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Hedgehog 信号通路与肿瘤干细胞【摘要】 Hedgehog(Hh)信号传导通路因为在胚胎中引导胚胎图案形成中扮演中心角色而为人们熟知，但是近来的研究发现成熟器官形成和形态维持也需要通过Hh和Wnt通路。尤其是干细胞的自我更新和维持依赖于 Hh 通路活性。随着对Hh信号通路和肿瘤干细胞的深入研究，近年来已发现某些肿瘤与某种基因突变的高频率有关，而这种突变恰恰激活了Hh信号途径中的转译反应，导致肿瘤干细胞的无限增殖。本文聚焦于Hh信号传导通路，并就该通路激活与肿瘤干细胞异常分化，导致肿瘤发生发展做一系统综述。【关键词】 hedgehog;the tumor stem cell;patched;Smoothened;gli Hedgehog信号传导通路和肿瘤干细胞从来就不是陌生的观念，1980年发现果蝇的Hedgehog(Hh)的基因以来，已知该基因编码一种高度保存的分泌型糖蛋白，对于调节果蝇胚胎发育中细胞定向分化有重要作用。癌症干细胞的概念几乎可以追溯到在造血系统内体细胞干细胞的发现，并且在实验上稳定地建立了急性骨髓源性白血病 (AML)细胞株的时候。近十年来，遗传学和肿瘤学汇合聚焦于证明细胞外信号传导畸变调节导致肿瘤形成的假说，而同时，肿瘤生物学家认为肿瘤的出现和生长是由于少数的癌症干细胞形成的结果，癌症干细胞培养成功证实了癌症干细胞是癌症起源的细胞24。最近的研究结果表明，Hh信号传导通路的过度活化至少是癌症干细胞形成与无限增殖的元凶之一。 1 Hedgehog信号通路Hedgehog基因是一种分节极性基因，因突变的果蝇胚胎呈多毛团状，酷似受惊刺猬而得名。哺乳动物中存在三个Hedgehog的同源基因：Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(IHH)和Desert Hedgehog(DHH)，分别编码Shh、Ihh和Dhh蛋白。Hh蛋白家族成员均由两个结构域组成：氨基端结构域(Hh-N)及羧基端结构域(Hh-C)，其中Hh-N有Hh蛋白的信号活性，而Hh-C则具有自身蛋白水解酶活性及胆固醇转移酶功能。Hh前体蛋白在内质网中通过自身催化分裂成Hh-N及Hh-C两部分，其中Hh-C共价结合胆固醇分子、并将其转移到Hh-N的羧基端，随后在酰基转移酶的作用下Hh-N氨基端的半胱氨酸发生棕榈酰化。Hh蛋白只有通过这些翻译后的修饰过程才能获得完全功能57。Hh信号传递受靶细胞膜上两种受体Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)的控制8，9。受体Ptc由肿瘤抑制基因Patched编码，是由12个跨膜区的单一肽链构成，能与配体直接结合，对Hh信号起负调控作用。受体Smo由原癌基因Smothened编码，与G蛋白偶联受体同源，由7个跨膜区的单一肽链构成，N端位于细胞外，C端位于细胞内，跨膜区氨基酸序列高度保守，C 末端的丝氨酸与苏氨酸残基为磷酸化部位，蛋白激酶催化时结合磷酸基团。该蛋白家族成员只有当维持全长时才有转录启动子的功能，启动下游靶基因的转录；当羧基端被蛋白酶体水解后，就形成转录抑制子，抑制下游靶基因的转录10。Smo是Hh信号传递所必须的受体。在无Hh、Ptc的情况下，激活Smo可导致Hh 靶基因的活化；基因Smo突变时，可出现与Hh 基因突变相同的表征。目前发现的参与Hh信号转导的核内因子包括转录因子CiGli、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶Fused(Fu)、Fu抑制剂(SuFu)、类运动蛋白Costal-2(Cos2)、蛋白激酶A(PKA)等。其中CiGli、Fu起正调控作用，Cos 2、PKA起负调控作用11，12。Gli蛋白家族成员是较大的多功能的转录因子，属于C2 H2型锌指结构蛋白。在正常情况下，Ptc抑制Smo蛋白活性，从而抑制下游通路，这时下游的Gli蛋白在蛋白酶体 (Proteasome)内被截断，并以羧基端被截断的形式进入细胞核内，抑制下游靶基因的转录。当Ptc和Hh结合以后，解除对Smo的抑制作用，促使Gli蛋白与PKA及一些未知因子与微管形成大分子复合物，使得全长Gli蛋白进入核内激活下游靶基因转录。Hh-Gli通路可以诱导Ptc的转录，形成负反馈的调控环。当Ptc发生突变或缺失时、或是Smo突变导致对Ptc的抑制作用不敏感致使基因活化，致使Hh信号通路失控，使Gli持续激活、启动靶基因转录13，见图1。如图1所示在正常时，Ptch蛋白抑制跨膜蛋白Smo的活性。Hh结合Ptch后释放Smo来阻断Ptch蛋白的功能，并通过潜伏的Gli 家属转译因子激活转译靶分子(图1a)。 Gli蛋白可以通过与Su(fu)蛋白的抑制物的结合来调节。2 肿瘤干细胞1994年Lapidot等首次通过特异细胞表面标志分离出了人急性粒细胞白血病干细胞(1eukemic stem cells，LSC)，发现只有LSC才具有不断自我更新维持其恶性显型的作用，证明了肿瘤干细胞的客观存在。的确，无数的研究业已证明肿瘤干细胞(cancer stem cells)是肿瘤中有一小部分具有干细胞性质的细胞群体。它是肿瘤形成的来源，具有自我更新的能力，是形成不同分化程度的肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的源泉。这个设想很好地解释了肿瘤的异质性，即肿瘤干细胞在不同选择压力下，向不同功能方向分化、成熟，造成肿瘤细胞的群体漂移，从而形成异质性。最近乳腺癌和脑瘤中相继分离纯化出了具有特异表面标志的肿瘤干细胞，开创了实体肿瘤干细胞研究的新局面，并提出实体肿瘤也是一种干细胞疾病的理念1416。乳腺癌实体瘤干细胞分离成功的报道，最早见于乳腺癌的研究。 Hajj等17将病理组织标本制成单细胞悬液，筛选出表达CD44、ESA、的肿瘤细胞，并注入到NODSCID小鼠的乳腺中。且观察到，只有一小部分癌细胞可在小鼠体内形成肿瘤。研究表明：这些细胞表面标志物呈CD44+CD24-/low，具有自我更新、能够分化成其他类型细胞的特征。小鼠乳腺的新生肿瘤中亦有同样的细胞，可以被分离出来，并在别的小鼠体内形成新的肿瘤。接种仅100个CD133阳性的脑瘤细胞至NOD-SCID小鼠耳后部位即会分化形成脑瘤，而CD133阴性细胞则不具备此能力，说明前者控制脑瘤的生长。干细胞在移植入鼠前并不表达成熟细胞的标记物，而在移植后则异常分化，并产生一些人类原发肿瘤中可见的标记物，如神经胶质纤维酸性蛋白和微管联合蛋白等。异种移植细胞中仍可检测到脑瘤中存在的异常染色体组型。CD133阳性细胞具有干细胞的基本特性复制，因此在多次异体移植后仍能表达原始细胞的特征18。关于在肿瘤中发现干细胞的报道不断呈现，人们设想如果肿瘤的生长和转移是源自少量的肿瘤干细胞，这可以解释惯用的根除实体瘤治疗的失败原因。为什么癌症在化疗、放疗后常常复发？这可能是因为肿瘤干细胞在其中发挥作用。肿瘤干细胞只占肿瘤细胞的万分之一，在放、化疗时，的肿瘤细胞被杀死，但由于干细胞是静止细胞，还有干细胞没被杀死，肿瘤细胞就会因此自我复制。部分医学研究人员认为这可能就是肿瘤复发的原因19。有人预测，这对肿瘤干细胞的研究也可能会带来一场革命。当然，肿瘤干细胞研究还有很多问题没有解决，目前只在部分肿瘤中找到干细胞，是不是其他肿瘤也有干细胞？这里面既有机遇也有风险。肿瘤干细胞是一个研究方向，虽然还有很多不明确的地方，但是一定要及早进行研究。3 Hh信号通路与肿瘤干细胞Hh通路活性和癌症之间的关系最初是在发现变异的PTCH之后得到认识的。 那么Hh信号通路与肿瘤究竟有哪些内在的联系呢？为什么Hh信号通路的激活高概率地导致肿瘤呢？最近的基因学证实：体干细胞是肿瘤开始形成的场所；Hh信号通路至少在部分组织中调节干细胞的更新与数量；体干细胞的扩张是至少一部分肿瘤形成的第一步。近年来临床研究已证明皮肤、血液、内脏、前列腺、肌肉和神经系统等器官的干细胞涉及Hh 或Wnt通路。肿瘤细胞的发生发展也取决于肿瘤内Hh或者Wnt的信号传导。这些信号传导在肿瘤细胞中的作用与在正常的干细胞更新时干细胞更新基因，例如nestin 和Bmi-1的作用一致。大约1/3总的癌症死亡病例是由于Hh或者Wnt通路活化的癌症引起的23。应用Hh通路特异性抑制剂环巴明还发现内胚层起源的器官的肿瘤生长需要Hh通路的活性。这些癌症包括食管、胃、胰、胆道和前列腺癌和小细胞肺癌。David M Berman 等1甚至认为在所有的消化道肿瘤中，不同于偶发的Shh通路成分基因的变异所致的Shh通路异常活化产生的基底细胞痣综合征(Gorlins综合征，BCC)，Hh信号系统的激活是广泛需要的。点突变导致Hh信号通路持续激活，作用于干细胞，致使细胞持续分化、更新。机体内细胞分化通过周期性更新而不断被替代，这意味着突变更容易在干细胞中得以积累，而单一细胞获得47次突变将发生恶性转化。组织更新快的上皮组织、造血系统是肿瘤高发部位，组织自我更新越快，复制、转录过程中基因发生突变的概率越高。已有相当多的证据表明某些结肠癌和白血病产生于积累多次突变的干细胞20。组织炎症和修复与癌症的发生发展有着千丝万缕的联系21。越来越多的证据表明，慢性炎症可以致癌。 癌症的发生发展已被认为在慢性炎症后组织修复的过程中持续的干细胞Hh/Wnt通路活化并导致干细胞持续性分化的一个无条理的状态(图2) 。Shh通路在受损气道的修复重建与小细胞肺癌的发生有相似的作用模式，说明肿瘤细胞与其前体细胞之间的分子联系。干细胞的增殖具有相对稳定性，其数目保持相对恒定，而肿瘤细胞群体不但可以无限增殖，而且失去了自稳定性的特点。其机制可能是由于基因突变或基因表达异常或干细胞所处的微环境异常导致干细胞增殖分化机制失调造成的。组织微结构的异常和/或致癌物的存在干扰组织内细胞与其微环境的正常交流，是肿瘤产生的前提之一。这有点类似于索南夏因所提出的癌症发生的“组织结构场理论”22。它对致癌作用的解释首先强调组织微结构和细胞微环境的改变，细胞外间质成分是各种致癌因素首先作用的靶点，这一改变所引发的细胞与细胞、细胞与间质信号交流的异常，便成了细胞失控性增殖的原因。4 结语大量的实验成果证明：一些参与干细胞自我更新的基因也参与了肿瘤的发生。Hh通路是目前研究较为深入且与细胞生长分化密切相关的信号传导通路，在胚胎发育中起重要作，与肿瘤发生、发展有密切关系，还与干细胞的增殖分化密切相关。另外，SHH与Wnt和Bmi-1的信号一起对于促进造血干细胞的自我更新功能和保持其多方向分化潜能具有重要作用，同时也参与肿瘤的发生 。癌症研究的观念必须更新，对癌症的认识必须从一个新的视角去把握。本文聚焦于Hedgehog信号转导和干细胞理论的结合，为癌症的产生提出了合乎逻辑的解释，我们的理想正如哈纳汉所说：癌生物学和癌症治疗的研究今天还是一个杂合了细胞生物学、遗传学、组织病理学、生物化学、免疫学和药物学的百衲衣。我们期望有一天，它将变成具有完整的观念结构和逻辑连贯的、可与当代化学和物理学相媲美的完美的科学。这一理论将对于开发新的肿瘤诊断和治疗方法带来非常重要而积极的意义。【参考文献】1 Berman D M，S S Karhadkar，etrequirement for Hedgehog ligand stimulation in growth of digestive tract ，2003，425(6960)：846-851.2 Houghton J，Stoicov C，Nomura S，etcancer originating from bone marrow-derived ，2004，306 (5701)：1568.3 Clarke ：at the root of brain ，2004，432 (7015)：281.4 Singh SK，Hawkins C，Clarke ID，etof human brain tumour initiating ，2004，432 (7015)：396.5 Nybakken K，Perrimonsignal transduction：recentGenet Dev，2002，15(5)：503-511.6 Jeong J，McMahonmodification of Hedgehog familyClin Invest，2002，110(5)：591-596.7 Cohen MMhedgehog signalingJ Med Genet，2003，123A(1)：5-28.8 Yamaguchi 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