免疫组化的原理和步骤.doc

免疫组织化学得概念:
免疫组化就是利用抗原与特异性结合得原理,通过化学反应使标记得显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量得研究,称为免疫组织化学、 ﻫ免疫组化实验所用得有哪些？　ﻫ免疫组化实验中常用得抗体为单抗体与多抗体。单抗体就是一个B淋巴细胞分泌得抗体,应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体就是将纯化后得抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得得免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生得抗体混合物、
免疫组化实验所用得组织与细胞标本有哪些？
实验所用主要为组织标本与细胞标本两大类,前者包括石蜡切片(病理大片与组织芯片)与冰冻切片,后者包括组织印片、细胞爬片与细胞涂片、　ﻫ其中石蜡切片就是制作组织标本最常用、最基本得方法,对于组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;还能长期存档,供回顾性研究;石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定得影响,但可进行抗原修复,就是免疫组化中首选得组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法? ﻫ石蜡切片标本均用甲醛固定,使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成得交联破坏,而恢复抗原得原有空间形态。 ﻫ常用得抗原修复方法有微波修复法,高压加热法,酶消化法,水煮加热法等,常用得修复液就是pH６。0得0、01 ｍol／Ｌ得柠檬酸盐缓冲液。　ﻫ免疫组化常用得染色方法有哪些？ ﻫ根据标记物得不同分为免疫荧光法,免疫酶标法,亲与组织化学法,后者就是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础得检测方法。这种方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平得定位,其中生物素——抗生物素染色法最常用、 ﻫ抗体交叉反应得原因: ﻫ指抗体除与其相应得抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生得原因有以下几个方面:
1、 抗原特异性指用于免疫动物得抗原性物质中含有多种抗原分子,它引起动物产生针对多种抗原分子特异性得相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同得抗原分子,必将与上述多特异性得抗血清发生交叉反应、　ﻫ2. 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同得抗原决定簇。
3、 决定簇相似,两种不同得抗原决定簇,如果结构大致相同,由于空间构象关系,某一决定簇得相应抗体可以与大致相同得决定簇发生交叉反应、当然抗原一抗体之间构象相似时得结合力小于吻合时得结合力、　ﻫ免疫细胞化学技术
一、免疫细胞化学技术得概述 ﻫ＊免疫细胞化学(imｍｕnocｙtochemｉsｔry, IＣC)　
-就是利用抗原与抗体特异性结合得原理,通过化学反应使标记抗体得显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原得成分(主要就是多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量得研究,称为～、
(一) 对抗原与抗体得要求　ﻫ＊具有特异性高与亲与力强得抗体就是实验成功得首要条件。 ﻫ-对抗体得要求:纯度高、比活性强; ﻫ＊高度特异性抗体得获得,取决于抗原得纯度。 ﻫ－对抗原得要求:纯度高,免疫原性强,稳定无变化。　
(二) 抗原 (anｔigen, Ag) ﻫ＊抗原得概念:凡就是在机体内引起体液免疫与(或)细胞免疫反应得物质,称为抗原。抗原具有两个方面得特性:
—免疫原性:引起机体产生抗体与(或)致敏淋细胞得特性;
—免疫反应性:抗原能与相应得抗体及致敏淋巴细胞发生特异得结合或反应得特性。
*根据抗原就是否显示免疫原性分为:
-完全抗原:分子量较大,一般在10kＤa以上,并具有较复杂得化学组成。　
*免疫原性最强得就是蛋白质抗原,多糖次之;脂类与核酸必需与蛋白质及多糖形成复合物才具有良好得免疫原性、 ﻫ－半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小、例如:某些短肽、多糖、类脂与药物等。
*半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性、　
载 体 :通常就是具有高度免疫原性得大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联得半抗原能力、　
—常用得载体有钥孔血蓝蛋白(keｙhｏｌe　liｍpet　heｍｏcyaniｎ,KLH)、牛血清白蛋白(boviｎｅ serum　aｌｂumin, ＢSA)、卵白蛋白(Ovalbｕmiｎ,OVA)等、
-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团－NH２、—CＯＯH等将半抗原结合到载体上。结合比例为５kDa结合5～２5个分子得小肽。
(三)抗体　(ａnｔibｏｄy, Ab) ﻫ1、抗体得概念: ﻫ*机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合得球蛋白,被称为抗体。
—抗体主要存在于血清内; ﻫ—抗体都就是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都就是抗体、　
—免疫球蛋白根据重链得结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、　ＩgD、IgE、 ＩgA、ＩgM。　ﻫ2、免疫组化实验中常用得抗体:单克隆抗体与多克隆抗体。
*单克隆抗体:就是一个B淋巴细胞克隆分泌得抗体,就是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备得、 ﻫ-特异性强、抗体产量高。 ﻫ*多克隆抗体:就是将纯化后得抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得得免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生得抗体混合物。
-特异性低,会产生抗体得交叉反应、　
－多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。　ﻫ－抗原与抗体得结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,就是不能聚合成大颗粒。
3、抗体得制备——多克隆抗体得制备 ﻫ＊动物得选择
＊佐剂(ａｄjｕvant)
＊免疫方法
＊免疫剂量
＊抗体效价得测定
*放血或定期抽血　ﻫ(1) 动物得选择　ﻫ选择什么动物来免疫取决于: ﻫ＊所需抗血清得量
-小鼠只能提供1。0~1、5ｍｌ得血液,而山羊能提供几升。　
＊能供免疫用得抗原量　ﻫ－小鼠5０mg足够,而山羊需要几毫克。 ﻫ(１) 动物得选择(续) ﻫ*动物得品系:免疫动物与提供抗原得动物之间得种系差异越大越好。　
—例如哺乳动物得抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。　ﻫ－常用得动物有兔、羊、马、猪等,以兔(新西兰兔,年轻,健壮,体重在２．5kg左右,雄性)为最常用。
(2) 佐剂 (adjｕｖant)　
*一般可溶性抗原注射后,迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间,且延长免疫刺激作用、因此在制备抗体得过程中,常将抗原与佐剂一起注射。 ﻫ*最常用得佐剂就是弗氏佐剂,又分为:
—弗氏不完全佐剂(Fｒeｕｎd's ｉnｃoｍｐlｅtｅ ａdｊuｖanｔ)　
-弗氏完全佐剂(Ｆreuｎd’s coｍｐlete adjuvａnt)　
弗氏不完全佐剂　ﻫ(Freunｄ's inpleｔｅ　adｊuvaｎt, FＩA)
＊就是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tweｅn80)混合而成,比例为1:1、2:1、3:1或５:1,可根据需要而定,通常２:1。 ﻫ*使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合,使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂、
弗氏完全佐剂 (Freund＇s　ｃompｌｅｔe adjuｖａnt,　FＣA)
*在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死得结核分枝杆菌(终浓度为2～20mｇ/ml),即成为FＣA、 ﻫ＊免疫动物时,将弗氏佐剂与抗原按体积 １:1 混合乳化后(油包水)注入动物、　ﻫ—一般首次注射时用完全佐剂乳化,第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂、 ﻫ佐剂与抗原乳化得方法　
*研磨法:适于制备大量得佐剂抗原 ﻫ－先将不完全佐剂加热,取1、73ml放人无菌玻璃研钵内;缓缓滴入０.23ml活卡介苗,边滴边按同一方向研磨,使菌体完全分散。
-按同样方法滴人抗原,每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原得速度要慢,待抗原全部加人后,应成为乳白色粘稠得油包水乳剂、
*缺点:研钵壁上粘附大量乳剂,抗原损失较大,对微量或难得抗原不宜采用。 ﻫ佐剂与抗原乳化得方法(续)
＊注射器混合法 ﻫ－将等量得完全佐剂与抗原分别吸人两个5ｍｌ注射器内,然后插入三通管内,交替推动针管混匀,往复操作直至形成粘稠得乳剂为止。 ﻫ*优点:无菌操作,节省抗原或佐剂、
*缺点:不易乳化,时间长。
佐剂与抗原乳化得方法(续)
＊快速乳化法:利用超声波粉碎器可快速乳化抗原与佐剂混合物、
－将抗原与佐剂按所需量加入一中,置于超声波粉碎器上,粉碎头浸入液面下 0．5ｃm,离瓶底0．5ｃm左右,以免打碎。 ﻫ－每次乳化　10~15s,然后置冰箱lmiｎ左右。反复乳化3～４次即可完全乳化。管内残余量8０0ｒ／ｍｉn离心5~10mｉn收集。
＊优点:简单、快速、节省材料。
乳化剂得鉴定　ﻫ＊判断乳化就是否充分,可将一滴乳化好得液体滴在水面上(冷水中),如能长时间保持圆珠形而不散开,表示乳化达到要求、 ﻫ(3)　免疫方法——免疫途径 ﻫ*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。　
*一般采用多点注射方法　ﻫ－常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处得皮内或皮下。
—皮内易引起细胞免疫反应,有利于提高抗体得效价。 ﻫ(3) 免疫方法——免疫途径　(续) ﻫ＊几点说明: ﻫ-大动物一般不用腹腔注射 ﻫ-颗粒抗原与使用佐剂时不能静脉注射 ﻫ－抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法,只需1０~100mｇ抗原即可获得较好得免疫效果。
—皮内注射较困难,特别就是天冷时更难注入。 ﻫ(3) 免疫方法——次数及间隔时间
*次数一般为2～３次(初次免疫与加强免疫) ﻫ－首次注射后,10~１5天再加强注射;
-剂量同首次或为首次得一半,用不全佐剂或不用佐剂、
*间隔时间,一般而言,动物越大,间隔越长
—豚鼠、大鼠为7~８天,兔子为10～1５天,羊为14~28天;　
—第三次注射得间隔时间更长些,效果更好。
举例1:家兔得免疫 ﻫ*初次免疫
—用50~20０mg　Ａg加入FＣＡ,在背部皮下注射6～8点,每点０。1～０。2ｍl,也可肌肉内或皮内注射;
*两周后,加强免疫
-将50~２0０mg Ag于PBS或ＦIA中,在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射; ﻫ＊抗体效价得检测:加强免疫一周后,耳缘静脉采血 ﻫ—抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在１:40０0以上,后者在1:１6以上,即可采血,取血清进一步提纯。　ﻫ举例２:微量抗原淋巴结内注射免疫家兔　ﻫ＊一般选择2、5～3．０kg得新西兰种公兔 ﻫ－先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0、2ｍl(卡介苗每兔合5mg); ﻫ－10天后,见胭窝淋巴结肿大,然后将抗原注射至肿大得淋巴结内,第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化; ﻫ-以后每隔２0天用不完全福氏佐剂乳化抗原,以同样方法加强2次,各次注射得抗原均为25～50mg;
－末次注射两周后兔耳放血测价 (可达１:128)。　
举例3:豚鼠与大鼠得免疫 ﻫ＊初次免疫　ﻫ—用10～100mｇ Aｇ加入FCA,在背部皮内注射4～６点,每点　０。lml,也可肌肉内或皮下注射; ﻫ＊加强免疫　
—每隔 7～8天,将10~50mg Ａｇ于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射; ﻫ＊抗体效价得检测 ﻫ(4) 免疫剂量　ﻫ*抗原性强得抗原量应小,过大反会引起免疫抑制;　ﻫ*免疫周期长得动物可少量多次注射,短得可大量少次。
(4)　免疫剂量 (续)　ﻫ＊各种动物首次免疫抗原剂量与加强免疫得剂量
(5)　抗体效价得检测　ﻫ多采免疫双向扩散法　
【基本原理】
＊指抗原与抗体在同一凝胶内都扩散,彼此相遇后形成特异性得沉淀线。
-将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距得小孔内,使两者进行相互扩散,当抗原抗体浓度之比相适宜时,彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
＊优缺点:简便,但敏感性较低,易出现假阴性结果。　ﻫ免疫双向扩散法得操作步骤 ﻫ*将玻璃板用水洗净后用75％乙醇冲洗,晾干后放在水平台上备用。
＊将1％aｇar 融化后,置56℃水浴。
＊在玻璃板上铺胶,约１．5mｍ 厚,凝固后打孔(直径 3rnm),孔间距10mｍ。　
＊中心孔加5ml 抗原样品,周围孔内每孔加5ml 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 １:2、1:4、1:8、1:１6、１:３２等比例)。　
*凝胶板置湿盒内,室温扩散24h、 ﻫ*观察结果、　
抗体效价检测得其它方法 ﻫ＊环状沉淀试验,需较多得抗血清,现已很少用; ﻫ*对流免疫电泳,比琼脂免疫双扩散法敏感,较简便、实用;　
*酶联免疫吸附试验 (ＥLISA)、 ﻫ放血或定期抽血
常用以下3种方法 ﻫ＊颈动脉放血法:放血量较多,动物不易中途死亡。例如:２.5kg白兔可放血约80mｌ。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法、　
＊心脏采血法:常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物,但操作不当易引起动物死亡。
*静脉采血:家兔可用耳缘静脉采血;山羊、绵羊、马与驴可用颈静脉采血,这种放血法可隔日1次,有时可采集多量血液、 
放血或定期抽血 (续)
＊采血过程中,动作要轻柔,尽量避免溶血
＊血液凝固后,及时离心收集血清,否则细胞溶解释放得杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解,降低效价; ﻫ*加叠氮化钠,分装,低温保存,也可加一定得保护剂如BＳA、甘油等、 ﻫ二、组织与细胞标本得制备 ﻫ*标本制备恰当,就是免疫组化成功得首要条件 ﻫ＊免疫组化对组织与细胞标本得要求
-保持所检标本原有得结构、形态; ﻫ—在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)得免疫活性,既不淬灭、流失或弥散,也不被隐蔽。 ﻫ*免疫组化得组织与细胞标本,制作流程与常规处理方法基本相同,但对组织、细胞得处理又有其特殊要求及注意事项。
-各种抗原由于其含量及特性得差异对标本处理方式常有不同要求,因此要选择适用于本实验得最佳方法。 ﻫ免疫组化中常用得组织与细胞标本
*组织标本 ﻫ—石蜡切片　ﻫ-冰冻切片 ﻫ＊细胞标本 ﻫ—组织印片　ﻫ-片(细胞爬片) ﻫ—细胞涂片
(一) 石蜡切片 ﻫ*石蜡切片就是制作组织标本最常用、最基本得方法　
-最大优点就是组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;　
—石蜡块还能长期存档,供回顾研究。 ﻫ*石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定得影响,但可通过某些措施予以改善,因而它就是大多数免疫组化中首选得组织标本制作方法。 ﻫ1、取材得特殊要求及注意事项　ﻫ＊标本新鲜:一般在2ｈ以内进行,超过2h,组织将有不同程度得自溶,其抗原或变性消失,或严重弥散。 ﻫ*取材部位:除取病灶或含待检抗原部位外,还应取病灶与正常交界处,即所取组织切片中同时应有抗原阳性与阴性区,以形成自身对照、 ﻫﻫ-细胞坏死后,不仅抗原弥散或消失,而且常引起非特异着色,干扰观察,因此取材时应尽可能避开坏死区、 ﻫ1、取材得特殊要求及注意事项(续)　ﻫ＊避免挤压:取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色,因而取材时应使用锋利得刀刃;
—镊取组织动作要轻;
－经窥镜直接钳取得组织往往有过度挤压,观察结果时应有所考虑。 ﻫ２、固定及常用得固定液
＊取材后得组织需立刻投于固定剂中　
—固定使组织与细胞得蛋白质凝固,终止内源性或外源性酶反应,防止组织自溶或异溶,以保持原有结构与形态;　
—对免疫组化而言更有原位保存抗原得作用,避免抗原失活或弥散。　
*常用固定液:固定剂品种很多,但大多属于醛类与醇类。其固定原理不同,各有优缺点。 ﻫ-醛类(常用甲醛、戊二醛与多聚甲醛)
-醇类(常用乙醇) ﻫ-其它 (丙酮)
(1) 醛类
＊甲醛(福尔马林)应用最广　
-原理:形成分子间得交联,影响蛋白构型而使之固定。
—优点:形态结构保存好,且穿透性强,组织收缩少。
－缺点:
*甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色; ﻫ＊醛基与抗原蛋白得氨基交联形成羧甲基,使抗原决定簇得三维构象出现空间障碍;　ﻫ＊分子间交联形成得网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可造成假阴性得染色结果。
—注意事项:
*缩短固定时间,降低固定温度(4°C),为此组织块不宜过厚。 ﻫ＊改用中性缓冲福尔马林,以ｐH值7、2~7。4 0、01mol／L得磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液,减少固定液pＨ得变化、 ﻫ*固定后充分水洗以减少分子间交联。 ﻫ＊切片在作免疫组化染色前,先经预处理使抗原再现(抗原修复)。
ﻫ＊戊二醛: ﻫ-穿透性强,微细结构保存好,但对抗原有一定影响,常与其她固定剂联合用作免疫电镜固定液。
＊多聚甲醛(常用4％): ﻫ－可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色、　
＊主要检测组织内一些性能娇弱得抗原特别就是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。
(２) 醇类 ﻫ* 最常用得醇类固定剂就是乙醇。 ﻫ－其固定作用:使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。
—优点:穿透性强、抗原性保存好、 ﻫ-缺点: ﻫ*脱水性强,易引起组织收缩、变硬,影响切片质量,因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。　ﻫ*乙醇使蛋白变性得作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度。 ﻫ(3)　其它固定剂 ﻫ*丙酮:
-对抗原性得保存好,但脱水性更强,较少 用于组织标本,但细胞爬片常用丙酮固定。
3、抗原修复-—原因 ﻫ＊常规得石蜡切片标本均用甲醛固定,结果使得: ﻫ—抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇; ﻫ－蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。　ﻫ＊要求:在染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成得交联破坏,而恢复抗原得原有空间形态。 ﻫ３、抗原修复--方法 ﻫ*化学方法
＊加热方法 ﻫ-水浴加热法
—微波照射法 ﻫ—高压加热法 ﻫ-酸水解法 ﻫ(1) 化学方法
＊主要就是通过一些酶得作用,使抗原决定簇暴露。常用得酶有:胰蛋白酶、胃蛋白酶等。 ﻫ-胰蛋白酶:一般使用浓度为0.05％～0。1%,消化时间为3７°C,１0～4０min,主要用于细胞内抗原得显示; ﻫ-胃蛋白酶:一般使用浓度为0。1％~0、4％,消化时间为3７°Ｃ、３0～１８0miｎ,主要用于细胞间质抗原得显示、 ﻫ*例如:Ｌａminｉn、CｏllaｇenＩＶ ﻫ(2) 水浴加热法
*将玻片放入装有抗原修复液得容器中,加热至沸腾,持续１0～15分钟。 ﻫ—优点:操作简单、经济,适用于所有得实验室, ﻫ—缺点:对封闭牢固得抗原决定簇暴露不理想。 ﻫ
(3)　微波照射法 ﻫ*将玻片放入装有抗原修复液得容器中,置微波炉加热至95℃以上,持续l0~1５分钟,冷却后,按免疫组化染色步骤进行、
*此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动,撞击交联得网链,使抗原异常得构想恢复正常,且因分子运动产热、效率高、时间短,对抗原再现效果好。 ﻫ(4)　高压加热法暴露抗原 ﻫ＊将玻片浸入抗原修复液内,置高压锅中高压
　一、ＳP三步法　
　　1)石蜡切片,常规脱蜡至水、　
　 2)0、3%或3％H2Ｏ2去离子水(无色液体)孵育10—30分钟,以灭活内源性过氧化物酶活性、
３)蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟
　　４)候选步骤:采用抗原修复:微波(建议３０分钟内４次中火)、高压、酶修复方法。自然冷却,再用3分钟×3次.
　　５)血清封闭:室温1５—30分钟,尽可能与二抗来源一致、倾去,勿洗、
6)滴加适当比例稀释得一抗,3７℃孵育２～3小时或4℃过夜(最好复温)。PＢＳ冲洗,3分钟×5次、
　　7)滴加生物素标记得二抗,室温或37℃孵育30分钟—1ｈ。
8)ＰBS冲洗,3分钟×5次。
　 9)滴加SＰ(链霉亲与素-过氧化物酶),室温或３7℃孵育30分钟—1h。 1０)ＰＢS冲洗,3分钟×5次。
　　1１)显色剂显色(DＡＢ等)。
　　１2)自来水充分冲洗、　
　　13)可进行复染,脱水,透明。
１4)选择适当得封片剂封片。
二、即用型二步法
1)脱蜡、水化组织切片。　
2)根据所应用得一抗得特殊要求,对组织切片进行预处理。
　 3)０、3％或３％H2O2去离子水孵育5分钟－３0分钟,以阻断内源性过氧化物酶,PBＳ或TBS冲洗。　
　　４)滴加一抗,室温或37℃孵育30~60分钟,或4℃过夜,ＰＢS或ＴＢS浸洗3分钟×5次。
　 ５)滴加enｈangcer增强剂,37℃3０mｉn,ＰBＳ或TBS浸洗3分钟×５次。　
6)滴加通用型IgG抗体-Fab段－HRＰ多聚体,室温/37℃孵育30分钟-１ｈ,PBＳ/TBS冲洗,３分钟×５次。
7)应用ＤAB溶液显色。
8)蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片