简便，结果可靠。
　　1 材料和方法
　　1．1 多肽
　　N乙酰氨基半乳糖转移酶2 (UDPGalNAc：polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferases2,ppGalN AcT2 EC 2．．41)基因的获得。
　　取ppGalNAcT2克隆载体转染DH5α工程菌，筛选白色阳性克隆，抽取质粒，用M13正向、反向引物进行克隆PCR，M13Forward 5’GTAAAACGACGGCCAG3’，M13 Reverse 5’CAGGAAACAGCTATGAC3’，电泳鉴定结果，可见约1 200 bp左右的条带。即获得相应的ppGalNAcT2cDNA片段。
　　1．2 采用T2特异的寡核苷酸探针进行斑点杂交法条件的建立及优化
　　探针序列如下5‘GAAAGACCTTCATCACAGCAATGGAG AAGAA，与ppGalNAcT2 cDNA序列互补，长31 bp。探针合成及探针5’端生物素标记均由上海生工生物工程公司完成。
　　1．2．1 斑点杂交操作程序
　　以上述所得pp
　　GalNAcT2的cDNA片段以1N NaOH和200 mM的EDTA对比稀释，使成0．4N NaOH和10 mM的EDTA的终浓度。
　　把稀释的pp
　　GalNAcT2的cDNA片段在100 ℃变性5 min，迅速置冰，冰冷10 min以上。
　　膜(购自Amersco公司，带正电荷)用灭菌双蒸水浸泡10 min，悬空晾干。
　　每点2 μl把ppGalNAcT2的cDNA片段点在尼龙膜上，湿膜在紫外灯F照2 min，取出让膜干燥。
　　杂交时以2×SSC浸膜5 min，装入杂交袋，根据VECTOR NIT软件计算杂交温度的方法确定杂交温度为42 ℃。以每100 cm2膜加20 ml的预杂交液(50％的去离子甲酰胺，5XSSC，0．1％SDS，0．1％BSA，0．1％PVP，用pH7．5的PB调终体积)于42 ℃预杂交2 h~3 h。
　　弃去预杂交液，在杂交液(50％的去离子甲酰胺，5×SSC，0．1％SDS，0．1％BSA，％PVP，10％的硫酸葡聚糖，100 μg／ml的剪切的鲑鱼精DNA，用水调终体积)中加入适量探针，以每100 cm2膜加10 m1的杂交液于42 ℃杂交过夜。
　　用足量洗涤液1(2×SSC，0．1％SDS)于42 ℃洗涤二次，再用洗涤液2(0．5×SSC，0．1％SDS)于55 ℃严谨洗涤二次。
　　用蒸馏水淋洗膜2 min~5 min，然后用封闭液(不同浓度的BSA,0．1M NaCl，0．2％Triton100，0．1M Tris，pH 7．5)封闭。
　　倒出封闭液，加入用封闭液配制的适当比例稀释的卵白素
　　碱性磷酸酶(购自上海华舜生物工程有限公司)，37 ℃孵育30 min。
　　洗涤液3(0．1M Tris，0．15M NaCl，0．3％Tween20 pH 7．5)在37 ℃洗膜二次，检测缓冲液(0．1M Tris，0．1M NaCl，0．1MMgCl2，pH 9．5)平衡，再以每10 ml检测缓冲液加66　μl NBT和11 μl BCIP(均购自上海华舜生物工程有限公司)的显色液显色。
　　显色结束后以TE终止，用扫描仪获取图像。
　　1．2．2 斑点杂交建立及优化程序
　　1．2．2．1 尼龙膜上不点任何样品，以下述条件行假杂交反应
　　杂交液中探针的终浓度为：200 ng／ml、100 ng／ml、50 ng／ml、10 ng／ml；酶的稀释比例为：1／400、1／800、1／2 000、1／5 000；封闭液中BSA的终浓度为：2％，封闭2 h;杂交后洗涤液1和2分别洗二次，每次1 h;封闭后洗涤液洗二次，每次1 h；检测缓冲液平衡1 h；显色30 min。
　　1．2．2．2 以1．2．2．1所获得的最佳本底，在尼龙膜上点上ppGalNAcT2的cDNA片段，其余条件不变，封闭液中BSA的浓度设计成2％、3％和5％三梯度进行杂交反应。
　　1．2．2．3 以1．2．2．2所获得的最佳条件，改进以下条件
　　杂交后洗涤时间、每次1 h、每次30 min、每次10 min；封闭液封闭时间：2 h、1．5 h、50 min；封闭后洗涤时间、每次1 h、每次40 min、每次20 min；检测缓冲液平衡时间：1 h、30 min、10 min；显色以出现清晰的阳性信号，本底最低为尺度，一般在15 min左右，时间延长本底升高。
　　1．3 斑点杂交法检测K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株pp
　　GalNAcT2的表达差异 NIH3T3成纤维细胞、胃癌细胞株SGC7109、白血病细胞株K562和NB4购自上海生化细胞所；RNA抽提试剂TRIZOL、PCR试剂盒、pUCMixDNA marker和ladder购自lnvitrogen公司，随机引物购自Takara公司。β微球蛋白(内对照)引物采用Genetyx软件设计，并经OenBank Blast同源检索后由上海生工生物技术公司合成。
　　βMG引物序列为：F：5’CTCGTGCTACTCTCTCTTTC3’R：5’CATGTCTCGATCCCACTTAAC3’预期扩增产物长度330 bp。ppGalNAcT2引物为：F：5’GAAAGAATTAGGAAGGGTCAGAAC3’R：5’CTGTGTCAATGTAAACATAGCTC3’预期扩增产物长度为668 bp。
　　采用TRIZOL法抽提K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株RNA，测A260／A280比值和电泳图谱鉴定抽提完整性，测A260定量，六随机引物逆转录制作cDNA。倍比稀释点膜，用ppGalNAcT2特异的寡核苷酸探针与膜杂交：同时以上述获得的K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株cDNA加ppGalNAcT2和βMC正反向引物行RTPCR来验证斑点杂交结果。
　　2 结果
　　尼龙膜上不占任何样品所进行的假杂交反应结果如图1所示，可见以杂交液中探针的终浓度为10 ng/ml,酶的稀释比例为1/5 000时本底最低；以此条件，在尼龙膜上点上ppGaINAcT2的cDNA片段，封闭液中BSA的浓度设计成2%、3%和5%三梯度，其余条件不变的杂交反应结果如图2所示。
　　可见以5%的BSA封闭效果最佳；再以上述确立的条件改进杂交反应各步的时间，以简化实验，如图3所示，可见条件2和条件3体系下的结果都是可以接受的，但条件3更为简化。
　　以上述确立的杂交反应的条件用斑点杂交法检测K562、NB4/NIH3T3和SGC7901细胞株GaINAcT2的表达水平依次为K562白血病细胞胃癌细胞SGC7901NB4白血病细胞，在NIH3T3成纤维细胞中未检测到表达。同时再行RTPCR确证斑点杂交的结果，如图5，图6所示，与斑点杂交的结果一致。3 讨论
我们参照分子克隆［1］和Superarray［2］操作手册，设计并改进预杂交液和杂交液。由于采用带正电荷的尼龙膜为支持介质，在碱性条件下更有利于DNA与膜结合，而预杂交的目的是封闭膜上的非特异性结合部位，因此预杂交液采用pH7．5的PB配制并调终体积：而杂交液中的探针要尽量减少与膜的非特异性杂交，因此杂交液用水来调终体积，pH值控制在6．5左右。同时，对杂交过程中所涉及的每一个步骤及试剂的配制，我们都进行优化，最终所确立优化过程采用自配的预杂交液和杂交液，杂交液中探针浓度为10 ng／ml，杂交后洗涤液1和2各洗涤2次，每次10 min，5％的BSA封闭液封闭50 min，封闭后加酶稀释比为1／5 000，封闭后洗涤液洗二次，每次20 min，检测缓冲液平衡10 ml，显色以出现阳性信号，本底最低为标准。
　　为进一步检验膜杂交条件的可行性，我们用胃腺癌SGC7901细胞、白血病K562、NB4细胞和NIH3T3成纤维细胞的cDNA以一定的稀释比进行斑点杂交，检测ppGalNAcT2在这四种细胞中的差异表达，得到的相对表达水平为：K562白血病细胞胃癌细胞SGC7901NB4白血病细胞，在NIH3T3成纤维细胞中未检测到表达。ppGalNAcT2主要表达于富含粘蛋白的组织细胞中［3］，一般说来，能分泌较多粘蛋白的细胞ppGalNAcT2有较高表达，如正常胃和大肠黏膜，胃癌细胞株SGC7901中ppGalNAcT2 mRNA的表达很高是可以理解的：N1H3T3是一种成纤维细胞，来源于非上皮组织，不分泌粘蛋白，所以其ppGalNAcT2的表达甚低。K562和NB4均是白血病细胞，其ppGalNAcT2表达也较高，其确切的生物学意义有待阐明。虽然我们采用了严谨的洗涤条件，但也不排除杂交液中的探针与cDNA之间发生非特异性杂交，因此对每种细胞的cDNA行ppGalNAcT2特异的RTPCR,以βMG为内对照，对所得的T2和βMG条带扫描定量，比较四种细胞T2的相对表达高低，结果是与斑点杂交一致，证明斑点杂交结果是可信的，其杂交条件是可行的。另外，RTPCR中检测到在NIH3T3细胞中有微量的T2表达，而在斑点杂交中未检出，说明显色法斑点杂交在检测低表达基因的灵敏度上可能还不够，可能需要增加上样量或换用灵敏度更高的显影或检测系统来检测低表达基因的表达水平。但是，增加cDNA上样量会带来相当多的问题，主要是RNA的逆转录的效率，因为增加cDNA上样量必然需要增加逆转录所需的RNA用量。当然，也可以通过几管cDNA浓缩获得，但操作相对繁琐另外，可以直接做RNA的斑点杂交，这样增加RNA上样量相对容易，但RNA容易降解，操作要求高，复杂，不如cDNA的斑点杂交简便，因此，相对可行的方法可能是根据实验所需，采用所建立的cDNA斑点杂交体系，用不同灵敏度的检测系统，如化学发光法、同位素标记法或荧光标记法等检测不同的基因表达。
　　总之，我们成功地建立了cDNA斑点杂交体系，无需特殊的仪器设备，试剂成本低廉：阳性信号清晰，结果可靠，有助于在基因的差异表达等研究中的应用。
　　参考文献：
　　［1］J．萨姆布鲁克，弗里特，T.曼尼阿蒂斯．分子克隆实验指南［M］．北京：科学出版社，1993：362395.
　　［2］http：／／
　　［3］Kudo T，Ikehara Y，Togayachi A，et　of a setglycosyltransferase genes in human colorectat cancer［Ｊ］．Lab lnvest，1998，78(7)：797811.