化学色谱分析导论.pptx

第十一章第十一章 色色谱法法导论11-1 11-1 概述概述 色色谱法法是是一一种种分分离离技技术，这种种分分离离技技术应用用于于分分析析化化学学，就就是是色色谱分分析析。它它适适用用于于有有机机混混合合物物的的分分离离提提纯和和分分析析测定定，在在中中药分分析析领域有着广泛的用途。域有着广泛的用途。由由于于同同学学们对色色谱这个个名名词很很陌陌生生，先先举一一个个例例子子，对色色谱分分析析的的整整个个过程程作作一一简单说明。明。一、色一、色谱法定法定义 基基于于物物质各各种种物物理理化化学学的的性性质的的微微小小差差异异，使使组分分在在流流动相相和和固固定定相相两两相相之之间的的分分布布系系数数不不同同，而而当当两两相相作作相相对运运动时，组分分在在两两相相间进行行连续多多次次分分配配，实现组分分分分离离，达达到到彼彼此此分离的目的。分离的目的。通常根据根据以下几种性通常根据根据以下几种性质的差异：的差异：溶解度溶解度 分子极性分子极性 分子大小分子大小 吸附力吸附力 交交换能力能力 立体立体结构构 二、色二、色谱法法简介介 早早在在1903年年由由俄俄国国植植物物学学家家分分离离植植物物色色素素时首先采用。首先采用。后来不仅用于分离有色物质，还用于分离无色后来不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。19411941年年MartinMartin和和Synge Synge 发明了气相色谱，从色发明了气相色谱，从色谱过程的热力学角度出发，提出了塔板理论，谱过程的热力学角度出发，提出了塔板理论，19521952年获得诺贝尔化学奖。年获得诺贝尔化学奖。19561956年荷兰学者年荷兰学者Van Deemter Van Deemter 从从色谱过程的从从色谱过程的动力学角度出发，提出了速率理论。动力学角度出发，提出了速率理论。目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。重要的分离分析手段。二、色二、色谱过程的特点程的特点1 任任何何色色谱过程程，都都具具有有两两个个相相：不不动的的一一相相，称称一一为固固定定相相；另另一一相相是是携携带样品品流流过固固定定相相的的流流动体体，称称为流流动相。相。2 当当流流动相相中中样品品混混合合物物经过固固定定相相时，就就会会与与固固定定相相发生生作作用用，由由于于各各组分分在在性性质和和结构构上上的的差差异异，与与固固定定相相的的作作用用力力不不同同，因因此此固固定定相相滞滞留留时间长短短不不同同，从而达到分离。从而达到分离。14-214-2 色色谱法分法分类气气体体为流流动相相的的色色谱称称为气气相相色色谱（GCGC），根根据据固固定定相相是是固固体体吸吸附附剂还是是固固定定液液（附附着着在在惰惰性性载体体上上的的一一薄薄层有有机机化化合合物物液液体体），又又可可分分为气气固固色色谱（GS GS C C）和和气气液液色色谱（GLCGLC）液液体体为流流动相相的的色色谱称称液液相相色色谱（LCLC）。同同理理，液液相相色色谱亦亦可可分分为液液固固色色谱（LSCLSC）和液液色）和液液色谱（LLCLLC）。）。1 1按两相状态分类按两相状态分类2 2按分离机理分按分离机理分类 利利用用组分分在在吸吸附附剂（固固定定相相）上上的的吸吸附附能能力力强弱弱不不同而得以分离的方法，称同而得以分离的方法，称为吸附色吸附色谱法。法。利利用用组分分在在固固定定液液（固固定定相相）中中溶溶解解度度不不同同而而达达到到分离的方法称分离的方法称为分配色分配色谱法。法。利利用用组分分在在离离子子交交换剂（固固定定相相）上上的的亲和和力力大大小小不同而达到分离的方法，称不同而达到分离的方法，称为离子交离子交换色色谱法。法。利利用用大大小小不不同同的的分分子子在在多多孔孔固固定定相相中中的的选择渗渗透透而而达到分离的方法，称达到分离的方法，称为凝胶色凝胶色谱法或尺寸排阻色法或尺寸排阻色谱法。法。最最近近，又又有有一一种种新新分分离离技技术，利利用用不不同同组分分与与固固定定相相（固固定定化化分分子子）的的高高专属属性性亲和和力力进行行分分离离的的技技术称称为亲和色和色谱法，常用于蛋白法，常用于蛋白质的分离。的分离。3 3按固定相的外形分按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色固定相装于柱内的色谱法，称法，称为柱色柱色谱。固定相呈平板状的色固定相呈平板状的色谱法，称法，称为平板色平板色谱，它又可分它又可分为层色色谱和和纸色色谱。11-3 11-3 色色谱流出曲流出曲线及有关及有关术语一流出曲一流出曲线和色和色谱峰峰 如果如果进样量很小，量很小，浓度很低，在吸附等温度很低，在吸附等温线的的线性范性范围内，色内，色谱峰如果峰如果对称，可用称，可用GaussGauss正正态分分布函数表示：布函数表示：式式中中：C C不不同同时间t t时某某物物质的的浓度度，C C0 0进样浓度，度，t tr r保留保留时间，标准偏差。准偏差。二、基二、基线 是柱中是柱中仅有流有流动相通相通过时，检测器响器响应讯号的号的记录值，稳定的基定的基线应该是一条水平直是一条水平直线 三、峰高三、峰高 色色谱峰峰顶点与基点与基线之之间的垂直距离，以的垂直距离，以h h表示表示四、保留四、保留值1 1死死时间t tM M 不被固定相吸附或溶解的物不被固定相吸附或溶解的物质进入色入色谱柱柱时，从，从进样到出到出现峰极大峰极大值所需的所需的时间称称为死死时间。因。因为这种物种物质不被固定相吸不被固定相吸附或溶解，故其流附或溶解，故其流动速度将与流速度将与流动相的流相的流动速度相近速度相近测定流定流动相平均相平均线速速 时，可，可用柱用柱长L L与与t tM M的比的比值计算。算。2 2保留保留时间t tR R 试样从从进样开始到柱后出开始到柱后出现峰极大峰极大点点时所所经历的的时间，称，称为保留保留时间，它，它相相应于于样品到达柱末端的品到达柱末端的检测器所需的器所需的时间 3调整保留时间调整保留时间tR 某组份的保留时间扣除死时间后某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即称为该组份的调整保留时间，即 tR=tR-tM 由由于于组份份在在色色谱柱柱中中的的保保留留时间t tR R包包含含了了组份份随随流流动相相通通过柱柱子子所所需需的的时间和和组份份在在固固定定相相中中滞滞留留所所需需的的时间，所所以以t tR R实际上上是是组份份在在固固定定相相中中停停留留的的总时间保保留留时间可可用用时间单位位（如如s s）或或距距离离单位位（如如cmcm）表示。表示。保留保留时间是色是色谱法定性的基本依据，但法定性的基本依据，但同一同一组份的保留份的保留时间常受到流常受到流动相流速的影相流速的影响，因此色响，因此色谱工作者有工作者有时用保留体用保留体积等参数等参数进行定性行定性检定定 4 4死体死体积 V VM M 指指色色谱柱柱在在填填充充后后，柱柱管管内内固固定定相相颗粒粒间所所剩剩留留的的空空间、色色谱仪中中管管路路和和连接接头间的的空空间以以及及检测器器的的空空间的的总和和当当后后两两项很很小小而而可可忽忽略略不不计时，死死体体积可可由由死死时间与流与流动相体相体积流速流速F F0 0（L Lminmin）计算：算：V VM M=t=tM MF F0 0 5 5保留体保留体积 V VR R 指从指从进样开始到被开始到被测组份在柱后出份在柱后出现浓度极大点度极大点时所通所通过的流的流动相体相体积。保留体。保留体积与保留与保留时间t t。的关系如下：。的关系如下：V VR R=t=tR RF F0 0 6 6调整保留体整保留体积V VR R 某某组份份的的保保留留体体积扣扣除除死死体体积后后，称称该组份的份的调整保留体整保留体积，即，即 V VR R=V=VR R-V-VM M 7 7相相对保留保留值2.12.1 某某组份份2 2的的调整整保保留留值与与组份份1 1的的调整整保保留留值之比，称之比，称为相相对保留保留值：选择因子因子 在定性分析中，通常固定一个色在定性分析中，通常固定一个色在定性分析中，通常固定一个色在定性分析中，通常固定一个色谱谱峰作峰作峰作峰作为标为标准准准准（s s），然后再求其它峰（），然后再求其它峰（i i）对这个峰的相个峰的相对保留保留值此此时，r ri/si/s可能大于可能大于1 1，也可能小于，也可能小于1 1在多元混合在多元混合物分析中，通常物分析中，通常选择一一对最最难分离的物分离的物质对，将它，将它们的相的相对保留保留值作作为重要参数在重要参数在这种特殊情况下，可种特殊情况下，可用符号用符号表示：表示：式中式中t tR2R2为后出峰的后出峰的调整保留整保留时间，所，所以以这时总是大于是大于1 1的的 。五、区域五、区域宽度度 色色谱峰的区域峰的区域宽度是度是组份在色份在色谱柱中柱中谱带扩张的函数，它反映了色的函数，它反映了色谱操作条件的操作条件的动力学因素度量色力学因素度量色谱峰区域峰区域宽度通常有三种度通常有三种方法：方法：1.1.标准偏差准偏差 即即0 0607607倍峰高倍峰高处色色谱峰峰宽的一半。的一半。2.2.半峰半峰宽W W1/2 1/2 即峰高一半即峰高一半处对应的峰的峰宽它与它与标准偏差准偏差的关系是：的关系是：W W1/21/2=2.354=2.3543.3.基基线宽度度W W 即即色色谱峰峰两两侧拐拐点点上上的的切切线在在基基线上的截距它与上的截距它与标准偏差。的关系是：准偏差。的关系是：W=4 W=4 从色从色谱流出曲流出曲线上，可以得到上，可以得到许多重要信息：多重要信息：(1)(1)根根据据色色谱峰峰的的个个数数，可可以以判判断断样品品中中所所合合组 份的最少个数份的最少个数 (2)(2)根根据据色色谱峰峰的的保保留留值(或或位位置置），可可以以进行行定性分析定性分析 (3)(3)根根据据色色谱峰峰下下的的面面积或或峰峰高高，可可以以进行行定定量分析量分析 (4)(4)色色谱峰峰的的保保留留值及及其其区区域域宽度度，是是评价价色色谱柱分离效能的依据柱分离效能的依据 (5)(5)色色谱峰两峰峰两峰间的距离，是的距离，是评价固定相价固定相(和流和流动相相)选择是否合适的依据是否合适的依据 11-4 11-4 色色谱法分析的基本原理法分析的基本原理 色色谱分析的目的是将分析的目的是将样品中各品中各组分彼分彼此分离，此分离，组分要达到完全分离，两峰分要达到完全分离，两峰间的的距离必距离必须足足够远，两峰，两峰间的距离是由的距离是由组分分在两相在两相间的分配系数决定的，即与色的分配系数决定的，即与色谱过程的程的热力学性力学性质有关。但是两峰有关。但是两峰间虽有一有一定距离，如果每个峰都很定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重，以致彼此重叠，叠，还是不能分开。是不能分开。这些峰的些峰的宽或窄是由或窄是由组分在色分在色谱柱中柱中传质和和扩散行散行为决定的，决定的，即与色即与色谱过程的程的动力学性力学性质有关。因此，有关。因此，要从要从热力学和力学和动力学两方面来研究色力学两方面来研究色谱行行为。一、分配系数一、分配系数K K和分配比和分配比k k1 1分配系数分配系数K K 分配色分配色谱的分离是基于的分离是基于样品品组分在固定相和流分在固定相和流动相之相之间反复多次地分配反复多次地分配过程，而吸附色程，而吸附色谱的分离的分离是基于反复多次地吸附一脱附是基于反复多次地吸附一脱附过程。程。这种分离种分离过程程经常用常用样品分子在两相品分子在两相间的分配来描述，而描述的分配来描述，而描述这种分配的参数称种分配的参数称为分配系数分配系数见它是指在一定温度和它是指在一定温度和压力下，力下，组分在固定相和流分在固定相和流动相之相之间分配达平衡分配达平衡时的的浓度之比度之比值，即，即 2.2.分配比分配比k k 分配比又称容量因子，它是指在一定温度分配比又称容量因子，它是指在一定温度和和压力下，力下，组分在两相分在两相间分配达平衡分配达平衡时，分配，分配在固定相和流在固定相和流动相中的相中的质量比。即量比。即 k k值越大，越大，说明明组分在固定相中的量越多，分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色子。它是衡量色谱柱柱对被分离被分离组分保留能力的重分保留能力的重要参数。要参数。k k值也决定于也决定于组分及固定相分及固定相热力学性力学性质。它不它不仅随柱温、柱随柱温、柱压变化而化而变化，而且化，而且还与流与流动相及固定相的体相及固定相的体积有关。有关。式式中中CsCs、CmCm分分别为组分分在在固固定定相相和和流流动相相的的浓度度；VmVm为柱柱中中流流动相相的的体体积，近近似似等等于于死死体体积。VsVs为柱柱中中固固定定相相的的体体积，在在各各种种不不同同的的类型型的的色色谱中中有有不不同同的的含含义。例例如如：在在分分配配色色谱中中，VsVs表表示示固固定定液液的的体体积；在在尺尺寸寸排排阻阻色色谱中，中，则表示固定相的孔体表示固定相的孔体积。3.3.分配系数分配系数K K与分配比与分配比k k的关系的关系 其中其中称称为相比率，它是反映各种色相比率，它是反映各种色谱柱型特点柱型特点的又一个参数。例如，的又一个参数。例如，对填充柱，其填充柱，其值一般一般为6 63535；对毛毛细管柱，其管柱，其值为6060600600。二、塔板理二、塔板理论 最早由最早由MartinMartin等人提出塔板理等人提出塔板理论，把色，把色谱柱比作一个精柱比作一个精馏塔，沿用精塔，沿用精馏塔中塔板的概塔中塔板的概念来描述念来描述组分在两相分在两相间的分配行的分配行为，同，同时引人引人理理论塔板数作塔板数作为衡量柱效率的指衡量柱效率的指标。该理理论假定：假定：（i i）在在柱柱内内一一小小段段长度度H H内内，组分分可可以以在在两两相相间迅迅速达到平衡。速达到平衡。这一小段柱一小段柱长称称为理理论塔板高度塔板高度H H。（iiii）以以气气相相色色谱为例例，载气气进入入色色谱柱柱不不是是连续进行行的的，而而是是脉脉动式式，每每次次进气气为一一个个塔塔板板体体积（VVm m）。）。（iiiiii）所所有有组分分开开始始时存存在在于于第第0 0号号塔塔板板上上，而而且且试样沿沿轴（纵）向）向扩散可忽略。散可忽略。（iviv）分分配配系系数数在在所所有有塔塔板板上上是是常常数数，与与组分分在在某某一塔板上的量无关。一塔板上的量无关。为简单起起见，设色色谱往由往由5 5块塔板（塔板（n n5 5，n n为柱子的柱子的塔板数）塔板数）组成，并以成，并以r r表示塔板表示塔板编号，号，r=1r=1，2 2，n nl l；某；某组分的分配比分的分配比k=1.k=1.为简单起起见，设色色谱往往由由5 5块塔塔板板（n n5 5，n n为柱柱子子的的塔塔板板数数）组成成，并并以以r r表表示示塔塔板板编号号，r=1r=1，2 2，n nl l；某；某组分的分配比分的分配比k=1 k=1。根根据据上上述述假假定定，在在色色谱分分离离过程程中中，该组分分的分布可的分布可计算如下：算如下：开始开始时，若有，若有单位位质量，即量，即m=1m=1（例（例1g1g）的的该组分加到第分加到第0 0号塔板上，分配平衡后，由于号塔板上，分配平衡后，由于k=1k=1，即，即n ns s=n=nm m故故n nm m=n=ns s=0.5=0.5。当当一一个个板板体体积（lVlV）的的载气气以以脉脉动形形式式进入入0 0号号板板时，就就将将气气相相中中含含有有n nm m部部分分组分分的的载气气顶到到1 1号号板板上上，此此时0 0号号板板液液相相（或或固固相相）中中n ns s部部分分组分分及及1 1号号板板气气相相中中的的n nm m部部分分组分分，将将各各自自在在两两相相间重重新新分分配配。故故0 0号号板板上上所所含含组分分总量量为0.50.5，其其中中气气液液（或或气气固固）两两相相各各为0.250.25而而1 1号号板板上上所所含含总量量同同样为0.50.5气气液液（或或气气固固）相相亦亦各各为0.250.25。以以后后每每当当一一个个新新的的板板体体积载气气以以脉脉动式式进入入色色谱柱柱时，上上述述过程程就就重重复一次复一次(见下下图)。按上述分配按上述分配过程，程，对于于n=5n=5，k=1k=1，m=1m=1的体系，的体系，随着脉随着脉动进入柱中板体入柱中板体积载气的增加，气的增加，组分分布在分分布在柱内任一板上的柱内任一板上的总量。由塔板理量。由塔板理论可建流出曲可建流出曲线方方程：程：m m为组分分质量，量，V VR R为保留体保留体积，n n为理理论塔板数。塔板数。当当V=VV=VR R 时，C C值最大，即最大，即由流出曲由流出曲线方程可推出：方程可推出：而理而理论塔板高度（塔板高度（H H）即：）即：从从上上两两式式可可以以看看出出，色色谱峰峰W W越越小小，n n就就越越大大，而而H H就就越越小小，柱柱效效能能越越高高。因因此此，n n和和H H是描述柱效能的指是描述柱效能的指标。通通常常填填充充色色谱柱柱的的n n10103 3，H H1mm1mm。而毛而毛细管柱管柱 n=10n=105 5-10-106 6，H H0.5mm0.5mm 由于死由于死时t tm m包括在包括在t tR R中，而中，而实际的的t tm m不不参与柱内分配，所参与柱内分配，所计算的算的n n值尽大，尽大，H H很小，很小，但与但与实际柱效能相差甚柱效能相差甚远。所以，提出把。所以，提出把t tm m扣除，采用有效理扣除，采用有效理论塔板数塔板数n neffeff和有效塔板和有效塔板高高H Heffeff评价柱效能。价柱效能。塔板理塔板理论用用热力学力学观点形象地描述了溶点形象地描述了溶质在色在色谱柱中的分配平衡和分离柱中的分配平衡和分离过程，程，导出流出曲出流出曲线的数学模的数学模型，并成功地解型，并成功地解释了流出曲了流出曲线的形状及的形状及浓度极大度极大值的的位置，位置，还提出了提出了计算和算和评价柱效的参数。但由于它的价柱效的参数。但由于它的某些基本假某些基本假设并不完全符合柱内并不完全符合柱内实际发生的分离生的分离过程，程，例如，例如，纵向向扩能解能解释造成造成谱带扩张的原因和影响板高的原因和影响板高的各种因素，也不能的各种因素，也不能说明明为什么在不同流速下可以什么在不同流速下可以测得不同的理得不同的理论塔板数，塔板数，这就限制了它的就限制了它的应用。用。三、速率理论1956年荷兰学者vanDeemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。vanDeemter方程的数学简化式为式中u为流动相的线速度；A，B，C为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。现分别叙述各项系数的物理意义。1涡流扩散项A在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散，形象地如图所示。A2dp上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关，与流动相的性质、线速变和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散。因此A0。2.分子扩散项B/u（纵向扩散项）纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱人口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。如图所示。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为B2Dg式中是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dg为组分在流动相中扩散系数（cm2s-1）。3传质阻力项Cu由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同，现分别讨论之（l）对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即CCgCl气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进人两相界面又来不及返回气相。这样，使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。对于填充柱，气相传质阻力系数Cg为式中k为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度则的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数见成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可他Cg减小，提高柱效。液相传质阻力系数C1为由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数D1大，则液相传质阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使C1增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分离。虽然提高柱温可增大Dl，但会使k值减小，为了保持适当的Cl值，应控制适宜的柱温。将上面式将上面式总结总结，即可得气液色，即可得气液色谱谱速率板高方程速率板高方程这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。（2）对于液液分配色谱，传质阻力系数（C）包含流动相传质阻力系数（Cm）和固定相传质系数（Cs），即CCmCs其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，即式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力。当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀.m是由柱和填充的性质决定的因子。sm是一常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。液液色谱中固定相传质阻力系数（Cs）可用下式表示：该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。综上所述，对液液色谱的VanDeemter方程式可表达为：4 4流流动动相相线线速度速度对对板高的影响板高的影响 （1）LC和GC的Hu图表明，对于一定长度的柱子，柱效越高，理论塔板数越大，板高越小。但究竟控制怎样的线速度，才能达到最小板高呢？根据vanDeemter公式分别作LC和GC的Hu图，见图a（b）。由图a和（b）不难看出：LC和GC的Hu图十分相似，对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点；LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多LC的板高最低点相应流速比起GC的流速亦小一个数量级，说明对于LC，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。（2）分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献 5固定相粒度大小对板高的影响固定相粒度对板高的影响是至关重要的。实验表明不同粒度，Hu曲线也不同：粒度越细，板高越小，并且受线速度影响亦小。这就是为什么在HPLC中采用细颗粒作固定相的根据。当然，固定相颗粒愈细，柱流速愈慢。只有采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求。11-4 分离度 图说明了柱效和选择性对分离的影响。图中（a）两色谱峰距离近并且峰形宽。两峰严重相叠，这表示选择性和柱效都很差。图中（b）虽然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但技效低。图中（c）分离最理想，说明选择性好，柱效也高。由此可见，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，故需引人一个综合性指标分离度R。分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R1时，两峰有部分重叠；当R1时，分离程度可达98；当R15时，分离程度可达997。通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。下图表示了不同分离度时色谱峰分离的程度。11-5基本色谱分离方程式分离度R的定义并没有反映影响分离度的诸因素。实际上，分离度受柱效（n）、选择因子()和容量因子（k）三个参数的控制。对于难分离物质对，由于它们的分配系数差别小，可合理地假设k1k2=k,W1W2W。由上式，得后式即为基本色谱分离方程式 在实际应用中，往往用neff。代替n,处理上式可得可以看出，后者为基本色谱分离方程式又一表达式。1.分离度与柱效的关系分离度与柱效的关系由分离方程式看出，具有一定相对保留值的物质对，分离度直接和有效塔板数有关，说明有效塔板数能正确地代表柱效能。而分离方程式表明分离度与理论塔板数的关系还受热力学性质的影响。当固定相确定，被分离物质对的确定后，分离度将取决于n。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，即虽说虽说用用较长较长的柱可以提高分离度，但延的柱可以提高分离度，但延长长了分了分析析时间时间。因此提高分离度的好方法是制。因此提高分离度的好方法是制备备出一根性出一根性能能优优良的柱子，通良的柱子，通过过降低板高，以提高分离度。降低板高，以提高分离度。2.分离度与分离度与选择因子的关系因子的关系由基本色谱方程式判断，当=1时，R=0，这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，大，选择性好。研究证明，的微小变化，就能引起分离度的显著变化。一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有效增大值。3.分离度与容量因子的关系分离度与容量因子的关系如果设：,则分离方程式写成由几R/Qk的曲线图（图d3）看出：当k1O时，随容量因子增大，分离度的增长是微乎其微的。一般取k为210最宜。对于GC，通过提高温度，可选择合适的k值，以改进分离度。而对于LC，只要改变流动相的组成，就能有效地控制k值。它对LC的分离能起到立竿见影的效果（见图d4）。4.分离度与分析分离度与分析时间的关系的关系下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系。从上式，设则可得：由图d3中RQ或trQ对k的曲线可见，当k在25时，可在较短的分析时间，取得良好的分离度。5基本色基本色谱分离方程式的分离方程式的应用用在实际中，基本色谱分离方程式是很有用的公式，它将柱效、选择因子、分离度三者的关系联系起来了，知道其中两个指标，就可计算出第三个指标。例11-1有一根lm长的柱子，分离组分1和2得到如图d5的色谱图。图中横坐标l为记录笔走纸距离。若欲得到R=12的分离度，有效塔板数应为多少？色谱往要加到多长？解：先求出组分2对组分1的相对保留值r2，1（即值）求有效塔板数neffneff16（0.8）21.1/(1.1-1)21239若使R=1.2,所需塔板数可计算,即因此,欲使分离度达到1.2,需有效塔板数为2788块,则所需柱长为L=2788/13291m=2.25m例11-2 已知某色谱柱的理论塔板数为3600,组分A和B在该柱上的保留时间为27mm和30mm,求两峰的峰半宽和分离度.解:w1/2=w/1.7w1=27/(3600/16)1/2=1.8mm(w1)1/21.8/1.71.06mmw2=30/(3600/16)1/2=2.0mm(w2)1/22.0/1.71.18mmR2(30-27)/(1.8+2)6/3.81.6 例11-3已知一色谱柱在某温度下的速率方程的A=0.08cm;B=0.65cm2/s;C=0.003s,求最佳线速度u和最小塔板高H.解:欲求u最佳和H最小,要对速率方程微分,即dH/dud(A+B/u+Cu)/du-B/u2+C0而,最佳线速:u最佳(B/C)1/2最小板高:H最小A+2(BC)1/2可得u最佳(0.65/0.003)1/211.7cm/sH最小0.08+2(0.650.003)1/20.1683cm例例11-411-4已知物已知物质质A A和和B B在一个在一个30.0cm30.0cm柱上的保柱上的保留留时间时间分分别为别为16.4016.40和和17.6317.63分分钟钟.不被保留不被保留组组分通分通过过该该柱的柱的时间为时间为1.301.30分分钟钟.峰峰宽为宽为1.111.11和和1.21mm,1.21mm,计计算算:(1)(1)柱分辨本柱分辨本领领;(2)(2)柱的平均塔板数目柱的平均塔板数目;(3)(3)塔板高度塔板高度;(4)(4)达到达到1.51.5分离度所需的柱分离度所需的柱长长度度;(5)(5)在在较长较长柱上把物柱上把物质质B B洗脱所需要的洗脱所需要的时间时间.解:(1)R=2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06(2)nA=(16.40/1.11)2=3493nB=16(17.63/1.21)2=3397nav=(3493+3397)/2=3445=3.44103(3)H=L/n=30.0/3445=8.70810-3cm=8.7110-3cm(4)n2=34452.25/1.124=6.90103源于(n1/n2=R1/R2)2L=nH=6.901038.7110-3=60.1cm(5)tr2=tr1(R2/R1)2=17.631.52/1.062=35.3分钟