现代生物技术概述.pptx

第九章第九章 现代生物技术概述现代生物技术概述生物技术生物技术(biotechnology)：是指应用生命科学和工程学的基本原理及其相关技术对微生物、动物或植物等有机体进行人口操作或改造，以实现人类某些特殊需求的综合性技术体系.现代生物技术是解决人类面临的困境的有效途径现代生物技术是解决人类面临的困境的有效途径一一.基因工程技术基因工程技术二二.细胞培养细胞培养三三.模式动物模式动物基因工程（基因工程（gene engineeringgene engineering）：是指是指以获得某种特定蛋白质产品为以获得某种特定蛋白质产品为目的，与其相应的基因克隆、重组、目的，与其相应的基因克隆、重组、表达以及其表达产物的分离纯化的表达以及其表达产物的分离纯化的技术体系技术体系。James Watson and Francis Crick with the original model of DNA in 1953.DNA双螺旋胰岛素结构胰岛素结构人胰岛素由A、B两个肽链组成，A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸，A、B两链通过二硫键连接起来。胰岛素生物合成胰岛素生物合成1.首先翻译出由105个氨基酸残基构成的前胰岛素原；前胰岛素原；2.前胰岛素原前胰岛素原进入内质网腔，切割，除去信号肽，生成86个氨基酸组成的胰岛素原；胰岛素原；3.胰岛素原胰岛素原进入高尔基体，经蛋白水解酶的作用，切去31个氨基酸的 C肽，生成成熟的胰岛素胰岛素。基因工程胰岛素（一）基因工程胰岛素（一）胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。胰岛素分子立体结构基因工程胰岛素（二）将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!胰岛素生产车间怎样利用大肠杆菌生产人胰岛素？怎样利用大肠杆菌生产人胰岛素？先获得人胰岛素基因，接着将人胰岛素基因转入大肠杆菌中，再在大肠杆菌中实现人胰岛素基因的表达。可分为几个阶段：可分为几个阶段：要实现该过程，通常要具备哪些基本要素？要实现该过程，通常要具备哪些基本要素？工具酶、目的基因、载体、宿主细胞等获得目的基因（人胰岛素基因）形成重组DNA分子将重组DNA分子导入受体细胞（大肠杆菌）筛选含有目的基因的受体细胞目的基因的表达利用大肠杆菌生产人胰岛素利用大肠杆菌生产人胰岛素(一一)、工具酶、工具酶n限制性内切酶限制性内切酶nDNADNA聚合酶聚合酶nDNADNA连接酶连接酶n碱性磷酸酶 n核酸酶 什么是限制性核酸内切酶？作用是什么什么是限制性核酸内切酶？作用是什么？限制性核酸内切酶如何识别切割限制性核酸内切酶如何识别切割DNA分子？分子？限制性核酸内切酶的发现对于基因工程有何意义？限制性核酸内切酶的发现对于基因工程有何意义？它是能够识别和切割DNA分子内某段特殊核苷酸序列的酶。作用是识别和切割特殊的核苷酸序列。识别特殊的核苷酸序列，如：GAATTC或AAGCTT；限制性核酸内切酶是分子剪刀，能把DNA分子切割成许多不同片段，得到我们所需要的目的基因，使DNA重组成为可能。限制性内切酶限制性内切酶(Restrictionendonucleases)命名命名属名属名(genus)的第一个字母，用大写表示的第一个字母，用大写表示种名种名(species)的前两个字母，用小写表示的前两个字母，用小写表示细菌株名细菌株名(strain)，用大写或小写表示用大写或小写表示同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，用罗马字表示。同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，用罗马字表示。II型型限制性内切酶限制性内切酶同一细菌株中不同的限制性同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，内切酶被发现和分离的顺序，用罗马字表示用罗马字表示属名属名(大写大写)EcoRI种名种名(小写小写)细菌株名细菌株名(大写大写)Escherichia属属coli种种R株株II型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶-基因的剪刀基因的剪刀特点：特点：n 特异性特异性(专一性专一性).即识别特定的核苷酸序列（48碱基）n识别回文结构识别回文结构n碱基被甲基化修饰后影响切割碱基被甲基化修饰后影响切割回文结构回文结构(palindrome)是双链DNA分子中的反向重复结构，即每条链从53方向读其核苷酸序列都相同。5GGATCC35GAA TTC 33CCTAGG 53CTTAAG 5 5AGATCT35CCCGGG33TCTAGA53GGGCCC5什么叫什么叫粘粘性末端性末端？当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫粘性末端。EcoRI粘性末端什么叫平末端？什么叫平末端？当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口是平整切口是平整的，这样的切口叫平末端。SmaI酶活性单位酶活性单位：在37C(某些限制性内切酶用25C或50C)条件下，每1小时酶切1gDNA所用的酶量。II型限制性内切酶的型限制性内切酶的反应条件反应条件常用的酶反应体系为常用的酶反应体系为50 l，即，即:10X缓冲液缓冲液5 lDNA2 g限制性内切酶限制性内切酶(10U/l)0.5 lddH2O42.5 lBamHI在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性星号活性。NotI不同限制性内切酶消化的电泳图谱不同限制性内切酶消化的电泳图谱(A)BamHI(B)PstI(C)BglII(D)HaeIII(E)HincII(F)SacI(G)XbaI(H)HpaI(I)DNA/HindIII+-nTaqDNA聚合酶聚合酶以脱氧核苷酸三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、或dTTP，四者统称dNTPs）为底物，沿模板的35方向，将对应的脱氧核苷酸连接到新生DNA链的3端，使新生链沿53方向延长。新链与原有的模板链序列互补，亦与模板链的原配对链序列一致。特点：需要模板合成方向为53DNA聚合酶（聚合酶（DNApolymerase）美国Yellowstone公园的温泉嗜热水生细菌Thermus aquaticus PCR是利用热稳定DNA聚合酶在体外快速扩增(复制)某一特定DNA片段的方法。KaryB.Mullis1983发明PCR技术1993获得诺贝尔化学奖聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)PCR过程1.模板变性(Denaturation)双链DNA模板在95C变性为单链DNA。2.引物退火(Annealing)引物与单链DNA互补并退火。3.延伸反应(Extention)耐热的DNA聚合酶催化子链的合成。缓冲液(Tris-HCl,KCl)MgCl2或MgSO4DNA模板上游引物(upstreamprimer,senseprimer)下游引物(downstreamprimer,antisenseprimer)底物dNTPs热稳定 DNA聚合酶PCR反应体系反应体系PCR产物的电泳检测PCR产物PCR产物+-反转录酶反转录酶(Reversetranscriptase，RT)反转录酶反转录酶是一类存在于部分RNA病毒中具有反转录活性、能以单链RNA为模板合成DNA的酶。由反转录酶催化合成的DNA称为互补DNA（complementaryDNA,cDNA）。连接的部位：是磷酸二酯键磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）DNADNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase)“分子缝合针分子缝合针”主要用于DNA片段之间的连接，将一个DNA片段的5端的磷酸与另一个DNA片段的3 端的羟基连接成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。T4DNA连接酶连接酶,ATPTGCTTAA5-3-ACG-OH3-P5AATTCGTGCA-3-55P-3OH-TGCTTAA5-3-ACG AATTCGTGCA-3-5T4（噬菌体）（噬菌体）DNA连接酶连接酶(T4DNAligase)催化催化DNA的的3-OH和和5-P之间形成之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键连接连接带带粘性末端粘性末端的两个的两个DNA分子分子T4DNA连接酶连接酶,ATPACG5-3-TGC-OH3-P5TAGCCGTATCGGCA-3-55P-3OH-5-3-TGCTAGCCGTACGATCGGCA-3-5连接连接带带平末端平末端的两个的两个DNA分子分子T4DNA连接酶连接酶外源基因外源基因(如人胰岛素基因如人胰岛素基因)怎样才能导入受体细胞怎样才能导入受体细胞(如大肠杆菌如大肠杆菌)？导入过程需要运输工具载体。假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？作为载体必须具备的条件：作为载体必须具备的条件：1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗生素抗性基因等(二二)载体载体(vector)(vector)抗生素抗生素的作用位点的作用位点抗生素抗生素抗性基因的产物抗性基因的产物及其功能及其功能质粒是什么？为什么它能作为转基因的载体？细胞染色体外能自主复制的小型双链小型双链环状环状DNA分子分子。质粒的存在对宿主细胞无影响，它常含有抗生素抗性基因。复制元件复制元件多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点(multiplecloningsite;polycloningsite;MCS)：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。克隆载体克隆载体(Cloningvector)用于构建基因组文库、用于构建基因组文库、cDNA文库以及克隆某一特定基因文库以及克隆某一特定基因或或cDNA以测定其核苷酸序列。以测定其核苷酸序列。表达载体表达载体(Expressionvector)用于表达某一基因或用于表达某一基因或cDNA以获得目的蛋白质。以获得目的蛋白质。包括原核表达载体和真核表达载体，表达载体的种类较多，包括原核表达载体和真核表达载体，表达载体的种类较多，可根据要表达的目的蛋白质的特点来选则载体。可根据要表达的目的蛋白质的特点来选则载体。ApR:Ampicillinresistancegenerep(ori):replicationoriginlacZ:N-terminal-galactosidaseMCS:multiplecloningsitesMCS(pUC18)cDNA cDNA文库文库存在于转化细胞内由克隆载存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有体所携带的所有组织或细胞组织或细胞cDNAcDNA片段的集合片段的集合。1.1.从从总总cDNAcDNA文库中获取目的基因文库中获取目的基因（三三）目的基因的获取目的基因的获取根据目的基因的核苷酸序列，设计合适的引物，扩增获得目的基因片段。3 3.用用PCRPCR技术从基因组技术从基因组DNADNA中分离中分离 2 2.从基因组从基因组DNADNA文库中分离文库中分离 4 4.人工合成人工合成（四）宿主细胞原核细胞：大肠杆菌真核细胞：酵母、哺乳动物细胞大肠杆菌表达系统大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优越性：优越性：对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解；达的调控机理已有了深刻了解；商品化的载体和菌株种类非常齐全；商品化的载体和菌株种类非常齐全；表达效率高；表达效率高；易培养，成本低。易培养，成本低。缺点：缺点：蛋白质不能糖基化；蛋白质不能糖基化；其内毒素很难除去；其内毒素很难除去；因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包涵体。因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包涵体。酵母表达系统优越性：优越性：蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白；蛋白；易培养，成本低易培养，成本低,可高密度发酵可高密度发酵；易于外源基因操作易于外源基因操作。缺点：缺点：糖基化与哺乳动物有所差别；糖基化与哺乳动物有所差别；培养上清多糖浓度高，不利于纯化。培养上清多糖浓度高，不利于纯化。哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。优越性：优越性：糖基化与人源蛋白一致；糖基化与人源蛋白一致；能表达天然结构的完整蛋白，活性很高；能表达天然结构的完整蛋白，活性很高；可进行分泌表达。可进行分泌表达。缺点：缺点：表达量低；表达量低；培养成本很高，操作繁琐。培养成本很高，操作繁琐。大肠杆菌：大肠杆菌：化学法化学法 酵母细胞：酵母细胞：化学法和化学法和电穿孔法转化电穿孔法转化 哺乳动物细胞：转染和感染哺乳动物细胞：转染和感染(1)转染转染CaPO4/DNA共沉淀法共沉淀法脂质体法脂质体法电穿孔法电穿孔法显微注射法显微注射法(2)病毒感染病毒感染用携带目的基因的用携带目的基因的“病毒病毒”颗粒感染宿主细胞颗粒感染宿主细胞表达载体导入宿主细胞的方法表达载体导入宿主细胞的方法用氯化钙化学转化用氯化钙化学转化电穿孔法电穿孔法显微注射法显微注射法脂质体脂质体-DNA复合物脂质体脂质体DNA检测目的基因是否进入受体细胞重组质粒标记基因（青霉素抗性基因）目的基因 利用选择培养基检测标记基因。如果标记基因被检测到了，那么说明目的基因也进入了受体细胞。筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞获得目的基因（从cDNA文库或基因组中获得）形成重组DNA分子同一种限制酶切割质粒，再用DNA连接酶把目的基因和质粒重组起来。将重组DNA分子导入受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞目的基因的表达二、体外细胞培养二、体外细胞培养n细胞培养细胞培养(cell culture):(cell culture):即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象，此时，这种 被 选 定 的 生 物 物 种 就 是 模模 式式 生生 物物（ModelOrganisms）。三、模式动物三、模式动物最常见的模式动物秀丽隐杆线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)黑腹果蝇黑腹果蝇(Drosophila melanogaster,D.melanogaster)斑马鱼斑马鱼(Danio rerio,D.rerio)小鼠小鼠(Mus musculus,M.musculus)模式生物应具备以下特点：1）其生理特征能够代表生物界的某一大类群；2）容易获得并易于在实验室内饲养、繁殖；3）容易进行实验操作，特别是遗传学分析。秀丽线虫线虫细胞核均被染色秀丽线虫解剖结构（雌雄同体）C.elegans基本解剖构造包括口口、咽咽、肠肠和和性性腺腺等。有雄性及雌雌雄雄同同体体两种性别，雌雄同体有两个卵巢、输卵管、藏精器及单一子宫。绝大多数个体为雌雄同体，雄性仅占0.05%。生命周期：生命周期：雌雄同体个体产卵孵化后，经历四个幼虫期（L1-L4）。当族群拥挤或食物不足时，C.elegans会进入另一种幼虫期，叫做dauer幼虫。Dauer能对抗逆境，而且不会老化。在实验室20的环境下，C.elegans平均寿命为二、三周，而发育一个世代仅约为4天。秀丽线虫生活史小线虫孕育大发现小线虫孕育大发现在在2002年年，诺诺贝贝尔尔生生理理医医学学奖奖颁颁发发给给SydneyBrenner、H.RobertHorvitz和和JohnSulston以以表表扬扬他他们们通通过过对对C.elegans的的研研究究揭揭示示细细胞胞的的程程序序性性死死亡亡机机制制及及器器官官发发育育遗遗传传学的贡献。学的贡献。u在秀丽线虫的发育过程中，总共产生了1,090个细胞，但是最终的成体却只有959个细胞，而其余的131个则在发育的过程中因受到调控而死亡。SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnSulston果蝇果蝇n果蝇在25时，从卵到成蝇需10天左右。n成虫可活2033天。1.1.卵卵 2.2.一龄幼虫一龄幼虫 3.3.二龄幼虫二龄幼虫 4.4.三龄幼虫三龄幼虫 5.5.蛹蛹 6.6.成虫成虫 果蝇生长周期果蝇生长周期1摩尔根利用果蝇证实了孟德尔定律，而且发现了果蝇白眼突变的性连锁遗传，提出了基因在染色体上直线排列以及连锁交换定律1933年因此被授予诺贝尔奖。21946年，摩尔根的学生，被誉为“果蝇的突变大师”的米勒，证明射线能使果蝇的突变率提高150倍，因而成为诺贝尔奖获得者。31995年，诺贝尔奖再次授予三位在果蝇研究中刘易斯、尼尔森沃哈德和维斯郝斯。他们发现了早期胚胎发育的遗传控制。小果蝇成就大梦想小果蝇成就大梦想斑马鱼斑马鱼斑马鱼的发育过程斑马鱼的发育过程斑马鱼的遗传操作斑马鱼的遗传操作斑马鱼的轴突束和神经纤维网小鼠小鼠小鼠生长周期小鼠生长周期u1902年哈佛大学的Castle在孟德尔遗传学研究的影响下开始小鼠的遗传学研究；u1982年首次报道了携带有外源基因的转基因鼠；u1998年在克隆羊Dolly羊出生后1年，克隆小鼠在夏威夷诞生；u2002年小鼠基因组全序列测序完成，从2005年开始，大规模的基因删除研究开始在美国、欧盟和加拿大实施。TheJacksonLaboratoryisbasedinBarHarbor,MaineThe Jackson Laboratory建立于1929年，是一个从事基于小鼠的生物医学研究的非赢利性独立研究机构。The Jackson Laboratory作为全球小鼠模型资源中心，拥有全世界品系最丰富的小鼠资源库。至2009年，拥有4000多个品系的实验小鼠JAXMice。The Jackson Laboratory小老鼠促成大科学小老鼠促成大科学小鼠是哺乳动物，与人的亲缘关系比较近，其解剖学结构、发育过程、生化代谢途径都与人接近，为人类疾病的克隆提供了极佳的实验材料。作为经典的医学实验动物，小鼠已经对医学诸多领域的研究作出了卓越贡献。目前，全世界每天约有2500万只小鼠被用于生物医学研究，以小鼠为对象的研究已经获得了17项诺贝尔奖。