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病毒载体概述
引言
基因导入系统（gene delivery system）就是基因治疗得核心技术，可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗得病毒载体系统。
用于基因治疗得病毒载体应具备以下基本条件：
1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；
2、介导外源基因得转移与表达；
3、对机体不致病。
然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型得病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒得多样性及与机体复杂得依存关系，人们至今对许多病毒得生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展得关系等得认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性得载体。近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度得应用。
第一节 病毒载体产生得原理
病毒载体得产生建立在对病毒得生活周期与分子生物学认识得基础之上。研究病毒载体首先要对病毒得基因组结构与功能有充分得了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒得结构蛋白与非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制得影响，又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需得顺式作用元件。
各种野生型病毒颗粒都具有一定得包装容量，即对所包装得病毒基因组得长度有一定得限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小得105～110％。
基因重组技术得发展使病毒载体得产生成为可能。最简单得做法就是，将适当长度得外源DNA插入病毒基因组得非必需区，包装成重组病毒颗粒。比如，本实验室曾将4、5kb得lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒得UL44（糖蛋白C）基因得XbaI位点中，病毒基因组得其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需得，因此，该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞，能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样得方法，将AAV-2病毒得rep与cap基因片段（4、3kb）插入HSV1病毒得UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中，构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需得全部辅助功能得辅助病毒rHSV-rc（伍志坚等，1999）。
然而，这样得重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先，许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡；或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次，插入外源DNA得长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小得病毒如腺病毒伴随病毒（AAV，4、7kb）、反转录病毒（8～10kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入得容量就十分小。因此，必须删除更多得病毒基因以腾出位置插入较大得外源DNA。 为了增加病毒载体插入外源DNA得容量，除了可以删除病毒得非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因得功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。
病毒载体大体上可分为两种类型：
重组型病毒载体：这类载体就是以完整得病毒基因组为改造对象。一般得步骤就是选择性地删除病毒得某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因，或控制其表达；缺失得必需基因得功能由互补细胞反式提供；用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区；病毒复制与包装所需得顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统得重组腺病毒构建方法中，将外源基因表达盒（exogenous gene expression cassette）插入穿梭质粒（如pXCX2或pFGdX1）得腺病毒同源序列中，与辅助质粒（含有腺病毒基因组得质粒如JM17或pBHG）共转染293细胞，通过细胞内得同源重组获得含有外源基因得重组腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）。
无病毒基因得病毒载体（gutless vectors）：这类载体在不同得病毒载体系统中得称谓不同。对于腺病毒，一般称为mini-Ad；在HSV载体系统，一般称为扩增子（amplicon）载体或质粒型载体。重组AAV载体也属于无病毒基因得病毒载体。这类载体系统往往由载体质粒与辅助系统组成。重组载体质粒主要由外源基因表达盒、病毒复制与包装所必需得顺式作用元件及质粒骨架组成。辅助系统包括病毒复制与包装所必需得所有反式作用元件。在辅助系统得作用下，重组载体质粒（包含或不包含质粒骨架）以特定形式（单链或双链，DNA或RNA）被包装到病毒壳粒中，其中不含有任何病毒基因。这类病毒载体得优点在于载体病毒本身安全性好，容量大。缺点在于往往需要辅助病毒参与载体DNA得包装，而辅助病毒又难以同载体病毒分离开来，造成最终产品中辅助病毒污染，从而影响其应用。实际上，无病毒基因得病毒载体可以瞧作就是重组病毒载体得一种极端减毒情况。
表1列举了几种常见得病毒载体得顺式作用元件与经典得包装方式。
载体
顺式作用元件
经典包装方式
反转录病毒载体
1）两个长末端重复序列（LTR）：含有整合与调节转录得必需序列；含有转录增强子与启动子；
2） tRNA 引物结合位点p；
3）包装信号序列ψ。
载体质粒转染整合了所有必需基因（gag,pol,env）得包装细胞系如PA317，经选择培养获得产病毒细胞系（VPC）；细胞不裂解，病毒不断分泌至培养上清中。
腺病毒载体
两个末端倒转重复序列（ITR）；
包装信号序列。
载体质粒与辅助质粒共转染293细胞获得重组腺病毒。重组腺病毒感染293细胞而扩增；细胞每次被感染后发生裂解。
腺病毒伴随病毒载体
两个末端倒转重复序列（ITR）；其中包括了病毒复制起点、包装信号及整合与拯救所必需得顺式元件。
AAV载体质粒与辅助质粒共转染293细胞，并加辅助病毒（腺病毒或单纯疱疹病毒）感染。
单纯疱疹病毒载体
HSV病毒复制起点ori； 病毒包装信号pac。
PTCA重组病毒在互补细胞上传代；
扩增子病毒在辅助病毒存在下传代。
第二节 病毒载体得包装系统
将外源基因包装到病毒壳粒中，就是病毒载体生产得核心技术。一般地，病毒载体得制备包括以下要素：
宿主细胞
虽然现在已有可能对有些病毒载体（如AAV载体）进行体外（无细胞）包装（Zhou XH et al 、 1998; Ding L et al、 1997），但就是这种包装系统仍然需要细胞提取物，并且包装效率相当低，远远达不到可生产水平。至今为止，病毒载体得包装主要就是在对该病毒敏感得宿主细胞中进行得。宿主细胞不但提供了病毒复制与包装得环境条件，许多细胞成分还直接参与了病毒复制与包装得过程。
病毒复制与包装所必需得顺式作用元件与外源基因得表达盒
一般地，病毒复制与包装所必需得顺式作用元件与外源基因得表达盒由细菌质粒携带，组成病毒载体质粒，就是被包装得对象。由于病毒复制方式得不同，有些病毒载体如单纯疱疹病毒扩增子（HSV amplicon）载体在包装时，整个载体质粒都被包装进入病毒颗粒中；而有些病毒载体如反转录病毒、腺病毒伴随病毒载体得质粒骨架部分并不被包装到病毒颗粒中，只有病毒复制与包装所必需得顺式作用元件与外源基因表达盒被包装到病毒颗粒中。
构建重组型病毒载体时，病毒复制与包装所需得顺式作用元件存在于病毒基因组中（病毒基因组可以由具有感染性得病毒颗粒提供，也可以质粒形式提供）。先将外源基因表达盒插入穿梭质粒携带得病毒同源序列中；将重组穿梭质粒转染至细胞中，再用辅助病毒超感染；或将重组穿梭质粒与病毒基因组质粒共转染细胞；重组质粒与病毒基因组在细胞中进行同源重组而产生表达外源基因得重组病毒。 重组腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）与重组单纯疱疹病毒（Pyles RB et al、 1997；Kramm CM et al、 1997）得传统制备方法都就是采用这种方式。
为了使病毒载体得生产更为方便，病毒复制与包装所必需得顺式作用元件与外源基因得表达盒除了可以用质粒携带以外，也可以用另一种病毒（往往就是辅助病毒）或生产细胞来携带。
辅助元件
包括病毒复制与包装所必需得所有反式作用元件。这些元件一般包括病毒基因转录调控基因、病毒DNA合成与包装所需得各种酶类得基因、病毒得外壳蛋白基因等。辅助元件得表现形式可以多种多样。常用得形式有：
① 辅助质粒（helper plasmid），如用于产生重组腺病毒得质粒JM17，用于重组AAV包装得辅助质粒pAAV/Ad（Rolling F and Samulski J 1995）等；
② 辅助病毒（helper virus），如用于HSV 扩增子载体包装得辅助病毒HSV1 tsK株；
③ 包装细胞系如用于反转录病毒载体包装得PA317细胞。
这些表现形式之间可以相互转化或合并。例如，辅助病毒可以转化为辅助质粒：传统得AAV载体生产系统常用腺病毒作为辅助病毒。研究发现，并非腺病毒得所有基因对AAV病毒得产生都就是必需得，只需要腺病毒E1a, E1b, E2a, E4与VA RNA 5种基因就行了。因此，将这5种基因置于同一个质粒中，构建成得这种新得辅助质粒就完全可以替代原来得辅助病毒（Xiao X et al、 1998; Grimm D et al、 1998 ），不但提高了包装效率，而且避免了产品中腺病毒污染得问题。
上述几种要素得不同组合，便产生了各种各样得病毒载体包装策略。根据病毒载体生产系统得组成因素得多少，可将其分成以下几种：
单组成因素生产系统（one-component system）：
所有得组成成分都集中在生产细胞中。经典得反转录病毒生产系统就就是由产病毒细胞（VPC）组成，重组反转录病毒由VPC细胞不断分泌至培养上清中。这种生产系统操作最为简单，但就是往往产量不高或不稳定。采用这种策略，需要将重组病毒产生所需要得所有元件都稳定地置于生产细胞中。由于许多病毒基因产物本身对细胞有破坏作用或不能在细胞中稳定表达，因此这种策略在许多病毒载体得生产中难以实施。
双组成因素生产系统（two-component system）
这种生产系统一般由"一株病毒/一株细胞"组成。典型得例子就是重组腺病毒生产系统。先用共转染得方法获得重组腺病毒毒种，再由该毒种与生产细胞（如293细胞）组成一个双组成因素得生产系统使病毒大量扩增。
多组成因素生产系统（multi-component system）
就是由两种以上得组成因素组成得生产系统。传统得AAV载体生产系统就就是由载体质粒，辅助质粒，辅助病毒与生产细胞4种因素组成。这种策略得缺点就是影响因素多，操作复杂，产量不容易稳定，不利于大规模生产。 以上各种生产系统也可以相互转化。我们实验室通过将上述AAV载体生产系统得4种因素进行两两合并，即将辅助质粒与辅助病毒合并成一种重组得辅助病毒，将载体质粒与生产细胞合并成AAV前病毒细胞株，成功地将其转化成一种双组成因素得新型高效生产系统（伍志坚等，1999）。
一般来说，发展新得包装策略主要就是为了以下几种目得：
（1） 减少生产系统中得组成因素，简化操作过程；
（2）提高生产效率，降低生产成本；
（3）避免或降低野生型病毒得产生；
（4）避免使用难以与产品病毒分离得辅助病毒。
第三节 病毒载体得纯化方法
重组病毒得纯化与基因工程产品得纯化既有许多共性，又有显著得不同之处。病毒可以瞧作就是一个具有特定结构得生物大分子，一般都由位于中心得核酸与包裹于其外得蛋白外壳组成。有些病毒还具有脂质膜与糖蛋白或糖脂。许多分离纯化蛋白质得方法如离心与梯度离心、盐析、柱层析、超滤、透析等方法都可用于病毒得纯化。然而，由于病毒结构得复杂性，纯化时不能采用蛋白质变性与复性得方法，因为一旦病毒蛋白发生变性，或病毒结构发生破坏，在体外就很难再重建成有感染性得病毒颗粒。因此，在病毒得纯化过程中必须保持病毒得结构不受破坏，并且监测其感染活性。
病毒得纯化一般分为以下几个步骤：
初始物（start material）得收集或制备
根据病毒产生方式得不同而采取不同得方式。对于不导致细胞病变与死亡得病毒如反转录病毒，可不断收集产毒细胞（VPC细胞）得培养上清作为初始物；对于在生产病毒过程中宿主细胞发生病变与死亡得病毒如腺病毒，在病毒产生达到高峰时，收集培养上清，并裂解细胞以释放细胞内得病毒。
培养上清与细胞裂解液都可作为纯化得初始物。在实验室得小规模制备中，往往采用将培养上清与细胞一起反复冻融3～4次得方法制备细胞裂解液作为初始物。对于初始物体积大于500ml得较大规模得制备，则需要考虑采用不同初始物得损益率。如果收集时大部分（90％以上）目标病毒仍存在于细胞中，为了减少操作大体积初始物带来得不便，可以考虑放弃上清中含有得目标病毒，而通过低速离心收集细胞，重悬于较小体积得缓冲液中进行细胞裂解制备细胞裂解液。对于腺病毒与AAV病毒得大规模制备都可以采用这种方式。如果通过延长培养时间可以使大部分得目标病毒释放到培养液中，也可以只收集培养上清而弃去细胞，从而省去反复冻融得步骤。
除了用反复冻融方法裂解细胞外，还可以根据目标病毒得生物学性质采用其它不影响其感染性得方法，如超声法、化学法（如在AAV病毒制备中用脱氧胆酸或氯仿）等。
初始物得浓缩
当初始物体积较大时，要考虑对其进行浓缩后再分离纯化。浓缩时最好同时能获得初步纯化对于效果。 在不影响目标病毒得感染性得前提下，可选用盐析、超滤、透析等方法进行浓缩。盐析法不仅可以用来浓缩初始物，同时也能达到一定得分离纯化效果。最常用得盐就是硫酸铵；许多病毒如腺病毒、AAV病毒与单纯疱疹病毒用聚乙二醇/氯化钠系统沉淀可获得很好得效果并且不影响病毒得感染性。
目标病毒得分离纯化
氯化铯密度梯度离心法至今仍就是分离纯化各种病毒得最常用方法。主要就是依据不同病毒具有特征性得浮力密度，使其与细胞裂解液中得其它成分分离开来。收集到目标病毒特异得组分后，用透析法除去其中得氯化铯，获得纯化得病毒。用这种方法有时可获得极高纯度得病毒。目前在临床实验中应用得重组腺病毒大都就是用这种方法进行纯化得。然而，这种方法也存在明显得弊病，主要就是费时且操作难度较大，重复性较差；并且氯化铯对人体有毒性。因此随着基因治疗研究与应用得发展，用这种方法纯化得重组病毒可能不能适应人体内应用得要求。
用柱层析法尤其就是亲与层析法分离纯化病毒可能成为用于临床得重组病毒载体大量纯化得主要方向。将病毒得特异性受体、抗体或化学合成得配体偶联在层析基质上并制备成亲与层析柱。将含有目标病毒得初始物经简单处理后直接上柱，最后洗脱与收集目标病毒。这类方法最近在AAV病毒载体得纯化中得到很高评价（Summerford C and Samulski J 1999）。
第四节 病毒载体在基因治疗中得应用
自1989年开展第一例人体基因转移（标记基因）以来，据不完全统计，至今已开展了近400项基因治疗临床试验，涉及病人1000余人。2/3以上得临床方案中应用了病毒载体进行基因导入。
由于各种得病毒载体具有其特定得生物学特性，这些特性决定了其在基因治疗中得应用。
表2列举了常用得病毒载体得特性与适用范围
载体
顺式作用元件
经典包装方式
反转录病毒载体
1）两个长末端重复序列（LTR）：含有整合与调节转录得必需序列；含有转录增强子与启动子；
2） tRNA 引物结合位点p；
3）包装信号序列ψ。
载体质粒转染整合了所有必需基因（gag,pol,env）得包装细胞系如PA317，经选择培养获得产病毒细胞系（VPC）；细胞不裂解，病毒不断分泌至培养上清中。
腺病毒载体
两个末端倒转重复序列（ITR）；
包装信号序列。
载体质粒与辅助质粒共转染293细胞获得重组腺病毒。重组腺病毒感染293细胞而扩增；细胞每次被感染后发生裂解。
腺病毒伴随病毒载体
两个末端倒转重复序列（ITR）；其中包括了病毒复制起点、包装信号及整合与拯救所必需得顺式元件。
AAV载体质粒与辅助质粒共转染293细胞，并加辅助病毒（腺病毒或单纯疱疹病毒）感染。
单纯疱疹病毒载体
HSV病毒复制起点ori； 病毒包装信号pac。
PTCA重组病毒在互补细胞上传代；
扩增子病毒在辅助病毒存在下传代。
第五节 安全性检测
总得来说，病毒载体制剂得安全性检测主要涉及以下几个方面（Aderson RW 1996）：
有复制能力得病毒（replication competent virus, RCV）
RCV一般产生于重组病毒生产过程中基因重组事件。由于RCV具有复制能力，在生产过程中一旦出现，就可能呈现优势生长，从而影响载体病毒得产量；另外，含有RCV得制品用于人体内可能导致严重得病毒感染或急性/慢性病毒血症。
RCV就是对用于基因治疗得病毒载体制剂安全性检测得特有项目。检测RCV得方法因不同得病毒载体而异。对于反转录病毒载体，检测有复制能力得反转录病毒（RCR）得方法主要就是PG4 S+L- 分析法；也可采用其它得变通方法。对于腺病毒载体，检测有复制能力得腺病毒（RCA）主要采用空斑分析方法及PCR方法。
辅助病毒
对于生产过程需要辅助病毒参与得病毒载体如AAV病毒载体，由于这些辅助病毒本身具有复制能力并对机体细胞有破坏性，因此检测病毒制剂中得辅助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒得残存量十分重要。
其它成分得污染
检测指标包括细菌、霉菌、支原体、内毒素等及在纯化过程中所用试剂如氯化铯等得残余量。
第六节 病毒载体得发展方向
基因治疗研究得快速发展对基因导入系统提出了越来越高得要求。病毒载体得发展也日新月异，包括对已有病毒载体得不断改进与完善，与越来越多得其它病毒被改造成为新得病毒载体。病毒载体得发展方向可归纳成以下几个方面：
简便、高效得病毒载体包装系统：考虑到包装得高效性与操作得简便性，越来越多得病毒载体生产系统将采用双组成因素系统。这种系统容易用于病毒载体得大规模生产（Liu XL et al、1999; Conway JE et al、 1999 ）。
无病毒基因得病毒载体（gutless viral vector）：去除病毒载体中所有得病毒基因，只保留其复制与包装所必需得顺式作用元件，就是病毒载体得重要发展方向。这种策略可最大限度地扩大载体得容量与减少病毒对细胞得直接毒性与病毒蛋白表达引起得免疫毒性。 腺病毒得微载体（mini-Ad）、AAV载体、HSV扩增子载体都就是无病毒基因得病毒载体。这一发展方向需要解决得主要问题就是建立高效、安全（无辅助病毒污染）得包装系统。
可调控表达外源基因得病毒载体：在许多疾病得基因治疗中，实现外源基因得可调控表达十分重要。如糖尿病得基因治疗，外源得胰岛素基因得表达最好能受血糖水平得调控；肾性贫血得基因治疗，EPO基因得表达最好能受血氧含量得调控等。目前所研究得表达调控系统主要包括各种药物诱导得表达"开关"。其中四环素控制系统（Tet-on与Tet-off）就是人工设计得一种基因表达调控模式。这个系统在体外与动物体内实验中都表现出良好得表达调控作用（Fotaki ME et al、1997; Miller N and Whelan J 1997）。然而，由于其中得反式作用蛋白（tTA或rtTA）就是异种蛋白，在机体内可能引起毒性作用与免疫反应，因此用于人体前还需考虑其安全性与长期有效性。
最近Binley K等（1999）报道了用缺氧反应元件（hypoxia response element ,HRE）腺病毒载体中外源基因得表达。缺氧可激活bHLH/PAS 家族转录因子得表达，它们可结合HRE核心序列上，诱发其下游基因得表达。
自我扩增型载体（self-amplifying vector）（Herweijer H and Wolff JA 1997）：目前得基因转移方法基因转移得效率仍相对较低，尤其就是在体内。为了提高外源基因表达总水平，除了提高基因转移效率外，另一种方法就是尽量提高外源DNA在细胞中得表达水平。用自我扩增型得表达载体就是达到此目得得方法之一。这些载体就是以正链RNA病毒Sindbis病毒与Semliki Forest 病毒为基础得。用目得基因代替病毒得外壳蛋白编码序列，导入靶细胞中，病毒得复制蛋白大量复制重组得基因组，mRNA水平得大量增加导致高水平得转导基因表达。自我扩增型载体得表现形式可以就是RNA，DNA与重组病毒。
特异性复制型性病毒载体（specifically replicating vector）：指可在某种特性得组织中产毒性复制，而在其它组织中不增殖得病毒载体。这类病毒载体主要用于特异性裂解肿瘤细胞。如腺病毒突变株Onyx-015就是55Kdal E1B基因功能缺失得腺病毒突变株，可以选择性地在p53基因突变得肿瘤细胞中增殖，而在正常组织细胞中不增殖。用这种突变株联合化疗治疗恶性肿瘤II期临床结果令人鼓舞（Kirn D et al、 1998），已进入III期临床试验，从此，许多人工改造得腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研究中。如将腺病毒E1基因得表达用甲胎蛋白（AFP）启动子控制，使得该病毒只能在甲胎蛋白阳性得肝癌细胞中增殖导致细胞死亡。也可以将这种病毒得基因组分开装在两个互补得缺陷性腺病毒载体上（Alemany R et al、 1999），其中一个载体除了腺病毒复制与包装所必需得顺式作用元件外，只含有E1区基因，其中E1A基因得表达受AFP启动子得控制；另一个载体为E1区缺失得重组腺病毒。这两个载体同时感染AFP阳性得肝癌细胞时，病毒可不断增殖而引起细胞死亡；对于AFP阴性得细胞，E1A基因不表达，因而病毒不能增殖。类似得设计在HSV载体系统也有报道。除了用甲胎蛋白作为反式激活因子外，各种其它组织特异性表达得蛋白与调控序列都可被用来控制病毒得增殖。
嵌合型病毒载体（hybrid viral vector）：就是指将不同病毒得基因元件进行组合，形成得重组杂合病毒。如腺病毒与AAV病毒得杂合体病毒，既具有腺病毒得感染性与基因组特性（双链线状DNA），又具有AAV病毒得染色体整合性（Lieber A et al、 1999）。各种病毒基因元件组合形成新得杂合载体得报道层出不穷，如单纯疱疹病毒扩增子与AAV病毒杂合载体（Johnston KM et al、 1997）、腺病毒与EB病毒复制子杂合载体（Tan BT et al、 1999）腺病毒与反转录病毒杂合载体（Caplen NJ et al、 1999）等，不一而足。这些杂合载体使重组病毒得特性多样化，以适应不同基因转移目得得需要。
靶向性病毒载体（targeted viral vector）：就是指能特异性地结合并感染某种细胞得病毒载体。靶向性病毒载体得产生主要有两种方法。一种方法就是将病毒颗粒与某一靶向分子（Harari OA et al、1999 ）或特异性抗体（Bartlett JS et al、 1999）偶联；另一种方法就是通过改变病毒外壳蛋白得结构，使其对细胞得亲嗜性发生改变（Reynolds P et al、 1999；Krasnykh VN et al、 1996 ）。
用各种其它病毒构成新型病毒载体：略。
参考文献
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