化学超临界色谱.pptx

4-5 4-5 超临界流体色谱法简介超临界流体色谱法简介 超临界流体色谱法超临界流体色谱法（Supercritical Fluid Chromatography,SFC）是以）是以超临超临界流体界流体作为流动相的一种色谱方法。作为流动相的一种色谱方法。所谓超临界流体，所谓超临界流体，是指既不是气体是指既不是气体也不是液体的一些物质，它们的物也不是液体的一些物质，它们的物理性质介于气体和液体之间理性质介于气体和液体之间。超临界流体色谱技术是超临界流体色谱技术是2O2O世纪世纪8080年年代发展起来的一种崭新的色谱技术。代发展起来的一种崭新的色谱技术。由于它具有气相和液相所没有的优点，由于它具有气相和液相所没有的优点，并能分离和分析气相和液相色谱不能并能分离和分析气相和液相色谱不能解决的一些对象，应用广泛，发展十解决的一些对象，应用广泛，发展十分迅速。分迅速。据据ChesterChester估计，至今约有全部分估计，至今约有全部分离的离的2525涉及难以对付的物质，通过涉及难以对付的物质，通过超临界流体色谱能取得较为满意的结超临界流体色谱能取得较为满意的结果。果。1超临界流体的特性 (1)(1)物质的临界点物质的临界点 我们知道，某些纯物质具有三相点我们知道，某些纯物质具有三相点和临界点。纯物质的相图见图和临界点。纯物质的相图见图4-s1由三由三相图看出：物质在三相点下，气、液、相图看出：物质在三相点下，气、液、固三态处于平衡状态。而在物质的超临固三态处于平衡状态。而在物质的超临界温度下，其气相和液相具有相同的密界温度下，其气相和液相具有相同的密度。当处于临界温度以上，则不管施加度。当处于临界温度以上，则不管施加多大压力，气体也不会液化。多大压力，气体也不会液化。在临界温度和临界压力以上，物质在临界温度和临界压力以上，物质是以超临界流体状态存在。即在超临界是以超临界流体状态存在。即在超临界状态下，随温度、压力的升降，流体的状态下，随温度、压力的升降，流体的密度会变化。此时的物质既不是气体也密度会变化。此时的物质既不是气体也不是液体，却始终保持为流体不是液体，却始终保持为流体。临界温。临界温度通常高于物质的沸点和三相点。度通常高于物质的沸点和三相点。（2 2）超临界流体的特性）超临界流体的特性 超超临临界界流流体体具具有有对对于于分分离离极极其其有有利利的的物物理理性性质质。它它们们的的这这些些性性质质恰恰好好介介于于气气体体和和液液体体之之间间。超超临临界界流流体体的的扩扩散散系系数数和和粘粘度度接接近近于于气气相相色色谱谱，因因此此溶溶质质的的传传质质阻阻力力小小，可可以以获获得得快快速速高高效效分分离离。另另一一方方面面，其其密密度度与与液液相相色色谱谱类类似似，这这样样就就便便于于在在较较低低温温度度下下分分离离和和分分析析热热不不稳定性、相对分子质量大的物质。稳定性、相对分子质量大的物质。另外，超临界流体的物理性质和另外，超临界流体的物理性质和化学性质，如扩散、粘度和溶剂力等，化学性质，如扩散、粘度和溶剂力等，都是密度的函数。因此，只要改变流体都是密度的函数。因此，只要改变流体的密度，就可以改变流体的性质，从类的密度，就可以改变流体的性质，从类似气体到类似液体，无需通过气液平衡似气体到类似液体，无需通过气液平衡曲线。超临界流体色谱中的曲线。超临界流体色谱中的程序升密度程序升密度相当于气相色谱中程序升温度和液相色相当于气相色谱中程序升温度和液相色谱中的梯度淋洗。谱中的梯度淋洗。通常作为超临界流体色谱流动相的通常作为超临界流体色谱流动相的一些物质，其物理性质列在表一些物质，其物理性质列在表4-14-1中中。2超临界流体色谱仪 19851985年出现第一台商品型的超临年出现第一台商品型的超临界流体色谱仪。图界流体色谱仪。图4-s64-s6表示了超临界表示了超临界流体色谱仪的一般流程。流体色谱仪的一般流程。图中很多部分类似于高效液相图中很多部分类似于高效液相色谱仪，色谱仪，但有两点重要差别：但有两点重要差别：（l）具有一根恒温的色谱柱。这点）具有一根恒温的色谱柱。这点类似气相色谱中的色谱柱，目的是为了类似气相色谱中的色谱柱，目的是为了提供对流提供对流 动相的精确温度控制。动相的精确温度控制。（2）带有一个）带有一个限流器限流器（或称反压（或称反压装置）。目的用以对柱维持一个合适的装置）。目的用以对柱维持一个合适的压力，并且通过它使流体转换为气体后，压力，并且通过它使流体转换为气体后，进入检测器进行测量。实际上，可把限进入检测器进行测量。实际上，可把限流器看作柱末端延伸流器看作柱末端延伸 部分部分3压力效应 在在在在SCFSCF中，压力的变化对容量因中，压力的变化对容量因中，压力的变化对容量因中，压力的变化对容量因子子子子k k产生显著影响，由于以超流体作为产生显著影响，由于以超流体作为产生显著影响，由于以超流体作为产生显著影响，由于以超流体作为流动相，它的密度随压力增加而增加，流动相，它的密度随压力增加而增加，流动相，它的密度随压力增加而增加，流动相，它的密度随压力增加而增加，而密度的增加引起流动相溶剂效率的而密度的增加引起流动相溶剂效率的而密度的增加引起流动相溶剂效率的而密度的增加引起流动相溶剂效率的提高，同时可缩短淋提高，同时可缩短淋提高，同时可缩短淋提高，同时可缩短淋 洗时间。洗时间。洗时间。洗时间。例如，采用例如，采用CO2流体作流动相，当压流体作流动相，当压力由力由7.O106Pa增加到增加到90106Pa时，时，对于十六碳烷烃的淋洗时间可由对于十六碳烷烃的淋洗时间可由25min缩短到缩短到5min。在在SFC中，通过中，通过程序升压程序升压实现了流体的程序升密，达到改善分离实现了流体的程序升密，达到改善分离的目的的目的。4.固定相和流动相 用于用于SFC中的色谱柱可以是填充柱中的色谱柱可以是填充柱也可以是毛细管柱，目前，毛细管超临也可以是毛细管柱，目前，毛细管超临界流体色谱（界流体色谱（CSFC）由于具有特别高的）由于具有特别高的分离效率，倍受人们的青睐。分离效率，倍受人们的青睐。在在SFC中，最广泛使用的流动相要中，最广泛使用的流动相要算是算是 CO2流体，它无色、无味、无毒、流体，它无色、无味、无毒、易获取并且价廉，对各类有机分子都是易获取并且价廉，对各类有机分子都是一种极好的溶剂。它在紫外区是透明的；一种极好的溶剂。它在紫外区是透明的；临界温度临界温度31，临界压力，临界压力7.29106Pa；在色谱分离中，在色谱分离中，CO2流体允许对温度、流体允许对温度、压力有宽的选择范围。压力有宽的选择范围。有时可在流体中引入有时可在流体中引入1%10%甲醇，甲醇，以改进分离的选择因子以改进分离的选择因子值。除值。除CO2流流体外，可作流动相的还有乙烷、戊烷、体外，可作流动相的还有乙烷、戊烷、氨、氧化亚氮、二氯二氟甲烷、二乙基氨、氧化亚氮、二氯二氟甲烷、二乙基醚和四氢呋喃等。醚和四氢呋喃等。5.检测器 在在高高效效液液相相色色谱谱仪仪中中经经常常采采用用的的检检测测器器，如如紫紫外外、荧荧光光、火火焰焰光光度度等等都都能能在在 SFC仪仪 中中 很很 好好 应应 用用。但但 SFC比比 起起HPLC还还具具有有一一个个主主要要优优点点是是可可采采用用GC中中火火焰焰离离子子化化检检测测器器（FID）。我我们们知知道道，FID对对一一般般有有机机物物分分析析具具有有较较高高的的灵灵敏敏度度，这这也也就就提提高高了了SFC对对有有机机物测定的灵敏物测定的灵敏.6超临界流体色谱法与其他色谱法比较 （l l）与高效液相色谱法比较）与高效液相色谱法比较 实验实验 证明证明SFCSFC法的柱效一般比法的柱效一般比HPLCHPLC法要高：法要高：当平均线速度为当平均线速度为0.6cm0.6cmS S-1-1时，时，SFC SFC 法法 的柱效可为的柱效可为 HPLC HPLC 法的法的3 3倍左右，在最倍左右，在最 小板高下载气线速度是小板高下载气线速度是4 4倍左右倍左右；因此；因此 SFC SFC 法的分离时间也比法的分离时间也比 HPLC HPLC 法短。法短。这是由于流体的低粘度使其流动速度这是由于流体的低粘度使其流动速度 比比 HPLC HPLC 法快，有利于缩短分离时间。法快，有利于缩短分离时间。（2 2）与气相色谱法比较）与气相色谱法比较 出于流体出于流体的扩散系数与粘度介于气体和液体之的扩散系数与粘度介于气体和液体之间，间，因此因此SFCSFC的谱带展宽比的谱带展宽比GCGC要小；要小；另外，另外，SFCSFC中流动相的作用类似中流动相的作用类似LCLC中中流动相，流体作流动相不仅载带溶质流动相，流体作流动相不仅载带溶质移动，而且与溶质会产生相互作用力，移动，而且与溶质会产生相互作用力，参与选择竞争。参与选择竞争。还有，如果我们把溶质分子溶还有，如果我们把溶质分子溶解在超临界流体看作类似于挥发，解在超临界流体看作类似于挥发，这样，大分子物质的分压很大，这样，大分子物质的分压很大，因此可因此可应用比应用比GCGC低得多的温度，低得多的温度，实现对大分子物质、热不稳定性实现对大分子物质、热不稳定性化合物、高聚物等的有效分离。化合物、高聚物等的有效分离。（3）应用范围的比较）应用范围的比较 图图20-s7描绘描绘了了SFC与其他色谱方法测定相对分子与其他色谱方法测定相对分子质量范围的比较。由图质量范围的比较。由图20-s7看出看出SFC比起比起GC法测定相对分子质量的范围法测定相对分子质量的范围要大出好几个数量级，基本与要大出好几个数量级，基本与LC法法相当。相当。当然，尺寸排阻色谱法（当然，尺寸排阻色谱法（SEC）所测分子质量范围是所有色谱法中最所测分子质量范围是所有色谱法中最大的。超临界流体色谱法被广泛应用大的。超临界流体色谱法被广泛应用于天然物、药物、表面活性剂、高聚于天然物、药物、表面活性剂、高聚物、多聚物、农药、炸药和火箭推进物、多聚物、农药、炸药和火箭推进剂等物质的分离和分析。剂等物质的分离和分析。4-6 毛细管电泳 capillary electrophoresiscapillary electrophoresis4-1概述概述 早早在在一一百百多多年年以以前前，较较原原始始的的电电泳泳实实验验，是是在在一一个个U U形形一一管管中中进进行行的的，管管中中盛盛有有溶溶液液，两两端端置置有有电电极极，加加上上几几百百伏伏电电压压后后，首首次次实实验验了了对对毒毒素素和和抗抗毒毒素素的的分分离离。19091909年年，L.MichaelisL.Michaelis提提出出“电电泳泳”这这一一术术语语，他他的的实实验验是是用于测定蛋白质的等电点。用于测定蛋白质的等电点。此后，许多的研究报告涉及氨基此后，许多的研究报告涉及氨基酸、肽类、蛋白质的分离。为了防止电酸、肽类、蛋白质的分离。为了防止电泳完成了的溶液中，再次发生对流混合，泳完成了的溶液中，再次发生对流混合，曾使用了各种稳定介质，如琼脂、纤维曾使用了各种稳定介质，如琼脂、纤维粉、玻璃丝、硅胶及丙烯酸胺；粉、玻璃丝、硅胶及丙烯酸胺；为了防止热扩散而使用了一种内径为了防止热扩散而使用了一种内径小小的的管管道道，管管道道内内径径由由3mm3mm缩缩小小至至75m75m。19811981年，年，Jorgenson.Jorgenson.和和 Lukacs Lukacs 使用使用75m75m内径的熔融石英毛细管，电泳分内径的熔融石英毛细管，电泳分离氨基酸和肽。至此，出现了毛细管电离氨基酸和肽。至此，出现了毛细管电泳（泳（capillary electrophoresiscapillary electrophoresis，CECE）技术。技术。毛细管电泳毛细管电泳，又称高效毛细管电泳，又称高效毛细管电泳（High Performance capillary electrophoresis，HPCE），它不同于），它不同于经典的区带电泳，有如下特点经典的区带电泳，有如下特点：（1）它是在内径（）它是在内径（1O200）m的石的石英毛细管中进行的，在毛细管中的散热英毛细管中进行的，在毛细管中的散热较好，沿着管截面的温度梯度很小，因较好，沿着管截面的温度梯度很小，因此，可以提高加在毛细管两端的电压，此，可以提高加在毛细管两端的电压，所加电压可高达几十千伏。所加电压可高达几十千伏。（2）它不需要阻流介质，但可使用）它不需要阻流介质，但可使用凝胶作分子筛介质。凝胶作分子筛介质。（3）可使用在柱检测法，缩短分析时间，）可使用在柱检测法，缩短分析时间，结合计算机处理数据，可实现自动化操结合计算机处理数据，可实现自动化操作。作。（4）灵敏度高，检测眼可达（）灵敏度高，检测眼可达（10-1310-15）mol，使用激光诱导的荧光检测，使用激光诱导的荧光检测限可达（限可达（10-1910-21）mol。（5）分辨率高，理论塔板数为几十万）分辨率高，理论塔板数为几十万至几百万米。至几百万米。（6）取样量少，有时只需几个纳升）取样量少，有时只需几个纳升（nL，10-9L），流动相只需几毫升。），流动相只需几毫升。4-1 高效毛细管由泳的基本原理 1.溶质在毛细管区带电泳过程中的传递溶质在毛细管区带电泳过程中的传递 含离子的溶液，在电场中所发生的物含离子的溶液，在电场中所发生的物理过程服从欧姆定律，理过程服从欧姆定律，当有直流电通过溶当有直流电通过溶液时，阴离子向阳极迁极，阳离子向阴极液时，阴离子向阳极迁极，阳离子向阴极迁移，溶液的导电率取决于离于浓度和其迁移，溶液的导电率取决于离于浓度和其迁移率迁移率(又称淌度，即指溶质在单位时间又称淌度，即指溶质在单位时间和单位电场强度下移动的距离和单位电场强度下移动的距离)。离子迁。离子迁移率以移率以表示，其大小受溶质的电荷离表示，其大小受溶质的电荷离子大小比例所控制。子大小比例所控制。在电场的影响下，带电荷的质在电场的影响下，带电荷的质点受到的力点受到的力Fe，等于其净电荷，等于其净电荷q与与电场强度电场强度E的乘积，即的乘积，即Fe=qE。电场强度电场强度E以每单位长度所加的电以每单位长度所加的电压压U来表示，即来表示，即E=U/L，其中，其中L是毛是毛细管长度。细管长度。Fe对正电荷为正值，对对正电荷为正值，对负电行为负值。负电行为负值。电场力促使带电质点向两极移动，电场力促使带电质点向两极移动，质点在移动过程中，也受到一种与电质点在移动过程中，也受到一种与电场力方向相反的场力方向相反的阻滞力阻滞力Fd，阻止其，阻止其移动，此阻滞力与质点的电泳速度移动，此阻滞力与质点的电泳速度成正比，由下式结出成正比，由下式结出 Fd=f 式中，式中，f是质点平移动所受的是质点平移动所受的摩擦摩擦阻力，阻力，对小的球状物质点，可用斯托克对小的球状物质点，可用斯托克斯（斯（Stokes）定律表示，即：）定律表示，即：f=6r 式中，式中，是溶液的粘度，是溶液的粘度，r是离子半是离子半径。即摩擦阻力正比于溶液的粘度、质径。即摩擦阻力正比于溶液的粘度、质点大小和其电泳速度。由于存在摩擦阻点大小和其电泳速度。由于存在摩擦阻力，一种带电质点在电场中运动，被加力，一种带电质点在电场中运动，被加速速到到一一有有限限速速度度，此此速速度度取取决决于于Fe和和Fd，这一有限速度称为这一有限速度称为电泳速度，电泳速度，ep。当。当促进力与阻滞力达到平衡时，则促进力与阻滞力达到平衡时，则 ep qEf 将上述表达式合并，作为将上述表达式合并，作为电泳迁电泳迁移率移率（或电泳淌度）（或电泳淌度）ep。表示式，。表示式，则则 epepEq士士6r 电泳迁移率定义为：一种质点在电泳迁移率定义为：一种质点在每单位电场强度下的稳态速度。每单位电场强度下的稳态速度。ep 值的大小，取决于分子的净电值的大小，取决于分子的净电荷数及其摩擦性质，（分子大小和形状）荷数及其摩擦性质，（分子大小和形状）以及所用介质的以及所用介质的介电常数介电常数和粘度和粘度。因而，对于每一种质点，在电场作用下因而，对于每一种质点，在电场作用下的迁移均具有特定的速度。的迁移均具有特定的速度。对于大分子或胶体，其关系可表示为对于大分子或胶体，其关系可表示为 式中，式中，是带电质点的是带电质点的Zeta电位；电位；为溶液的介电常数；为溶液的介电常数；K是德拜一修格是德拜一修格尔常数；尔常数；为离子半径；参数为离子半径；参数fK是一个常数；其值在是一个常数；其值在115之间，取之间，取决于迁移质点的形状。决于迁移质点的形状。HPCE分离，几乎都是在熔融石分离，几乎都是在熔融石英毛细管中完成的，熔融石英是一种英毛细管中完成的，熔融石英是一种高度交联的高度交联的SiO2聚合物，具有很好的聚合物，具有很好的抗拉强度。石英毛细管表面含有许多抗拉强度。石英毛细管表面含有许多硅酸基：）硅酸基：）SiOH，在一定的条件下，在一定的条件下可离解。使表面带有负电荷。可离解。使表面带有负电荷。由于表面带负电，因此，带负电荷由于表面带负电，因此，带负电荷的离子被表面排斥，而带正电均离子则的离子被表面排斥，而带正电均离子则被毛细管壁吸引，如图被毛细管壁吸引，如图41所示所示 在毛细管壁的阴离子，与来自主体溶在毛细管壁的阴离子，与来自主体溶液中的阳离子在石英一溶液界面上形成液中的阳离子在石英一溶液界面上形成双电层。由于静电场的作用，靠近表面双电层。由于静电场的作用，靠近表面的那些抗衡离子是不迁移的，因此构成的那些抗衡离子是不迁移的，因此构成所谓稠密层。所谓稠密层。由于热运动关系，离表面远的由于热运动关系，离表面远的离子构成可迁移层或扩散层，因为在离子构成可迁移层或扩散层，因为在双电层内离子的立体分布，就形成一双电层内离子的立体分布，就形成一种电势梯度种电势梯度.当在毛细管两端加有电场时；扩散当在毛细管两端加有电场时；扩散层内可迁移的阳离子向阴极移动。由于层内可迁移的阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的，因此，在缓冲液中的离子是被水化的，因此，在缓冲液中的液体也随迁移着的阳离子一道，向阴极液体也随迁移着的阳离子一道，向阴极移动，形成一种液流，称之为移动，形成一种液流，称之为电渗流电渗流（electroosmotic flow，EOF），它是一，它是一种电泳驱动力。种电泳驱动力。在双电层内，在双电层内，EOF总是向双电层内抗总是向双电层内抗衡离子方向迁移，穿过双电层的电势下衡离子方向迁移，穿过双电层的电势下降的程度受电渗流速度所控制。电渗流降的程度受电渗流速度所控制。电渗流的线速度的线速度eo，可以定义为：，可以定义为：式中，式中，eo是电渗迁移率，即在单是电渗迁移率，即在单位电场强度下，电渗流的线速度。位电场强度下，电渗流的线速度。Zeta电势可表示为：电势可表示为：=4/式中，式中，是毛细管表面电荷密度；是毛细管表面电荷密度；为为双电层厚度。按近代电解质理论，双电层厚度。按近代电解质理论，等等于于1K，因此式可写为：，因此式可写为：式中，式中，K为德拜一修格尔参数为德拜一修格尔参数 4-2 在CZE分离中的迁移时间、效率及分辨率 在在电电渗渗流流存存在在下下，离离子子的的迁迁移移速速度度可可表示为：表示为：=（eo）U/Lt 式式中中，Ld是是毛毛细细管管总总长长度度；U是是外外加加电电压。离子的迁移时间为压。离子的迁移时间为t，则，则 t=LtLd/（eo）U 式式中中，Lt为为进进样样端端到到检检测测器器之之间间的的毛毛细细管管长长度度，或或称称为为迁迁移移长长度度。分分离离效效率率n可表示为可表示为 式式中中，D为为溶溶质质的的平平均均扩扩散散系系数数。由由上上式式可可见见，如如 果果热热影影响响阿阿忽忽略略不不计计的话，增大电压，可增加分离效的话，增大电压，可增加分离效 率。率。按按Gidding方程方程5，分辨率，分辨率R只可定义为只可定义为式中，式中，是两溶质的区带间的相对是两溶质的区带间的相对速度差。对上面的公式处理，可得速度差。对上面的公式处理，可得 1和和2两两溶溶质质的的电电泳泳迁迁移移率率，而而是是它它们的平均电泳迁移率们的平均电泳迁移率。在在许许多多情情况况下下，电电渗渗流流速速度度比比许许多多质质点点的的电电泳泳速速度度要要快快，因因此此，在在毛毛细细管管中中的的所所有有溶溶质质将将朝朝一一个个方方向向迁迁移移，不不管管它它们们带带多多少少正正电电荷荷，都都将将先先被被检检出出，继继之之中中性性质质点点被被检检出出，最最后后带带负负电电荷荷的的质质点被检出。点被检出。如图如图42所示。所示。4-3 HPCE仪器的基本结构 HPCE仪器的基本结构如图仪器的基本结构如图43所所示。充满缓冲液的毛细管，两端分别浸入示。充满缓冲液的毛细管，两端分别浸入盛有缓冲液的储瓶中，之后通以盛有缓冲液的储瓶中，之后通以3OkV的的电压，整个带电管路置于一个安全保护盒电压，整个带电管路置于一个安全保护盒内以防高压危险，打开有机玻璃盒时即自内以防高压危险，打开有机玻璃盒时即自动切断电源。动切断电源。待测组分从毛细管的一端引人，在待测组分从毛细管的一端引人，在电场作用下，由于离子迁移速度有差别，电场作用下，由于离子迁移速度有差别，而在整个毛细管内形成不同的样品区带，而在整个毛细管内形成不同的样品区带，在毛细管的另一端放置检测器，以便连在毛细管的另一端放置检测器，以便连续地检测流过的每一个组分带，分析信续地检测流过的每一个组分带，分析信号通过检狈号通过检狈u器接收后。经放大再输入计器接收后。经放大再输入计算机系统进行数据处理与储存。算机系统进行数据处理与储存。