Survivin基因真核表达载体的构建及其在cos.docx

Survivin基因真核表达载体的构建及其在cos
【摘要】 　　［目的］克隆人survivin基因并在真核细胞中表达。［方法］ 以人喉癌组织中提取总RNA为模版，采用反转录聚合酶链RT-PCR法获得survivin cDNA。将该基因克隆到载体中,构建真核细胞表达载体/survivin，将测序正确的survivin基因通过脂质体介导下转染cos-7，Western blot检测survivin蛋白在cos-7中表达。［结果］ DNA测序证明获得了survivin基因，其序列与GeneBank中报道序列完全一致。Western blot检测survivin蛋白获得高效表达，其相对分子质量为。［结论］ Survivin基因的克隆和表达均获得了成功，为进一步探讨survivin基因在喉癌诊治中应用奠定了基础。
【关键词】 survivin基因　人喉癌组织　基因表达
　　Construction of Survivin Eukaryotic Expression Vector and Its Expression in cos-7
Abstract: ［Purpose］ To clone and express human survivin gene with eukaryotic vector. ［Methods］ Total mRNA was extracted from human laryngeal cancer tissue, and then the full-length survivin cDNA was obtained by RT-PCR. The surivin gene was cloned into　vector and the /survivin vector was constructed and transfected into cos-7 cells. The survivin protein was analyzed by western blot. ［Results］ The cDNA of survivin was sequenced and consistent with the sequence reported in Genebank with blast。 Western blot analysis demonstrated that the survivin protein was expressed and the relatived molecular mass was about　［Conclusions］ survivin gene has been cloned and expressed successfully and can be used for further study the applications of survivin on diagnosis and therapy in the laryngeal cancer.
Key words: survivin gene; eukaryotic expression; vector construction
Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的成员，其功能主要通过抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻断细胞凋亡过程。该蛋白选择性地表达于胚胎发育组织和人类大多数肿瘤组织，而正常成人终末组织中不表达，其独特的分布特点在肿瘤发生、发展过程中的重要作用已受到学者们的广泛关注。为了进一步探讨该基因在人喉癌组织中的表达及其在喉癌诊断及预后判断中的作用，我们构建了survivin基因的真核表达载体并将其转染cos-7细胞以观察该基因在其中的表达情况，为下一步喉癌的诊断和治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法
　材 料　
人新鲜喉癌组织、质粒和猴成纤维细胞cos-7细胞系及DH5α菌株均为本科保存。限制性内切酶及胰蛋白酶购于宝生物工程(大连)有限公司；T4DNA连接酶、DNA纯化试剂盒和逆转录试剂盒购于Promega公司，用于组织总RNA提取的Tripure Isolation Reagent提取试剂盒购于Gibco公司。转染试剂Lipofectamine Reagent 2000和G418购于Gibco公司，survivin兔抗人多克隆抗体购自于Santa cruz公司。
　方 法
　PCR引物设计　
根据Gene Bank中survivin序列，设计一对引物， P1(survivin基因上游引物，5′GCCGGTACCATGGGTGCCCCGACG； 3′P2(survivin基因下游引物，5′GCCCTCGAGTCAATCCATGGCAGC 3′。在上游和下游引物5′端分别加入了BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，以便于克隆。引物由上海博亚生物有限公司合成。
　目的基因survivin片段的获得
取手术切除的人新鲜喉癌组织，机械捣碎后，消化收集、洗涤、沉淀，以Tripure Isolation Reagent 总RNA试剂提取总RNA(详见试剂操作说明)，按产品说明书操作，以反转录体系经RT-PCR制备survivin cDNA，反应如下:取总RNA 1μｇ，oliga dT 2μl，混匀后70℃ 10min，冰浴2min后加5倍逆转录缓冲液5μl，10mmol/L dNTP 2μl，RNA酶抑制剂2μl，逆转录酶(MLV RT)40Ｕ，混匀后42℃水浴60min，冰浴2min，70℃加热10min后模板制备完毕。以所制备survivin cDNA为模板进行35个PCR反应扩增，反应体系如下:模板cDNA 8μl，10倍缓冲液10μl，25mmol/L MgCl2 10μl，上、下游引物(10ｐｍｏｌ/Ｌ)4μl，TagDNA聚合酶2μl，10mmol/L dNTP2μl，加Ｈ2Ｏ补足至总体积100μl。反应条件为:94℃ 5min，52℃ 2min，72℃ 2min后94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 2min，35个循环，最后72℃继续延伸10min。取5μl PCR产物，在含/Ｌ溴化乙锭(EB)的琼脂糖凝胶(15ｇ/Ｌ)中电泳分析，紫外观测仪观察结果。
　Survivin基因的克隆及真核载体/survivin的构建　
回收纯化的产物经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切并回收,取10μl回收片段，加经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切的质粒2μl，加T4DNA连接酶1μl、10×buffer Ｄ 2μl、双蒸水5μl，4℃过夜进行连接，构建重组质粒，命名为/survivin。取连接产物10μl转化感受态细胞DH5α 100μl，与ＬＢ培养液混匀,倒入含氨苄青霉素的LB固体培养基上，用涂菌棒均匀涂平，置37℃孵箱过夜。用牙签随机挑取单个菌落，置摇菌管中，37℃恒温振荡器摇菌16ｈ。移菌液至离心管中，离心弃上清,按试剂盒说明书介绍进行质粒的抽提和纯化。同时取1ml菌种送上海生工测序。抽提纯化的重组质粒4μl，加10×buffer Ｄ 1μl，BamHⅠ和XhoⅠ各μl，双蒸水4μl，置37℃恒温箱进行酶切1ｈ，进行琼脂糖凝胶电泳。
　细胞转染及稳定转染细胞系的建立
cos-7细胞在含100ml/Ｌ新生牛血清的DMEM培养基中培养至70%左右，在脂质体介导下将重组质粒/survivin进行转染，具体方法参照转染试剂说明书进行。Ｇ418(浓度为500μｇ/ml)筛选。
　　　Western blot印迹
分别取3×107个稳定转染空载体(+)及重组质粒/survivin的cos-7细胞，裂解后加入3×加样缓冲液混匀，沸水中煮10min，离心，经15%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，在转移槽中将蛋白从凝胶中的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上(电压14Ｖ，冷室内过夜)，丽春红染液预染并标记蛋白分子量。TBST缓冲液洗膜、封闭过夜。加TBST缓冲液稀释的兔抗人survivin多克隆抗体(1∶200)作为一抗，37℃孵育15ｈ，加碱性磷酸酶标记IgG(1∶400)作为二抗，孵育、洗膜后，将膜浸入10ml碱性磷酸酶底物缓冲液与33μｌ四唑氮蓝(NBT)和66μｌ(BCIP)制成的显色液，室温闭光显色20min，蒸馏水终止反应。
2 结 果
　Survivin基因的获得与鉴定　
以逆转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR电泳结果显示一条约为425ｂｐ大小的特异性条带。此DNA带与survivin基因的大小相符合(425ｂｐ)，图中未见有其他非特异扩增带出现(图1)。将该DNA带回收后，DNA测序结果表明，经逆转录PCR获得的DNA片段为survivin基因，其DNA序列与GeneBank中报道的survivin基因序列吻合。
　Survivin基因的克隆及真核表达载体/survivin的酶切结果
Survivin基因插入表达载体后，提取获得的重组质粒/ survivin，以双酶切鉴定，鉴定结果发现其中有一425bp的条带为转染基因survivin产物。
　Survivin蛋白表达
将正确的重组菌在37℃活化过夜，经IPTG诱导表达后做SDS-PAGE分析，从电泳图可以看出在表达蛋白理论相对分子质量(×103)对应处出现了一条新的表达带。
3 讨 论
近年来已陆续有文献报道survivin蛋白在头颈部肿瘤组织中的表达[1~3 ]，本文通过分子生物学方法克隆扩增喉癌组织中survivin基因，构建真核表达载体，并转染cos-7细胞，为下一步研究survivin基因并探索肿瘤的生物治疗奠定基础。
Survivin是近年来发现的一种新的凋亡抑制因子，属于凋亡抑制蛋白家族的新成员，是迄今发现最强的一种凋亡抑制蛋白，主要通过抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻断细胞凋亡过程，而且能在细胞有丝分裂前期通过与纺锤体微管发生特异性结合反应，使肿瘤细胞逃避细胞周期Ｇ2/Ｍ期检测点的监控，抵抗因DNA损伤和突变自身诱导的细胞凋亡，从而导致肿瘤细胞异常分裂增殖。Survivin主要表达于胚胎和发育的胎儿组织，同时高表达于多种肿瘤组织和转化细胞，在成人各种正常器官中检测不到。近年来研究发现，在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、口腔鳞癌、鼻咽癌和造血系统肿瘤中survivin均过度表达[5，6]。由于survivin仅特异性地表达于肿瘤组织，在正常成人组织几乎不表达，使得应用survivin特异性抗体作免疫治疗、决定基因突变以及反义survivin基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性，具有成为喉癌治疗的潜在新靶点[7，8]。
我们以人喉癌组织总RNA为模板，扩增survivin基因，插入原核表达载体，成功地表达了survivin蛋白。不仅证实了survivin在喉癌组织中有表达，而且为进一步研究其在喉癌及其他恶性肿瘤的诊断、靶向性治疗及预后判断中的应用意义奠定了基础。
但有关survivin促进肿瘤发生、发展的许多环节还不清楚。随着对survivin研究的进一步深入，survivin在肿瘤发生、发展中的作用机制必将进一步阐明，而survivin的靶向肿瘤疗法及针对性开发新的抗肿瘤药物对肿瘤的治疗将具有深远的意义。
【参考文献】
[1] Salz W, Eisenberg D, Plescia J. A survivin gene signature predicts aggressive tumor behavior[J]. Cancer Res, 2005, 65(9): 3531-3534.
Zhu J, Xu RJ, Wu ZH, et al. Expression of survivin gene and its relationship with expression of p15, p16 proteins in laryngeal squamous cell carcinomas[J]. Zhonghua Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi, 2004, 9(6):356-359.
Badran A, Yoshida A, Ishikawa K, et al. Identification of a novel splice variant of the human anti-apoptopsis gene survivin[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 314(3):902-907.
Pisarev V, Yu B, Salup R. Full-length dominant-negative survivin for cancer immunotherapy[J]. Clin Cabcer Res, 2003, 9(17): 6523-6533.
Altieri DC. Validating survivin as a cancer therapeutic target[J]. Nat Rev Cancer, 2003, 3(1):46-54.
Nasu S, Yagihashi A, Izawa A, et al. Survivin mRNA expression in patients with breast cancer[J]. Anticancer Res, 2002, 22(3):1839-1843.
Calderon AJ, Lavergne JA. RNA interference:a novel and physiologic mechanism of gene silencing with great therapeutic potential[J]. P R Health Sci J, 2005, 24(1):27-33.
Cheng Q, Wang WL. Knockdown of survivin gene expression by RNAi induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721[J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(5): 756-759.