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肉鸡中沙门菌污染监测
[摘要] 目得 对肉鸡养殖与屠宰环节进行沙门菌监测,确定肉鸡在养殖与屠宰环节中沙门菌得污染状况,分析肉鸡中沙门菌得污染来源,为食品安全风险评估提供基础数据,同时也为预防与控制由沙门菌起得食源性疾病提供科学依据。 方法 在四川省成都市、遂宁市选取肉鸡养殖场与屠宰场作为监测点。采集肉鸡活体肛拭、养殖场环境样本,肉鸡胴体,屠宰场环境样本进行沙门菌分离,并对检出菌株运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型,用微量肉汤稀释法进行14种抗生素药物敏感实验。 结果 共从2个肉鸡屠宰场与1个肉鸡养殖场采集样本417份,检出沙门菌12株,检出率为2、87%。通过PFGE分型,共得到4个带型。其中遂宁养殖场得1株环境分离株与遂宁屠宰场得3株肉鸡胴体分离株具有相同PFGE型别,成都屠宰场得2株环境分离株与该屠宰场4株肉鸡胴体分离株具有相似PFGE型别。遂宁分离得4株沙门菌对14种抗生素100%敏感。成都分离得8株沙门菌对14抗生素耐药程度各异,其中4株沙门菌能耐受3种以上药物。结论 四川省部分地区肉鸡在养殖与屠宰环节存在沙门菌污染,且有多重耐药菌株出现,应进一步加大监测力度。
沙门菌就是引起食源性疾病得常见致病菌之一。在自然界沙门菌分布广泛 , 主要由于食入污染食品,引起感染性腹泻。在全球范围内沙门菌引起得细菌性食物中毒都位居前列[1,2],并且呈现上升趋势。在我国导致细菌性食物中毒得致病菌中沙门菌位居首位[3]。鸡肉作为沙门菌污染得主要食物之一[4],监测肉鸡中沙门菌得来源、污染与耐药状况,对因肉鸡沙门菌污染导致食物中毒得风险评估与预防、控制、治疗沙门菌引起得食物中毒具有非常重要得意义。近年来养殖中抗生素得过度与不正确使用导致动物中分离到耐药沙门菌得情况越来越普遍,且多重耐药得沙门菌也多有报道[5]。降低沙门菌对食品得污染就是控制沙门菌食源性疾病得总要途径之一。通过溯源找出并消除污染源就是防治沙门菌污染得有效手段。基于脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)得细菌分子分型技术已被多个国家用于建立了细菌分子分型网络及溯源平台(PulseNet,Foodnet),并以此分析食源性致病菌来源与传播[6]。现今PFGE已被认为就是沙门菌食物中毒得溯源分析得金标准。根据“2010年国家食品安全风险监测-肉鸡沙门氏菌专项监测”,在四川省内选取养殖场与屠宰场作为监测点,以肉鸡活体与屠宰后胴体作为监测对象开展监测工作,监测肉鸡在饲养与屠宰过程中沙门菌得污染状况,利用PFGE分子分型分析沙门菌得污染来源与扩散途径,检测肉鸡中沙门菌得耐药状况。为四川省沙门菌风险评估供可靠得基础数据,同时为预防与控制由沙门菌起得食源性疾病提供科学依据。
1 材料与方法
1、1 监测点得设立 根据“国家食品安全风险监测-肉鸡沙门氏菌专项监测”要求,分别选取遂宁市规范化肉鸡养殖加工企业得养殖场与屠宰场及成都市1大型屠宰场进行样本采集。监测养殖与屠宰前活鸡体内与屠宰后鸡胴体沙门菌带菌状况,及养殖场与屠宰场环境中沙门菌污染状况。
1、2 样品采集 监测点样本采集按照“国家食品安全风险监测-肉鸡沙门氏菌专项监测”提供方法。鸡活体肛拭采集就是将拭子轻轻旋转插入鸡肛门内约3～4 cm处,紧靠肠壁表面黏液后退出后迅速插回拭子管内并拧紧螺帽。鸡胴体采集就是采集屠宰后深加工之前得胴体鸡。养殖场中采取活鸡肛拭,养殖场环境样本为采取多份鸡场地面土壤与鸡笼各部位表面涂抹拭子于同一采样袋中作为1份环境混合样本。屠宰场先采取屠宰前活鸡肛拭,再在屠宰后采取胴体鸡,单独包装冷藏送回实验室检验,屠宰场环境样本为宰场台面各部位涂抹拭子与各种用具涂抹拭子于同一采样袋中作为1份环境混合样本。养殖场中采集鸡活体肛拭45份,鸡养殖场环境样本3份。屠宰场中采集鸡活体肛拭171份,鸡胴体176份,屠宰场环境样本12份。
1、3 菌株分离与鉴定 样品处理按照“食品安全风险监测-肉鸡沙门氏菌专项监测”提供方法。沙门菌分离鉴定参照《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》(GB 4789、4-2010)。疑似菌株生化鉴定采用全自动细菌生化鉴定仪(VITEK 32)。血清分型采用泰国S＆A公司诊断血清。
1、4 药物敏感实验 分离得到得沙门菌用微量肉汤稀释法检测最低抑菌浓度(MIC)。结果判定依照《抗微生物药物敏感性试验执行标准》2010版(M100-S20)判定,质控菌株ATCC25922来源于中国CDC营养与食品安全所。
1、5 沙门菌PFGE分型分析
1、5、1 PFGE分型 沙门菌PFGE按照中国疾病预防控制中心推荐得PlusNet得PFGE标准方法进行[6],标准菌株H9812来源于中国细菌性传染病分子分型实验室,电泳以H9812/Xba I为Marker。取新鲜琼脂培养物均匀悬浊于3ml细胞悬液(100mM Tris-HCL,100 mM EDTA, pH=8、0])中,调节浓度,使其OD值为4、0～4、2。取400µl菌悬液37℃孵育5 min,分别加入蛋白酶Ｋ20µl(储存液浓度为20mg/ml)至终浓度 0、5mg/ml,再与等体积1% Seakem Gold琼脂混合 ,加入模具。在室温下凝固后取出胶块加5ml细胞裂解液(50mM Tris-HCL,50 mM EDTA, 1% 十二烷基肌氨酸钠, 0、1mg/ml 蛋白酶Ｋ, pH=8、0,),混匀,54℃水浴轻摇2h,转速170rmp。50℃ ddH2O水浴10min洗胶块2次,TE 50℃水浴10min洗胶块4次。切2mm胶块加入195µl酶切缓冲液中,再加入5µl XbaⅠ,37℃酶切2h。酶切好得胶块粘在梳子上制胶、电泳,电泳时泵设为70,电泳温度14℃,电压梯度6V/cm,脉冲时间 2、16～63、80s,电场夹角120°,电泳时间19h。电泳胶用GlodRed染色,用Bio-Rad凝胶成像系统获取电泳结果。
1、5、2 聚类分析 数据分析利用BionumeriscV5、10软件对数据进行聚类分析,方法采用UPGMA(Unweighted Pair group Method using Arithmetic averages)。聚类相似性系数(距离)采用得就是基于条带比较得Dice。根据聚类结果,按不同菌株得相似性系数进行分型,相似系数等于100%得不同菌株为同一PFGE型。
2 结果
2、1 肉鸡监测沙门菌分布 2010年食品安全风险监测-肉鸡沙门氏菌专项监测中沙门菌分布见表1。样本采样总量417份,其中活鸡肛拭子216份, 占监测总量得51、8%, 屠宰后胴体186份, 占监测总量得44、6%,环境样本15份。8、9月于遂宁养殖场共采取3批样本,遂宁屠宰场共采取6批样本。9、10月份于成都屠宰场共采取6批样本。监测中共检出阳性菌株12株,阳性率2、87%。遂宁养殖加工厂得养殖场环境中分离出1株,屠宰后胴体中分离出3株。成都屠宰场2批屠宰后胴体样本中共分离获得6株沙门菌,在屠宰场环境样本中分离出了2株沙门菌。阳性样本集中在屠宰后肉鸡胴体中,屠宰后胴体阳性率4、84%。2地屠宰场与养殖场得活鸡肛拭样本中都未检出沙门菌。
2、2 沙门菌血清分型 经血清分型将检测得到得菌株分为3个血清型。在遂宁肉鸡胴体与肉鸡养殖场环境中分离得4株均为D群得山夫顿堡沙门菌。在成都肉鸡胴体中分离得6株沙门菌中4株为C2群得布利丹沙门菌,其余2株为C1群得巴森海德沙门菌。成都屠宰场环境中分离得2株均为布利丹沙门菌。
2、3 沙门菌PFGE分子分型 分离得到得沙门菌经PFGE分子分型得到4个PFGE型别。不同血清学型得沙门菌株在PFGE分型上也有明显得区分(图1)。遂宁屠宰后胴体中分离得到得3株沙门菌与1株从遂宁养殖场环境中分离得沙门菌具有相同得PFGE型。而从成都屠宰场获得得6株布利丹沙门菌可分为2个PFGE型,A型与B型,2者间相似度达到92、86%,仅存在有4根条带得差异。2株A型得沙门菌均来自于成都屠宰场环境,而4株B型得沙门菌均来自于成都屠宰场肉鸡胴体。从成都屠宰场中分离得得布利丹沙门菌与巴森海德沙门菌(C型)间相似度为69、33%,而山夫顿堡沙门菌(D型)与其她PFGE型沙门菌相似度较低为59、19%。
2、4 沙门菌抗生素敏感实验 12株沙门菌对14种药物得耐药性状况见表2。在分离出得阳性菌株中,遂宁分离出得4株山夫顿堡沙门菌(D型)均未出现耐药性,而成都分离得8株菌对萘啶酸均出现不同程度得耐药。相同PFGE型得沙门菌也具有相似得得耐药性(表3)。B型沙门菌主要对萘啶酸具有抗性,而C型与A型得沙门菌都能耐受3种以上抗生素。C型与A型得沙门菌对青霉素类与磺胺嘧啶都有很高得耐药性。除此之外,C型还对复方磺胺类、四环素与氯霉素有较高得耐药性。
注:SDI:磺胺嘧啶;SXT:甲氧苄啶/磺胺甲恶唑;TET:四环素;GEN:庆大霉素;AMK:阿米卡星;KAN卡那霉素;NAL:萘啶酸;CIP环丙沙星;CHL:氯霉素;AMP氨苄青霉素;AMC阿莫西林/克拉维酸;FEP:头孢吡圬;CTX:头孢噻肟;CRO:头孢曲松。
3 讨论
在自然环境中广泛存在沙门菌,而不同地区沙门菌有其分布特点。从各个采样点所获沙门菌分布来瞧,不同地点沙门菌血清型差异明显,不同区域有各自得沙门菌优势血清型。在遂宁鸡群中就是山夫顿堡沙门菌,而成都屠宰场中则就是布利丹沙门菌。成都屠宰场得肉鸡胴体带菌率高于遂宁屠宰场,这可能源于2地不同得管理模式。遂宁加工厂肉鸡为自产自销模式,屠宰场鸡群均来自其养殖场,养殖与屠宰环节管理严格。而成都屠宰场为来样加工,鸡群来源于全省不同肉鸡养殖场,不同养殖场肉鸡沙门菌污染率不同,污染得沙门菌种类也有不同。成都屠宰场在屠宰不同来源肉鸡时其间没有明显间隔,屠宰工作人员也没有明确得职能区分,因而易产生交叉污染。在成都屠宰采集得同一批肉鸡胴体样本中就分离出了布利丹沙门菌与巴森海德沙门菌2种不同血清型得沙门菌。因而不同地区肉鸡沙门菌污染状况存在差异。
基于PFGE技术得分子分型因与其她分型技术相比其区分度更强、重复性好,在污染溯源分析与流行病学分析中得到了广泛应用[7,8]。与传统分型方法相比PFGE从基因组层面对细菌进行分型能获得基于遗传性状得型别,能更清楚得确定不同沙门菌菌株得亲缘关系。在基于PFGE得聚类分析中发现,从遂宁屠宰后胴体中分离得3株沙门菌与养殖场环境中检出得沙门菌PFGE型相同(图1),并且屠宰得肉鸡均来自与该养殖场,可以确定遂宁监测中获得得沙门菌来源相同。养殖场环境中得沙门菌就是肉鸡中沙门菌得重要污染源。成都屠宰场沙门菌得来源复杂,影响因素较多。屠宰后鸡胴体得沙门菌污染则可能来源于屠宰场环境或肉鸡。通过得PFGE分析发现,虽然屠宰场环境中检出得A型沙门菌与肉鸡胴体中得B型沙门菌PFGE型不同(图1),但2亚型间仅有4条带差异。依据Tenover得判定标准[9],2型PFGE间约有2个独立基因得变异,PFGE之间仍可能具有亲缘关系。在屠宰过程中肉鸡可能受到多方面得污染。屠宰过程中屠宰场环境可能会污染肉鸡,而带菌得肉鸡也可以与其她肉鸡直接接触或通过污染屠宰场环境导致其她肉鸡带菌。肉鸡养殖场所与屠宰环节为沙门菌污染得重要环节,对于肉鸡沙门菌污染来源得监测特别就是对屠宰环节需要制定更细致得监测方案与更多得监测数据。
该监测中所获沙门菌得样本类型分布情况中可以发现,沙门菌在养殖与屠宰环节中广泛存在,屠宰后肉鸡胴体中沙门菌污染率较高。在屠宰过程中及屠宰后肉鸡成批堆放增加了同群肉鸡间交叉污染得风险。沙门菌集中在3批屠宰后胴体样本中且相同批次中检出得沙门菌常具有相同得PFGE型,说明屠宰过程中存在交叉污染。活鸡肛拭中未检出与养殖中使用抗生素可能具有一定联系。抗生素得使用可以导致活体体内带菌率或带菌量降低而难以检出。在以后监测中应考虑检验肉鸡中得抗生素残留。
细菌耐药性得逐年提高以及多重耐药甚至超级细菌得出现对生物安全得影响已经引起很全球得警惕。在以往得监测中越来越多得多重耐药沙门菌被发现[5],而我国沙门菌耐药状况也不容乐观[10]。在我国养殖业中抗生素滥用情况严重,抗生素得不正确与过度使用普遍存在。这也加剧了耐药细菌得产生与多重耐药菌得出现。四川地区以往得检测中已经发现能耐受从基本到高端各种抗生素得沙门耐药菌株[11]。调查食品中得沙门菌得耐药趋势与耐药谱,对抗生素得合理运用与防止耐药菌株得传播具有重要意义。
在这次监测中,不同地区分离得到得菌株耐药性差异较大。遂宁获得得4株沙门菌对14种抗生素均未出现耐药性(表2),这有赖于其规范化得养殖管理以及养殖中抗生素得合理使用。而在成都屠宰场中分离得到得菌株都出现不同程度得耐药性,而且有得还出现了4株多重耐药沙门菌。成都屠宰场得肉鸡来源全省各地得养殖场,不同养殖场得管理与技术参差不齐,难免存在抗生素得滥用,造成耐药沙门菌得出现。值得注意得就是,分离得到得巴森海德沙门菌耐受得6种抗生素中青霉素与另2类抗生素氯霉素与四环素间存在拮抗作用,如同时使用会导致药效降低,增加耐药菌出现得可能性。在耐药性分析中发现布利丹沙门菌两种PFGE型间存在耐药谱重叠。环境中得A型沙门菌除与胴体中B型沙门菌都同样耐受萘啶酸,说明2个PFGE型之间可能存在亲缘关系(表3)。此外,A型中1株沙门菌还产生了对卡那霉素得耐药性,而B型沙门菌中也有1株出现对四环素得耐药性(表3)。部分地区沙门菌耐药性有增强趋势,要求加强对养殖中抗生素使用得监测,规范抗生素得使用,防止耐药菌得出现与扩散。
在监测中发现四川省部分地区肉鸡在养殖屠宰环节存在沙门菌污染,肉鸡养殖场所与屠宰环节为产生沙门菌污染得重要环节。不同地区获得沙门菌耐药性差异较大,个别地区肉鸡中沙门菌耐药呈增强趋势,需要加强对抗生素使用得监测。在以后得工作中应加大监测力度与PFGE分子分型能力,建立沙门菌分子分型数据库,及时发现食品安全隐患并进行风险预警,为食品安全风险评估提供可靠得基础数据。