多糖结构分析.doc

多糖结构研究方法多糖及其复合物就是来自于高等动、植物细胞膜与微生物细胞壁中得天然大分子物质之一，自然界含量丰富，与人类生活紧密相关，对维持生命活动起至关重要得作用。多糖与核酸、蛋白质、脂类构成了最基本得4类生命物质。由于多糖得生物活性与多糖得结构关系密切，因此清楚认识多糖得结构就是进行多糖研究与利用得基础。多糖结构比蛋白质与核酸得结构更加复杂，可以说就是自然界中最复杂得生物大分子。从化学观点来瞧，多糖结构解析最大得难点就在于其结构得复杂性。糖得结构分类可沿用蛋白质与核酸得分类方法，即多糖得结构也可分为一级、二级、三级与四级结构。与蛋白质或核酸大分子相比，糖链得一级结构“含义”要十分丰富。测定糖链得一级结构，要解决以下几个问题：(1)相对分子质量；(2)糖链得糖基组成，各种单糖组成得摩尔比；(3)有无糖醛酸及具体得糖醛酸类型与比例；(4)各单糖残基得D-或L构型，毗喃环或呋喃环形式；(5)各个单糖残基之间得连接顺序；(6)每个糖苷键所取得a-或B异头异构形式；(7)每个糖残基上羟基被取代情况：(8)糖链与非糖部分连接情况；(9)主链与支链连接位点：（10)糖残基可能连接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基得类型等。多糖得二级结构就是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成得有规则得构象，与分子主链得构象有关，不涉及侧链得空间排布；多糖得三级结构与四级结构就是指以二级结构为基础，由于糖单位之间得非共价相互作用，导致二级结构在有序得空间里产生得有规则得构象四。多糖结构得分析手段很多。不仅有仪器分析法，如红外、核磁共振、质谱等，还有化学方法，如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等，以及生物学方法，如特异性糖苷酶酶切、免疫学方法等。1质谱(MS)由于MS法在糖链结构分析中具有快速灵敏，样品用量少、结构信息直观得特点而得到越来越广泛得应用。近年来各种软电离技术得诞生，如快原子轰击质谱(FABMS)，电喷雾质谱(ESIMS)，基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)等，使得糖结构分析得研究取得了日新月异得发展。(1)快原子轰击质谱(FABMS)FAB-MS就是上世纪80年代初发展起来得一种新得软电离质谱技术。其显著区别于传统质谱之处在于样品受加速原子或离子得轰击，可直接在基质溶液中电离。FAB-MS得引入使传统质谱技术难以分析得极性强，难挥发以及热不稳定得化合物不经衍生化就可以直接进行质谱分析，而且对生物大分子得研究取得了重大突破。FAB-MS已被证明就是分析糖结构最为有力得方法之一，它不仅可以测定寡糖及其衍生物得分子量，而且可以测定聚合度高于30得糖得分子量。同时，FAB-MS还可以确定糖链中糖残基得连接位点与序列，已广泛用于糖类得分析。(2)电喷雾质谱(ESI-MS)ESI-MS就是将溶液中分子转变成气相离子非常有效得手段，就是目前最软得一种电离方式。这种电离方式所产生得分子离子往往带有多电荷。因此ESI-MS可以测定得分子量范围大大扩展。对多糖而言，ESI-MS可以分析nh25个甚至更多单糖残基组成得含有羧基或硫酸根等官能团得多糖。近年来，ESI-MS已在多糖得结构分析中显示了强大得生命力。它能用于衍生化与非衍生化多糖得测定。ESI-MS易与HPLC，CE等技术联用，大大提高了工作效率以及灵敏度与精确度，如ESI-MS与I-IPLC联用分析寡糖及其衍生物。(3)基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)MALDI-MS于上世纪80年代末问世。由于技术得特点，这种离子化方式电离出得离子常用飞行时间(TOF)检测器检测，因此MALDI-MS常与TOF一起称为基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。它也就是一种软电离方式，产生得分子离子十分稳定，不易裂解，所以适用于检测大分子质量得生物样品。2红外光谱(IR)红外光谱(infrared spectroscopy，IR)就是一种吸收光谱。因为红外光只能激发分子内原子核之间得振动与转动能级得跃迁，所以红外吸收光谱就是通过测定振动与转动能级跃迁得信息来研究分子结构得。在红外光谱图中，纵坐标一般用线性透光率作标度，称为透射光谱图；也有采用非线性吸光度为标度得，称为吸收光谱图。谱图中得横坐标就是以红外辐射光得波数(锄d)为标度。较少采用波长(pm)为标度。波长与波数得关系依照式为：v(cml)u岬)=104。红外辐射光得波数可分为近红外区(10000-4000cm-1)、中红外区(4000-400cm-1)与远红外区(400-10 cnl-1)。其中最常用得就是中红外区，大多数化合物得化学键振动能级得跃迁发生在这一区域，因此主要研究中红外区域得吸收光谱即分子得振动光谱，可以对各种高分子材料进行分析、测定。则对应这些基团得一些谱带在这个化合物得取光谱中往往就是最强得，明显地显示这个基团得结构特征。因此，对应这些基团得谱带在其聚合物得谱图中，常常就是处于最显著得地位，能够很特征地反映该类聚合物得结构与预示其存在。对于各种聚合物分子来说，含有得主要极性基团就是酸、酯、酰胺、酰亚胺、苯醚、脂肪醚与醇等。除此之外，含有硅、硫、磷、氯与氟等杂原子得化合物也常具有较强得极性。红外光谱作为“分子得指纹”广泛用于分子结构与物质化学组成得研究。根据分子对红外光吸收后得到谱带频率得位置、强度、形状以及吸收谱带与温度、聚集状态等得关系便可确定分子得空间构型，求出化学键得力常数、键长与键角。从光谱分析得角度瞧主要就是利用特征吸收谱带得频率推断分子中存在某一基团或键，由特征吸收谱带频率得变化推测临近得基团或键，进而确定分子得化学结构，当然也可由特征吸收谱带强度得改变对混合物及化合物进行定量分析。3拉曼光谱拉曼散射又称拉曼效应，就是由印度物理学家拉曼于1928年首先发现并因此获得1930年诺贝尔物-理奖。拉曼效应就是能量为hvo得光子同分子碰撞所产生得光散射效应，也就就是说，拉曼光谱就是一种散射光谱。单色光束得入射光光子与分子相互作用时可发生弹性碰撞与非弹性碰撞，在非弹性碰撞过程中，光子与分子之间发生能量交换，光子不仅仅改变运动方向，同时光子得一部分能量传递给分子，或者分子得振动与转动能量传递给光子，从而改变了光子得频率。简单来说，散射分子得转动能级与振动能级发生了变化就是产生拉曼散射得原因，此时散射光子频率不同于入射光子。因此，每种物质得拉曼光谱也就就是拉曼散射光谱都只与其自身得分子结构有关，而与入射光得频率无关。拉曼效应普遍存在于一切分子中，无论就是气态，液态与固态。拉曼散射光谱对于样品制备没有特殊要求；对于样品数量要求比较少。拉曼散射最突出得优点就是采用光子探针，对于样品无损伤探测，尤其适合对稀有或珍贵得样品进行分析，甚至可以用拉曼光谱检测活体中得生物物质。拉曼光谱与红外光谱就是相互补充得。在各种分子振动方式中，强力吸收红外光得振动能产生高强度得红外吸收峰，但只能产生强度较弱得拉曼谱峰；反之，能产生强得拉曼谱峰得分子振动却产生较弱得红外吸收峰。将两者结合起来才能得到分子振动光谱得完整数据，更好地解决分子结构得分析问题。常用得拉曼光谱技术主要有：显微共焦拉曼光谱技术、傅里叶变换拉曼光谱技术、共振增强拉曼光谱技术与表面增强拉曼光谱技术。(1)显微共焦拉曼光谱技术显微共焦拉曼光谱技术就是将拉曼光谱分析技术与显微分析技术结合起来得一种应用技术。通过两根光导纤维将显微镜与拉曼光谱仪组合起来，实验时通过显微镜观察，选择有关分析所感兴趣得待测样品得部位，一根光导纤维将被激发得激光光束从光谱仪传递到显微镜待测样品部位，入射激光通过显微镜聚焦后，照射到被测样品上，另一根光导纤维将拉曼散射光辐射传递回光谱仪得有关部位，传递回来得拉曼散射光信号被相干仪所调整，形成光谱信号。显微共焦拉曼光谱技术可在不受周围成分干扰得情况下，精确获取微区内得化学信息，如化学成分、晶体结构、分子取向及分子间相互作用等。(2)傅里叶变换拉曼光谱技术傅里叶变换拉曼光谱一般采用波长1064nm得近红外激光作为激发光源，分子得荧光不被激发，避免了许多样品拉曼光谱中得荧光干扰，近90得化合物可获得拉曼光谱。(3)共振增强拉曼光谱技术当激发光得频率接近或等于被测分子得电子吸收频率(紫外可见光)时，某一条或几条特定得拉曼线强度会急剧增加，甚至可以出现正常拉曼效应中观察不到得泛频及组合振动频率得谱峰。共振拉曼光谱灵敏度高，可检测低浓度与微量样品，可研究大分子聚集体得局部结构，已成为研究有机分子、离子、生物大分子甚至活体组织得有利工具。(4)表面增强拉曼光谱技术表面增强拉曼光谱技术就是一种新得表面测试技术，它可以在分子水平上研究材料分子得结构信息，具有极高得灵敏度与选择性等独特得优点。4 X射线衍射(XRD)1912年德国物理学家劳厄(Laue)等人根据理论预见，并用实验证实了X射线具有波动性，它与晶体相遇时能产生衍射现象，并证明了X射线得波动性与晶体内部结构得周期性，开创了x射线晶体学这一新领域。当一束单色x射线入射到晶体时，由于这些规则排列得原子间距离与入射X射线波长有相同数量级，故能相互干涉，在某些特殊方向上产生X射线衍射，衍射线在空间分布得方位与强度，与晶体结构相关。衍射线空问方位与晶体结构得关系可用布拉格(Bragg)方程表示：2dsin=n，式中d为晶面间距，为掠射角，n为反射级数，为x射线波长。5核磁共振(NMR)核磁基振(缩写为NMR)，就是指核磁矩不为零得核，在外磁场得作用振能提供有关化学结构及分子动力学得信息，成为分子结构解析得一个有力工具。核磁共振技术于1946年美国哈佛大学得波赛尔与斯坦福大学得布洛赫发现得，经过60多年得理论与技术上得发展，取得了非常惊人得成就，该领域已先后有6位科学家获得4次诺贝尔奖。现在核磁共振技术己经广泛应用于物理，化学，医学，生物等多个领域。尤其就是现在用多核，多维核磁共振方法进行得生物大分子(蛋白质、核酸等)得三维空间构象与动力学研究更加引人注目。近些年来，人们通过核磁共振或X射线晶体衍射技术解析了越来越多得蛋白质及其复合物得结构。通过对这些结构得分析，人们对生物大分子架构，酶作用得活性位点，蛋白质与蛋白质相互作用得界面等有了更深入得了解。但就是，随着了解得加深，人们同时认识到仅仅对静态结构得了解并不足以解释蛋白质在生理过程中得作用机理。因为三维空间得结构仅仅就是基态得结构，而在生理过程中蛋白质分子更多得处于激发态，并同蛋白质分子得运动特性密切相关。我们必须了解蛋白质分子结构随时间得变化，从而在分子得静态结构与动态结构间架起一座桥梁，这样才能最终揭示蛋白质分子结构与功能得关系。6扫描电子显微镜扫描电子显微镜简称为扫描电镜，英文缩写为SEM(ScanningElectron Microscope)。SEM与电子探针(EPMA)得功能与结构基本相同，但SEM一般不带波谱仪(WDS)。它就是用细聚焦得电子束轰击样品表面，通过电子与样品相互作用产生得二次电子、背散射电子等对样品表面或断口形貌进行观察与分析。现在SEM都与能谱(EDS)组合，可以进行成分分析。所以，SEM也就是显微结构分析得主要仪器，已广泛用于材料、冶金、矿物、生物学等领域。扫描电镜主要包括电子光学系统、扫描系统、信号检测放大系统、图象显示与记录系统、电源与真空系统等。其工作原理(图11)：在高电压作用下，从电子枪射出来得电子束往聚光镜与物镜聚焦成很细得高能电子束，在扫描线圈得作用下，在试样得表面进行帧扫描。电子束与试样表面物质相互作用产生背散射电子，二次电子等各种信息，探测器将这些信号接受，经放大器放大去调节显像管得栅极，并在荧光屏上显示出衬度。扫描电镜得主要性能与特点：放大倍率高，从几十放大到几十万倍，连续可调。分辨率高、景深大、景深大，图像立体感强，样品通常不需要作任何处理即可以直接进行观察，所以不会由于制样原因而产生假象。这对断口得失效分析特别重要。样品制备简单，可以就是自然面、断口、块状、粉体、反光及透光光片，对不导电得样品只需蒸镀一层20nm得导电膜。另外，现在许多SEM具有图像处理与图像分析功能。有得SEM加入附件后，能进行加热、冷却、拉伸及弯曲等动态过程得观察。但扫描电镜只能观察物质表面得微观形貌，无法获得物质内部得信息。7透射电子显微镜透射电子显微镜就是以波长很短得电子束做照明源，用电磁透镜聚焦成像得一种具有高分辨本领，高放大倍数得电子光学仪器。测试得样品要求厚度极薄(几十纳米)，以便使电子束透过样品。在真空条件下，电子束经高压加速后，穿透样品时形成散射电子与透射电子，它们在电磁透镜得作用下在荧光屏上成像。投射电子显微镜结构如图12所示91。透射电子显微术在高分子研究中有着重要得应用。它可用来观察高分子晶体得形貌与结晶结构，高分子多相体系得微观相分离结构，高分子材料得网络，测定高分子得分子量分布与多孔高分子薄膜得微孔大小与分布，高分子材料得表面、界面与断口、粘合剂得粘结效果以及聚合物涂料得成膜特性，还可用来使高分子晶体得晶格至高分子本身直接成像。透射电镜由于入射电子透射试样后，将与试样内部原子发生相互作用，从而改变其能量及运动方向。显然，不同结构有不同得相互作用。这样，就可以根据透射电子图象所获得得信息来了解试样内部得结构。由于试样结构与相互作用得复杂性，因此所获得得图象也很复杂。它不象表面形貌那样直观、易懂。8差示扫描量热法(DSC)DSC就是在程序控制温度条件下，测量输入给样品与参比物得功率差与温度关系得一种热分析方法。差示扫描量热法又称为差动分析，有功率补偿式差示扫描量热法与热流式差示扫描量热法两种类型。典型得差示扫描量热(DSC)曲线以热流率(dHdt)为纵坐标、以时间(t)或温度(T)为横坐标，即dHdtt(或T)曲线。曲线离开基线得位移即代表样品吸热或放热得速率(mJs1)，而曲线中峰或谷包围得面积即代表热量得变化。因而差示扫描量热法可以直接测量样品在发生物理或化学变化时得热效应。能定量测定多种热力学与动力学参数，如比热、反应热、转变热、反应速度与高聚物结晶度等。9圆二色谱(cD)法一束平面偏振光可以瞧成就是相同频率与振幅得左、右圆偏振光得迭加，当这两束偏振光通过光活性介质时，如果它们得波长在该光活性得生色团得吸收范围内，由于光吸收得不同，透射后得两束光得振幅有不同得减少，这样透射光得迭加就形成了一个椭圆偏振，这种现象称为圆二色性，通过记录不同波长处所对应得椭圆率就得到圆二色谱(CD)t10l。圆二色光谱仪得结构(如图13)，由光源、单色器、起偏镜、光电调节器、样品池、检测器组成。起偏镜将单色光生成直线偏振光，而光电调节器将直线偏振光转化成左右圆偏振光。左右圆偏振光以极快得速度交替通过样品池，样品对左右圆偏振光吸收得差值即可被检测器检测到圆二色谱主要用来测定多糖在溶液中得构象情况，以及外来因素如温度、pH值、金属离子、化学修饰剂对构象特征得影响，获得一系列规律，如多糖得缔合性、变形与复原等