南华大学生物化学复制.pptx

第三篇第三篇基因信息的传递及其调控基因信息的传递及其调控Transmission and regulation of genetic informationDNADNA是遗传的物质基础是遗传的物质基础1996年克隆羊多莉的年克隆羊多莉的诞生诞生1981年由我国科学家童年由我国科学家童第周研制的克隆鱼第周研制的克隆鱼基因的概念与发展基因的概念与发展l l19441944年，年，年，年，AveryAvery首次证实基因的化学本质是首次证实基因的化学本质是首次证实基因的化学本质是首次证实基因的化学本质是DNADNA。l l19531953年提出了年提出了年提出了年提出了DNADNA双螺旋结构模型。双螺旋结构模型。双螺旋结构模型。双螺旋结构模型。l l1958 Crick1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则。提出遗传信息传递的中心法则。提出遗传信息传递的中心法则。提出遗传信息传递的中心法则。l l6060年代年代年代年代 RNARNA研究取得大发展（操纵子学说研究取得大发展（操纵子学说研究取得大发展（操纵子学说研究取得大发展（操纵子学说,遗传密码遗传密码遗传密码遗传密码,逆转逆转逆转逆转录酶）。录酶）。录酶）。录酶）。JacodJacod和和和和MonodMonod研究细菌基因调控时发现基因是研究细菌基因调控时发现基因是研究细菌基因调控时发现基因是研究细菌基因调控时发现基因是可分的，功能上是有差别的。可分的，功能上是有差别的。可分的，功能上是有差别的。可分的，功能上是有差别的。l l7070年代：建立年代：建立年代：建立年代：建立DNADNA重组技术，改变了分子生物学的面貌，重组技术，改变了分子生物学的面貌，重组技术，改变了分子生物学的面貌，重组技术，改变了分子生物学的面貌，并导致生物技术的兴起。并导致生物技术的兴起。并导致生物技术的兴起。并导致生物技术的兴起。l l8080年代：年代：年代：年代：RNARNA研究出现第二次高潮：研究出现第二次高潮：研究出现第二次高潮：研究出现第二次高潮：ribozymeribozyme、反义、反义、反义、反义RNARNA、“RNARNA世界世界世界世界”假说等等。假说等等。假说等等。假说等等。l l9090年代以后，实施人类基因组计划（年代以后，实施人类基因组计划（年代以后，实施人类基因组计划（年代以后，实施人类基因组计划（HGPHGP）,开辟了生命科开辟了生命科开辟了生命科开辟了生命科学学学学 新纪元。生命科学进入后基因时代新纪元。生命科学进入后基因时代新纪元。生命科学进入后基因时代新纪元。生命科学进入后基因时代基基 因因:指编码蛋白质多肽链或各种指编码蛋白质多肽链或各种RNARNA的的DNADNA功能片功能片段，以及该片段上下游的调控序列。段，以及该片段上下游的调控序列。基因组基因组:一个细胞或病毒颗粒所含全部遗传信息的一个细胞或病毒颗粒所含全部遗传信息的总和。总和。基因的概念与发展基因的概念与发展中中 心心 法法 则则l19581958年年年年CrickCrick提出遗传信息传递的方式提出遗传信息传递的方式提出遗传信息传递的方式提出遗传信息传递的方式-中心法则中心法则中心法则中心法则.l19701970年年年年TeminTemin和和和和BaltimoreBaltimore发现逆转录现象发现逆转录现象发现逆转录现象发现逆转录现象,补充了中补充了中补充了中补充了中心法则心法则心法则心法则.基因表达基因表达第十一章第十一章 DNA的生物合成的生物合成(复制复制)DNA Biosynthesis，Replication本章主要内容本章主要内容l复制的基本规律复制的基本规律lDNADNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化lDNADNA生物合成过程生物合成过程l逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式lDNADNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复复制复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNADNA为模为模板合成子链板合成子链DNADNA的过程。的过程。亲代亲代DNA子代子代DNA复制复制第一节第一节 复制的基本规律复制的基本规律l半半保留复制保留复制(semi-conservative replication)l复制的高保真性复制的高保真性(high fidelity)l双向复制双向复制(bidirectional replication)l半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication)一、半保留复制一、半保留复制DNADNADNADNA复复复复制制制制时时时时，母母母母链链链链DNADNADNADNA解解解解开开开开为为为为两两两两股股股股单单单单链链链链，各各各各自自自自作作作作为为为为模模模模板板板板按按按按碱碱碱碱基基基基配配配配对对对对规规规规律律律律，合合合合成成成成与与与与模模模模板板板板互互互互补补补补的的的的子子子子链链链链。子子子子代代代代细细细细胞胞胞胞的的的的DNADNADNADNA，一一一一股股股股单单单单链链链链从从从从亲亲亲亲代代代代完完完完整整整整地地地地接接接接受受受受过过过过来来来来，另另另另一一一一股股股股单单单单链链链链则则则则完完完完全全全全重重重重新新新新合合合合成成成成。两两两两个个个个子子子子细细细细胞胞胞胞的的的的DNADNADNADNA都都都都和和和和亲亲亲亲代代代代DNADNADNADNA碱碱碱碱基基基基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。序列一致。这种复制方式称为半保留复制。序列一致。这种复制方式称为半保留复制。序列一致。这种复制方式称为半保留复制。（一）（一）概念概念概念概念:AAGGGGT TAAC CT TGGC CC CAAC CT TGGGGT TC CC CAAT TGGAAC CGGGGT TGGAAC CC CC CC CAAC CT TGGGGGGGGT TGGAAC CC CAAGGGGT TAAC CT TGGT TC CC CAAT TGGAAC CT TC CC CAAT TGGAAC CAAGGGGT TAAC CT TGGAAGGGGT TAAC CT TGGC CC CAAC CT TGGGGT TC CC CAAT TGGAAC CGGGGT TGGAAC CC CAGGTACTGCCACTGGT TC CC CAAT TGGAAC CGGGGT TGGAAC CC C+母链母链母链母链DNADNA 复制过程中形成复制过程中形成复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉的复制叉的复制叉子代子代子代子代DNADNA 19531953年年年年,Waston,Waston 和和和和CrickCrick即已提出即已提出即已提出即已提出DNADNA半保留复制的假设半保留复制的假设半保留复制的假设半保留复制的假设子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式全保留式全保留式 半保留式半保留式半保留式半保留式 混合式混合式混合式混合式 （二）半保留复制的实验依据（二）半保留复制的实验依据（二）半保留复制的实验依据（二）半保留复制的实验依据19581958年年年年MesselsonMesselson和和和和StahlStahl进行密度梯度实验证实了半保留复进行密度梯度实验证实了半保留复进行密度梯度实验证实了半保留复进行密度梯度实验证实了半保留复制假说制假说制假说制假说.含重氮含重氮含重氮含重氮-DNADNADNADNA的细菌的细菌的细菌的细菌培养于普培养于普培养于普培养于普通培养液通培养液通培养液通培养液 第一代第一代第一代第一代继续培养于继续培养于继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液普通培养液普通培养液 第二代第二代第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果梯度离心结果梯度离心结果普通普通普通普通DNADNADNADNA重重重重DNADNADNADNA普通普通普通普通DNADNADNADNA普通普通普通普通DNADNADNADNA重重重重DNADNADNADNA重重重重DNADNADNADNA半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。但不是绝对的。但不是绝对的。但不是绝对的。半半半半保保保保留留留留复复复复制制制制保保证证亲亲代代的的遗遗传传特特征征完完整整无无误误的的传传递递给给子子代代，体体体体现现现现了了了了遗遗遗遗传传传传的的的的保保保保守守守守性性性性,保保保保证证证证了了了了物物物物种种种种的延续和遗传的稳定。的延续和遗传的稳定。的延续和遗传的稳定。的延续和遗传的稳定。原核生物复制时，原核生物复制时，原核生物复制时，原核生物复制时，DNADNADNADNA从起始点从起始点从起始点从起始点(originorigin)向两向两向两向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。为双向复制。为双向复制。为双向复制。复制中的放射自显影图像复制中的放射自显影图像复制中的放射自显影图像复制中的放射自显影图像二、双向复制二、双向复制复制叉：复制叉：复制叉：复制叉：DNADNADNADNA双链解开成为两股单链，各自作为模双链解开成为两股单链，各自作为模双链解开成为两股单链，各自作为模双链解开成为两股单链，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的板，子链沿模板延长所形成的板，子链沿模板延长所形成的板，子链沿模板延长所形成的Y Y字形结构。字形结构。字形结构。字形结构。A.A.A.A.环状双链环状双链环状双链环状双链DNADNADNADNA及复制起始点及复制起始点及复制起始点及复制起始点B.B.B.B.复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C.C.C.C.复制接近终止点复制接近终止点复制接近终止点复制接近终止点(termination,ter)termination,ter)oriterA B CA B Cl原核生物只有一个复制的起始点，是单复制子完原核生物只有一个复制的起始点，是单复制子完原核生物只有一个复制的起始点，是单复制子完原核生物只有一个复制的起始点，是单复制子完成复制。成复制。成复制。成复制。l真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子 的复制。的复制。的复制。的复制。5 5 3 3 oriorioriorioriorioriori5 5 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 复制子复制子复制子复制子5 5 5 5 3 3 3 3 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子复制子复制子复制子。复。复。复。复制子是独立完成复制的功能单位。制子是独立完成复制的功能单位。制子是独立完成复制的功能单位。制子是独立完成复制的功能单位。三、复制的半不连续性三、复制的半不连续性3 3 3 3 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 解链方向解链方向解链方向解链方向3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 5 5 5 5 领头链领头链领头链领头链随从链随从链随从链随从链岗崎片断岗崎片断岗崎片断岗崎片断解螺旋酶解螺旋酶顺顺顺顺着着着着解解解解链链链链方方方方向向向向生生生生成成成成的的的的子子子子链链链链，复复复复制制制制是是是是连连连连续续续续进进进进行行行行的的的的，这股链称为这股链称为这股链称为这股链称为领头链领头链领头链领头链(leading strand)leading strand)。另另另另一一一一股股股股链链链链因因因因为为为为复复复复制制制制的的的的方方方方向向向向与与与与解解解解链链链链方方方方向向向向相相相相反反反反，不不不不能能能能顺顺顺顺着着着着解解解解链链链链方方方方向向向向连连连连续续续续延延延延长长长长，这这这这股股股股不不不不连连连连续续续续复复复复制制制制的的的的链链链链称称称称为为为为随随随随从从从从链链链链(lagged lagged strand)strand)。复复复复制制制制中中中中的的的的不不不不连连连连续续续续片片片片段段段段称为称为称为称为岡崎片段岡崎片段岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)okazaki fragment)。领领领领头头头头链链链链连连连连续续续续复复复复制制制制而而而而随随随随从从从从链链链链不不不不连连连连续续续续复复复复制制制制，就就就就是是是是复复复复制制制制的的的的半不连续性半不连续性半不连续性半不连续性。参与参与DNADNA复制的物质复制的物质 1.1.1.1.底物底物底物底物:d d d dATP,dGTP,dCTP,dTTPATP,dGTP,dCTP,dTTPATP,dGTP,dCTP,dTTPATP,dGTP,dCTP,dTTP2.2.2.2.聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶:依赖依赖依赖依赖DNADNADNADNA的的的的DNADNADNADNA聚合酶，简写为聚合酶，简写为聚合酶，简写为聚合酶，简写为DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol3.3.3.3.模板模板模板模板:解开成单链的解开成单链的解开成单链的解开成单链的DNADNADNADNA母链母链母链母链4.4.4.4.引物引物引物引物:提供提供提供提供3 3 3 3 -OH-OH-OH-OH末端使末端使末端使末端使dNTPdNTPdNTPdNTP可以依次聚合可以依次聚合可以依次聚合可以依次聚合 5.5.5.5.其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子第二节第二节 DNADNA复制的酶学复制的酶学一、复制的化学反应一、复制的化学反应 (dNMP)(dNMP)n n +dNTP (dNMP)dNTP (dNMP)n+1n+1 +PPi PPi GAT1.DNA 1.DNA 新链生成需引物和模板；新链生成需引物和模板；2.2.新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 5 3 3 方向进行。方向进行。3.3.新链的合成遵循碱基互补配对规律。新链的合成遵循碱基互补配对规律。聚合反应的特点聚合反应的特点:二、二、DNADNA聚合酶聚合酶酶活性：酶活性：酶活性：酶活性：1 1 1 1.5 5 5 53 3 3 3 的聚合活性的聚合活性的聚合活性的聚合活性 2.2.2.2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性 全称：依赖全称：依赖全称：依赖全称：依赖DNADNA的的的的DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶(DNA-DNA-dependent DNA polymerase)dependent DNA polymerase)简称：简称：简称：简称：DNA-polDNA-pol5 5 5 53 3 3 3 外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性-能切除突变的能切除突变的能切除突变的能切除突变的DNADNADNADNA片段。片段。片段。片段。3 3 3 35 5 5 5 外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性-能辨认错配的碱基对能辨认错配的碱基对能辨认错配的碱基对能辨认错配的碱基对,并将其水并将其水并将其水并将其水解。解。解。解。（一）原核生物的（一）原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 3 3 3 5 5 5 5 外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性 5 5 5 5 3 3 3 3 外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的能切除突变的能切除突变的 DNADNADNADNA片段。片段。片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性核酸外切酶活性 l5 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性lDNADNA聚合酶活性聚合酶活性 l5 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶大片段大片段大片段大片段/Klenow/Klenow 片段片段片段片段604aa604aa604aa604aa 小片段小片段小片段小片段323aa323aa323aa323aa原核生物原核生物DNADNA聚合酶的功能聚合酶的功能DNApol 对复制中的错误进行校读，对复制对复制中的错误进行校读，对复制对复制中的错误进行校读，对复制对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。和修复中出现的空隙进行填补。和修复中出现的空隙进行填补。和修复中出现的空隙进行填补。Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常，进行分子生物学研究中常用的工具酶。用的工具酶。DNA-pol 1.1.1.1.DNA-pol IIDNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。2.2.2.2.它参与它参与它参与它参与DNADNADNADNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。是原核生物复制延长中是原核生物复制延长中是原核生物复制延长中是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶真正起催化作用的酶真正起催化作用的酶真正起催化作用的酶。DNA-pol （二）真核生物的（二）真核生物的DNA聚合酶聚合酶延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。口的作用。口的作用。在线粒体在线粒体在线粒体在线粒体DNADNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。确传代的基本原理。确传代的基本原理。确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制：（一）（一）（一）（一）DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读 （二）复制的保真性和（二）复制的保真性和（二）复制的保真性和（二）复制的保真性和DNA-polDNA-pol对对对对碱基选择碱基选择碱基选择碱基选择三、复制保真性的酶学依据三、复制保真性的酶学依据A A A A：DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的性掺入正确配对的性掺入正确配对的性掺入正确配对的碱基碱基碱基碱基。B B B B：碱基配对正确，碱基配对正确，碱基配对正确，碱基配对正确，DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol不表现活性。不表现活性。不表现活性。不表现活性。（一）（一）（一）（一）DNA-polDNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读 DNADNADNADNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。（磷酸二酯键）键的有序形成。（磷酸二酯键）键的有序形成。（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。（二）复制的保真性和聚合酶对碱基选择（二）复制的保真性和聚合酶对碱基选择（二）复制的保真性和聚合酶对碱基选择（二）复制的保真性和聚合酶对碱基选择DNADNA复制的保真性至少要依赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制 1.1.1.1.遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2.2.2.2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.3.3.3.复制出错时复制出错时复制出错时复制出错时DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。的及时校读功能。的及时校读功能。四、复制中的分子解链及四、复制中的分子解链及DNADNA分子拓扑学变化分子拓扑学变化 （一）解螺旋酶、引物酶和单链（一）解螺旋酶、引物酶和单链（一）解螺旋酶、引物酶和单链（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNADNADNADNA结合蛋白结合蛋白结合蛋白结合蛋白l解螺旋酶解螺旋酶解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用利用利用ATPATPATPATP供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使DNADNADNADNA双链解开双链解开双链解开双链解开成为两条单链。成为两条单链。成为两条单链。成为两条单链。l引物酶引物酶引物酶引物酶(primase)复制起始时催化生成复制起始时催化生成复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNARNARNARNA引物的酶。引物的酶。引物的酶。引物的酶。l单链单链单链单链DNADNADNADNA结合蛋白结合蛋白结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链在复制中维持模板处于单链状态并保护单链在复制中维持模板处于单链状态并保护单链在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。的完整。的完整。的完整。（二）（二）DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶1010 8 8 局部解链后局部解链后局部解链后局部解链后拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键分分 类类 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶切断切断切断切断DNADNADNADNA双链中双链中双链中双链中一股一股一股一股链，使链，使链，使链，使DNADNADNADNA解链旋转解链旋转解链旋转解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，不致打结；适当时候封闭切口，不致打结；适当时候封闭切口，不致打结；适当时候封闭切口，DNADNADNADNA变变变变为松弛状态为松弛状态为松弛状态为松弛状态。反应反应反应反应不需不需不需不需ATPATPATPATP。切断切断切断切断DNADNADNADNA分子两股链，断端通过切口旋分子两股链，断端通过切口旋分子两股链，断端通过切口旋分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。转使超螺旋松弛。转使超螺旋松弛。转使超螺旋松弛。利用利用利用利用ATPATPATPATP供能，连接断端，供能，连接断端，供能，连接断端，供能，连接断端，DNADNADNADNA分子进分子进分子进分子进入负超螺旋状态。入负超螺旋状态。入负超螺旋状态。入负超螺旋状态。五、五、DNADNA连接酶连接酶连连连连接接接接DNADNADNADNA链链链链3 3 3 3 -OH-OH-OH-OH末末末末端端端端和和和和相相相相邻邻邻邻DNADNADNADNA链链链链5 5 5 5 -P-P-P-P末末末末端端端端，使使使使二二二二者者者者生生生生成成成成磷磷磷磷酸酸酸酸二二二二酯酯酯酯键键键键，从从从从而而而而把把把把两两两两段段段段相相相相邻邻邻邻的的的的DNADNADNADNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。DNADNA连接酶作用方式连接酶作用方式:HO5 5 3 3 3 35DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶ATPATPADPADP5 5 35 5 3 3 l DNA DNA DNA DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。l 在在在在DNADNADNADNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。l 也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。DNADNA连接酶的生理功能连接酶的生理功能一、原核生物的一、原核生物的DNADNA生物合成生物合成 复制的起始复制的起始复制的延长复制的延长复制的终止复制的终止第三节第三节 DNADNA生物合成过程生物合成过程（一）复制的起始（一）复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：需要解决两个问题：需要解决两个问题：1 1 1 1.DNADNADNADNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2.2.2.2.合成引物，提供合成引物，提供合成引物，提供合成引物，提供3 3 3 3 -OH-OH-OH-OH末端。末端。末端。末端。E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG.1 13 17 29 32 441 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1 1.DNADNA解链解链解链过程主要由解链过程主要由解链过程主要由解链过程主要由DnaA,DnaBDnaA,DnaB（解螺旋酶）（解螺旋酶）（解螺旋酶）（解螺旋酶）,DnaC,DnaC这三这三这三这三种蛋白质共同参与完成种蛋白质共同参与完成种蛋白质共同参与完成种蛋白质共同参与完成.DnaADnaADnaBDnaBDnaCDnaC2 2.引发体的生成和引物引发体的生成和引物引发体引发体引发体引发体:在复制起始阶段，形成的含有解螺旋酶在复制起始阶段，形成的含有解螺旋酶在复制起始阶段，形成的含有解螺旋酶在复制起始阶段，形成的含有解螺旋酶（DnaBDnaB）、DnaCDnaC蛋白、引物酶（蛋白、引物酶（蛋白、引物酶（蛋白、引物酶（DnaGDnaG）和）和）和）和DNADNA复制起复制起复制起复制起始区域的复合结构。始区域的复合结构。始区域的复合结构。始区域的复合结构。Dna BDna B、Dna CDna CDNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶SSBSSB3 3 5 5 3 3 5 5 引物酶引物酶引物酶引物酶引物：引物：引物：引物：是由引物酶催化合成的短链是由引物酶催化合成的短链是由引物酶催化合成的短链是由引物酶催化合成的短链RNARNARNARNA分子，长度一分子，长度一分子，长度一分子，长度一般为十几个至数十个核苷酸，合成方向为般为十几个至数十个核苷酸，合成方向为般为十几个至数十个核苷酸，合成方向为般为十几个至数十个核苷酸，合成方向为5 5 5 5 3333。3 5 3 5 引物引物引物引物3 HO5引引物物酶酶引引物物酶酶引引物物酶酶55（二）复制的延长（二）复制的延长复复制制的的延延长长指指在在DNA-polDNA-pol催催化化下下，底底物物dNTPdNTP以以dNMPdNMP的的方方式式逐逐个个加加到到引引物物或或延延长长中中的的子子链链上上，其其化化学学本本质质是是磷磷酸酸二二酯酯键键的的不不断断生生成成。dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP 5 5 3 35 53OH3 3DNA-polDNA-pol领头链的合成领头链的合成随从链的合成随从链的合成复复制制过过程程简简图图原核生物基因是环状原核生物基因是环状原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNADNADNADNA，双向复制的复制片，双向复制的复制片，双向复制的复制片，双向复制的复制片段在复制的终止点段在复制的终止点段在复制的终止点段在复制的终止点(ter)(ter)(ter)(ter)处汇合。处汇合。处汇合。处汇合。orioriterterE.coliE.coliE.coliE.coli8282828232323232 oriori terterSV40SV40SV40SV40505050500 0 0 0（三）复制的终止（三）复制的终止 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接5 5 5 5 5 5 RNARNA酶酶酶酶OHOHP P5 5 DNA-pol DNA-pol dNTPdNTP5 5 5 5 P PATPATP ADP+PiADP+Pi5 5 5 5 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶逆转录逆转录逆转录逆转录(reverse transcription):reverse transcription):RNA指导下的指导下的DNA合成过程合成过程,催化此反应的酶为逆转录酶催化此反应的酶为逆转录酶(reversereverse transcriptase).transcriptase).一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶第四节第四节 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式逆转录病毒细胞内的逆转录过程逆转录病毒细胞内的逆转录过程RNARNARNARNA模板模板模板模板逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶DNA-RNADNA-RNADNA-RNADNA-RNA杂化双链杂化双链杂化双链杂化双链RNARNARNARNA酶活性酶活性酶活性酶活性单链单链单链单链DNADNADNADNADNADNA作模板的作模板的作模板的作模板的dNTPdNTP聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性双链双链双链双链DNADNADNADNA逆转录酶有三种活性：逆转录酶有三种活性：逆转录酶有三种活性：逆转录酶有三种活性：RNARNARNARNA或或或或DNADNADNADNA作模板的作模板的作模板的作模板的dNTPdNTPdNTPdNTP聚合酶活性和聚合酶活性和聚合酶活性和聚合酶活性和RNaseRNaseRNaseRNase活性。活性。活性。活性。逆转录酶逆转录酶 AAAAAA TTTTTTAAAAAASISI核酸酶核酸酶 DNADNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 TTTTTT分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为基因的重要方法之一，此法称为cDNAcDNA法。法。以以mRNAmRNA为模板，经逆转录为模板，经逆转录合成的与合成的与mRNAmRNA碱基序列互补的碱基序列互补的DNADNA链。链。cDNA complementary DNA 试管内试管内cDNA合成合成*二、逆转录研究的意义二、逆转录研究的意义 l逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。重大发现。重大发现。重大发现。l逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNARNARNARNA同样兼同样兼同样兼同样兼有遗传信息传代与表达功能。有遗传信息传代与表达功能。有遗传信息传代与表达功能。有遗传信息传代与表达功能。l对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20202020世纪初已注意到世纪初已注意到世纪初已注意到世纪初已注意到的病毒致癌理论。的病毒致癌理论。的病毒致癌理论。的病毒致癌理论。l逆转录酶和逆转录现象，作为获取基因工程中目逆转录酶和逆转录现象，作为获取基因工程中目逆转录酶和逆转录现象，作为获取基因工程中目逆转录酶和逆转录现象，作为获取基因工程中目的基因的重要方法之一。的基因的重要方法之一。的基因的重要方法之一。的基因的重要方法之一。突变突变突变突变(mutation)mutation)：遗传物质的结构改变而引遗传物质的结构改变而引遗传物质的结构改变而引遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。起的遗传信息改变，均可称为突变。起的遗传信息改变，均可称为突变。起的遗传信息改变，均可称为突变。从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNADNADNADNA分子上碱基的改变。分子上碱基的改变。分子上碱基的改变。分子上碱基的改变。在复制过程中发生的在复制过程中发生的在复制过程中发生的在复制过程中发生的DNADNADNADNA突变称为突变称为突变称为突变称为DNADNADNADNA损伤损伤损伤损伤(DNA DNA damage)damage)。第五节第五节 DNADNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复一、突变的意义一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础二、引发突变的因素二、引发突变的因素1.1.1.1.物理因素物理因素物理因素物理因素 紫外线、各种辐射。紫外线、各种辐射。紫外线、各种辐射。紫外线、各种辐射。UV2.2.2.2.化学因素化学因素化学因素化学因素稠环芳香烃稠环芳香烃稠环芳香烃稠环芳香烃硝基胺和芳香胺硝基胺和芳香胺硝基胺和芳香胺硝基胺和芳香胺某些药物某些药物某些药物某些药物变质食物变质食物变质食物变质食物无机物无机物无机物无机物化学因素化学因素三、突变的分子改变类型三、突变的分子改变类型错配错配错配错配 (mismatch)(mismatch)缺失缺失缺失缺失 (deletion)(deletion)插入插入插入插入 (insertion)(insertion)重排重排重排重排 (rearrangement)(rearrangement)框移框移框移框移(frame-sh