HPLC测定牛奶和虾仁中氯霉素残留.pdf

建立 了一种检 测虾仁 和牛奶 中氯霉素残留的 高效液相 色谱(紫外检 测，即 L C UV)方法和 液相 色谱 一 电喷 雾电 离质谱联 用(L C E S I MS)检测 方法 色谱 分 离选 用 S y mme t r y C。柱，以 乙腈 一水为流动相 紫 外检测 波长为 2 7 8 n m，质谱 采用选择 性 离子检测(M Z 3 2 1 0，M H 一)样品制 备省去传统 的多次液一 液萃取过程，采 用有机溶 剂直接提 取，转 溶后，用 固相 萃取 方 法净化样 品 虾 仁和牛奶样 品的 平 均 回收率 分 别为 9 3 7 和 9 6 O ；检 测 限：L C UV 为 2 5 g k g和 8 3 k g；L C E S 卜MS为 1 3 t t g k g和 4 5 t t g k g 方 法 准确 灵敏，样 品预 处 理 较 简便 快 速 关键 词：氯霉 素；高效 液相色谱；电喷雾 电离质谱；虾仁；牛奶 中图分类号：R 9 7 8 1 3 文献标识码：A HPLC De t e c t i o n o f Chl o r a m phe ni c o l Re s i du e s i n Shr i m p a nd M i l k DAI J u n，CHEN Sh a n g we i，(Te s t i n g&An a l y s i s Ce n t e r o f S ou t h e r n GU Xi a o h o n g。TANG J i a n Ya n g t z e Un i v e r s i t y。W u x i 2 1 4 0 3 6，Ch i n a)Ab s t r a c t：A r a p i d a n d s e n s i t i v e h i g h p e r f o r ma n c e l i q u i d Ch r o ma t o g r a p h i c me t h o d(LC UV)a n d l i q u i d Ch r o ma t o g r a p h i c ma s s s p e c t r o me t r i c me t h o d(LC ESI M S)we r e d e v e l o p e d f o r d e t e c t i o n o f t r a c e a mo u n t s o f Ch l o r a mp h e n i c o l(CAP)r e s i d u e s i n s h r i mp a n d mi l k Th e a n a l y s i s wa s p e r f o r me d o n t h e S y mme t r y Cl 8 c o l u mn(4 6 ram i d 1 5 0 mm a n d 2 1 mm i d 1 5 0 mm)wi t h a c e t on i t r i l e wa t e r as m o bi l e pha s e，a n d U V de t e c t i on a t 2 78 nm The e l e c t r os pr a y i o ni z a t i o n m a s s s p e c t r o me t r y wa s o p e r a t e d i n t h e n e g a t i v e i o n mo d e u s i n g s e l e c t e d i o n mo n i t o r i n g(M Z 3 2 1 0，MH 一)Th e a v e r a g e r e c o v e r i e s o f C AP i n s h r i mp a n d mi l k we r e 9 3 7 a n d 9 6 O 。Th e d e t e c t i o n l i mi t we r e 2 5 t t g k g a n d 8 3 t t g k g b y LC UV，1 3 t t g k g a n d 4 5 t t g k g b y LC ESI-M S The s a mp l e s p r e p a r a t i o n i n t h i s me t h o d wa s s i mp l e，r a p i d a nd r e l i a b l e d u e t o u t i l i z a t i o n o f u s i n g s o l i d-p h a s e e x t r a c t a o n(S PE)f o r c l e a n u p o f l i p i d a nd p i g m e nt Ke y wo r d s：c h l o r a mp h e n i c o l；h i g h p e r f o r ma n c e l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y；e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ma s s s p e c t r o me t r y；s h r i m p；mi l k 氯 霉 素(c h l o r a mp h e n i c o l s，即 C AP)属 广 谱抗 生素，曾是 动物 临 床常 用 的抗 生 素，目前仍 在 一定 范 围内使用 但 由于 C AP具 有 抑制 造 血 机 能 等毒 副作 用，近年 来人 们 对 其 在 虾仁、牛奶 等 动物 性 食 品中的残 留特 别 重 视 许 多 国 家严 格 禁 止 将 C AP 用 于食用 动物，规 定 CAP的最 高 残 留限量(MRL)收稿 日期：2 0 0 3 0 3-2 4；修 回 日期：2 0 0 3 0 6 2 5 作 者简 介：戴 军(1 9 5 8 一)，男，江苏 盐 城人，高 级 工程 师，工 学硕 士 维普资讯 http:/ 8 2 无锡轻工 大学 学报 第 2 2卷 为 O O 0 1 mg k g 有关 氯霉 素 在食 品中 的残 留量 分析方 法主要有 EL I S A(酶联免疫 法)、GC、和 GC MS及 HP L C等方法 E L I S A法 主要用 于快 速筛选 检测，但定性 和定量 均不 够 准确；GC和 GC MS由 于需衍 生化，操 作 较 为 麻 烦；HP L C分 析 较 准确 且 过程相对较 简便，因而 应 用 较 多 wa l _ J M 1 等用 S p h e r i s o r b OD S柱 以 甲醇一 水 为流 动相 分析 了牛奶 中 C AP，其 色谱分 离度 和 峰 型均 不 够理 想，杂 峰 干 扰较大，样 品处理 也 较 复 杂 李 兰 生 和王 勇 强 2 用 B o n d a p a k-C 。柱，也 以 甲醇一 水 为流 动相 测定 了投 喂饵药后 4 8 h内虾体 内不 同组织 中 C AP质量分数 的变化(O 5 9 3 8 0 1 g g)，其样 品处理 是用 甲醇 沉淀蛋 白质后 直 接进 样，操 作 较 简单，但可 能 含 有 一定量 的弱极性成 分尤 其是 色素 等 留在分 析柱 中，影响多 次进样 后的基线 稳定 及色谱 柱寿命 De l e p i-n e等 3 用 L C P B MS测定 牛 肉 中 C AP残 留，其检 测限为 2 g k g 作 者采 用 S y mme t r y C 1 8 柱，以 乙 腈一 水为流动相建 立 了速冻 虾 仁和 牛奶 中氯 霉 素 残 留 的 HP L C UV 分 析 方 法 和L C ES I-MS检 测 方 法 1材 料 与 方 法 1 1仪器和试剂 Wa t e r s 6 0 0高效 液相色谱仪，配 2 4 8 7双通道紫 外可见光检 测器 和 M3 2色谱 工 作 站：美 国 Wa t e r s 公 司产 品；Ag i l e n t l 1 0 0 L C MS D：美 国 Ag i l e n t公 司产 品 氯霉素标准 品，购 自德 国 Rd H 公 司；速冻 虾仁 样 1#(2 5 0 g装)和 2#(2 0 0 g装)，分 别为上海、福 建某公 司产；牛奶样 1#(2 0 0 mL盒装)和 2#(2 0 0 mL袋装)，分别为上海 与江 苏产，2 0 0 2年 1 2月购于 无锡某超 市；3#(2 2 5 mL盒装)，江 苏产；4#(4 8 6 mL袋 装)，天 津 产；5#(2 0 0 mL盒 装)，上 海 产；2 0 0 3年 3月购于无锡某超 市 乙腈，色谱 纯，德 国 Me r c k公 司产 品；水，超 纯 级，购 自无锡 华 晶微 电子公 司；其 它试 剂 均 为分 析 纯 1 2实验 方法 1 2 1 标 准溶液配制 精 确称 取 2 5 0 mg氯霉 素 标准品于 1 0 0 mL容 量瓶 中，用 甲醇 溶解 并定 容 至 刻度，再稀释 成质 量 浓 度分 别 为 1 2 5，5 0，1 2 5，0 2 5，0 0 2 5，0 0 0 5z g mL的 标准 溶 液 系 列，分 别 用 0 4 5z m 微孔滤膜 1 2 2 样 品制 备虾仁 样：将 虾仁 打 成 均匀 的糊 状肉泥，准确称取 1 0 g左 右，放 在 5 0 mL具 塞刻度 管 中，分别 加入 1 5 mL乙酸 乙酯 和 5 mL水，于漩涡 振荡 器上振荡 3 mi n后 静置；使 液体 经滤 纸过 滤入 分液 漏斗 中，将 残渣 再次 加入 1 5 mL乙酸 乙酯 和 5 mL水，再次振荡、静 置和过滤，反 复提取 3次，滤液 均合并 入分液漏 斗中，去除 下层保 留酯 相，于 6 O 水浴 上旋 转蒸发浓缩 近干；加入体 积分数 为 8 O 的 乙醇溶 液，超声 振 荡 充分 溶 解 残 留物，并 转 移 至 1 O mL容 量 瓶 中定 容 至 刻 度，再 过 滤 后 取 少 量 通 过 S e p-p a k C 。固相萃取柱 处理 去除 残余脂 质 和色素，供上 机进样用 牛奶 样：准确称取 3 g左 右牛奶 于 1 0 mL容 量 瓶 中，用无水 乙醇定容后，于漩 涡振荡 器振荡 2 mi n 左右，静 置，过 滤后 通 过 S e p-P a k C 。固相萃 取 柱 去 除脂 质，过滤 液供上机分 析用 1 2 3 HP L C 分 析 条 件 色 谱 柱：Wa t e r s s y m-me t r y C1 8，D 3 9 mmX 1 5 0 mm 流 动相：乙腈一 水，体积 比为 4 O：6 0；柱温：3 O；检测波长：2 7 8 n m；体 积流 量：1 mL mi n,进样 体积 2 O L 1 2 4 L C MS分析 条 件E S I 负离 子 S I M 检 测(m z 3 2 1 0，E M HI 一)；传 输 电压：7 O V；干燥 气 体 积流 量：1 0 L mi n,喷 雾 器 压 力：4 0 p s i；干 燥 气 温 度：3 5 0；毛 细 管 电 压：3 5 0 0 V；色 谱 柱 Wa t e r s s y mme t r y C 1 8，D 2 1 mmX 1 5 0 mm；流动 相：乙腈一 水，体积 比 4 O：6 0；柱温：4 O；体积流量：0 3 mL mi n；进样 体积：5 L 2结 果 与讨 论 2 1 HP L C-UV检测线性及检 出限 将上述 不 同质 量 浓 度 的标 准 溶 液 分别 进样 作 HPL C UV 分析，以峰面 积对 进样 量作线性 回归，得 到标准 曲线及其 方 程 见 图 1 按 3倍 信噪 比测 得氯 霉素 的检 出限为 0 0 5 n g 当进样体 积 为 2 O L时，虾仁 中氯霉 素最 小 检 出量 为 0 0 0 2 5 mg k g，牛奶 中氯霉素最小 检 出量 为 0 0 0 8 3 mg k g 此 检测 灵 敏度基本 可满 足 ML R为 O O 0 1 mg k g的检测要 求 对 于牛奶样，若要 进一 步提高 检测 灵敏度，还 可 加大取样量，在沉 淀蛋 白质后 浓缩一 定倍 数再定 容 过柱，这样 可进一 步降低检 出限 2 2 HP L C-UV分 析方法 回收 率 准确称取 同一虾仁样(1#)4份，其 中一 份测本 底，另外 3份分别 加入低、中、高 3种 不 同量 的氯 霉 素标 准 液，均 按 1 2 2和 1 2 3进 行样 品处 理 和 HP L C测定，每 份样 品重 复 测 定 3次，取其 峰面 积 平 均值计得 回收 率，同法 测 得 牛奶 样(1#)加标 回 收率，结果表 1 维普资讯 http:/ 第 6期 戴 军等：HP L C测定牛奶和虾仁 中氯霉素残 留 8 3 5 1 0 4 1 0 图 1氯霉 素 的标 准 曲线 Fi g 1 Cal i br a t i o n ca r v e ofCAP 衰 1氯霉素 回 收率 测 定结 果 Tab 1 Re s u l t s ofr e c o ve r y ex pe r i m e nt s of CAP de r m i na flo n 0 0 0 04 0 0 0 03 0 0 0 02 暑 0 0 0 0 1 O 0 0 0 0 1 0 0 0 02 2 4 6 8 l 0 l 2 l 4 时 间 mi n 圈 2虾 仁 1 的 L C-UV图谱 F i g 2 L C U V Ch r o ma t o g r a m o f S h r i mp S a mp l e 1#0 0 02 0 O 0 0l 6 三 0 0 0 1 2 0 000 8 0 0 004 0 2 4 6 8 l 0 1 2 时 间 mi n 圈 3牛奶 2 的 L C-U V 图谱 F i g 3 L C U V C h r o ma t o g r a m o f Mi l k S a mp l e 2#2 3 L C-UV方 法的部分定量 结果及 其精密 度 按 1 2 2处理 2个虾 仁样 和 5个 牛奶样，每个 样 平行制 备 4个，均在 1 2 3的 HP LC UV 分 析条 件下，以外 标法 测 得 各样 品 中氯 霉 素 的质 量 分 数，结果 见表 2 其 相 对 标 准 偏 差(RS D)为 2 2 3 5 2O 衰 2部 分样 品中 氯霉素 检 测结 果 Tab 2 The de t e c t i on r e s ul t s of CAP i n S a m pl e s (mg k g)7 0 0 6 00 奄!l 5 0 0 爆 髫 4 0 0 3 00 200 n 0 2 4 6 8 时 问 rai n 圈 4牛 奶 2 的 L C E S I-MS选 择 离子 色谱 圈 Fi g 4 Chr o mat o gr a m of s e l ect e d i on m o ni t o r i ng o f m i l k s 哪。pi e 2#想 髫 时 间 mi n 圈 5虾仁 1 的 L C E S I-MS选 择 离子 色谱 圈 Fi g 5 Chr o m a t o gr a m of se l e c t ed i o n m o ni t o r i ng of s hr i m p s ampl e 1#2 4 L C E S I-MS检 测 在 1 2 4的条件 下，用 L C ES I MS作 选 择性 离子检测(ml z 3 2 1 0，E M H3。)，以外标法测定 2个 虾仁样 和 5个牛奶样 中氯霉素，其结果(表 2和图 4 6)与 LC UV 的分 析结 果 基本 相 近 但 L C E S I MS离子选择 性 检测 方 法 的灵 敏度 较 高，杂峰 干扰 O i l 3 2 l l 咀 誊 维普资讯 http:/ 8 4 无锡轻 工 大 学 学报 第 2 2卷 显 著减少 按 3倍 信噪 比计，在 进样 体积 为 5 L时，虾仁和牛奶 中氯霉素 的最 小检 出量分 别 为 1 3 g k g和 4 5 g k g 若 有 条 件 采 用 L C MS MS分 析 ，虾 仁 中氯霉 素 的最 小 检 测 量 可达 0 0 8 g k g 2 5样 品处 理 对 于 动 物 性 食 品 中 氯 霉 素 的 检 测，以 往 文 献0 中的样 品预处 理 方 法 一般 是 先用 甲醇、乙腈 或 乙酸 乙酯 等 有 机 溶 剂 提 取，提 取 液 浓 缩 后 溶 于 4 的氯化 钠溶 液 中，用 正 己烷 等 非极 性 溶剂 进 行 液 一液分 配以除去脂类，再用 乙酸 乙酯 反 萃 回有机 相，然后浓缩近干，用 流动相 溶 解定 容，其 手续麻 烦 参 考文 献：耗时，且 因多次 萃 取使 得 回收率 较低 作者 现 采用 的方法，样 品预处 理简 便，可省 去多次 液 一液萃取 对虾 仁 样 用 乙酸 乙酯 提 取 后，转 溶 至 体 积分 数 为 8 O 乙醇 中，此 步骤 可 减 少大 量 脂 质，然 后再 用 反 相 固相萃取 柱进一 步去 除脂质 和色 素 如 此处理 后 的样 品溶 液 无色 透 明 若 不 用 固相萃 取 净化，样 品 液 则 呈 淡 黄 色，C AP后 的 杂 质 峰 明 显 较 多 对 于 牛 奶样，直接用 体 积 分 数为 7 O 的 乙醇提取，既 可去 除蛋 白，也 可破 乳 其 提 取 液 中脂 质再用 反 相 固相 萃取 柱 去除 因样 品手 续 简 化，检测 牛奶 和 虾仁 样 品 中 C AP的回收率均 较高，重 复性较 好，分析 时间 大 大 缩 短 1 1 Wa l J M，P e l e r a n J CB o r i e s G F Hi g h p e r f o r ma n c e l i q u i d c h r o ma t o g r a p h i c d e t e r mi n a t i o n o f c h l o r a mp h e n i c o l i n r n j I k J J AOAC，1 9 8 0，6 3：1 0 4 4 1 0 4 8 2 3 李兰生，王勇强氯霉素在对虾体内的动力学研究 J 色谱，1 9 9 7。1 5(5)：4 3 1 4 3 4 3 De l e p i n e B，S a n d e r s P De t e r mi n a t i o n o f c h l o r a mp h e n i c o l i n mu s c l e u s i n g a p a r t i c l e b e a m i n t e r f a c e f o r c o mb i n i n g l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y wi t h n e g a t i v e-i o n c h e mi c a l i o n i z a t i o n ma s s s p e c t r o me t r y J Ch r o m a t o g r 1 9 9 2 5 8 2：l l 3 1 2 1 4 Ne u h a u s B KHu r l b u t J A，Ha mma c k WL C MS MS a n a l y s i s o f c h l o r a mp h e n i c o l i n s h r i mp J L a b o r a t o r y l n f o rat o r y b u l l e t i n2 0 0 2。1 8(9)：1 1 0 5 B o r i e s G F P e l e r a n J C，Wa l J M，L i q u i d c h r o ma t o g r a p h y D e t e r mi n a t i o n a n d Ma s s S p e c t r o me t r i c Co n f i r ma t i o n o f c h l o r a m p h e n i c o l r e s i d u e s i n a n i ma l Ti s s n e s J J A OA C，1 9 8 3 6 6：1 5 2 1 1 5 2 6 (责任编辑：朱 明)征 稿 征 订启 事 江 南大 学是教育部直属 的“2 1 1工程”重点建 设 大学。江 南 大学 学报(自然科 学版)为 自 然科 学与工程 技术 融合 的学术刊物(双月刊)，旨在反 映 自然科 学 与工程技 术领 域 中最新研 究成 果及其 应用，刊载机 械工程、通信 与控制 工程、信息工程、化 学与材料 工程、纺织工程、工 业设计、土木 工程、数理科 学 以及 医疗卫 生等学科 的科技论文。刊物 为全 国公开发行，邮发代 号：2 8 1 8 9。热忱 欢迎本校 及全 国各地 高等院校相关 专业 的 师生及有关科研 院所和企 业的研究人 员、工程技 术人 员不吝赐 稿，积极 订 阅(订购 处：全 国各 地 邮局)。江 南大学学报(自然科 学版)编 辑部 维普资讯 http:/