桉叶提取物与常用抗氧化剂活性比较研究.pdf

食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用 247 2013年 第38卷 第08期收稿日期：2013-01-27 *通讯作者基金项目：林业重大公益性科研行业专项(201104003-03)；国家自然科学基金项目(31100433)。作者简介：汤杰(1987)，男，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养。汤 杰，赵力超，陈洪璋，陈运娇，王俊亮，肖苏尧，曹 庸*(华南农业大学食品学院，广州 510642)摘要：采用清除DPPH自由基法、清除ABTS自由基法、对Fe3+还原能力法(FRAP)、氧自由基吸收能力法(ORAC)以及抗脂质过氧化法，分别比较广林9号桉叶提取物(G9EX)与茶多酚、BHA、BHT、TBHQ、Vc、VE常用抗氧化剂抗氧化活性。结果表明，G9EX清除DPPH自由基能力强于相同浓度茶多酚、BHA、BHT、VE，弱于TBHQ、Vc；其清除ABTS自由基能力强于相同浓度茶多酚、BHA、BHT、Vc、VE，弱于TBHQ；其对Fe3+还原能力强于相同浓度茶多酚、BHA、BHT、VE，弱于TBHQ、Vc；G9EX有着良好的抗脂质过氧化能力，效果与BHA、BHT相当，但弱于茶多酚、TBHQ、VE；G9EX的ORAC值为5.46 mol TE/mg，高于茶多酚(4.8 mol TE/mg)，约为Vc(1.5 mol TE/mg)3.6倍、VE(1.4 mol TE/mg)的3.9倍。桉叶提取物作为一种天然抗氧化剂有着良好的应用前景。关键词：桉叶提取物；抗氧化活性；自由基；脂质过氧化；氧自由基吸收能力法中图分类号：R 284.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)08-0247-05Comparation of antioxidant activities for eucalyptus leaf extract with common antioxidantsTANG Jie,ZHAO Li-chao,CHEN Hong-zhang,CHEN Yun-jiao,WANG Jun-liang,XIAO Su-yao,CAO Yong*(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642)Abstract:In order to compare the antioxidant activities of Guanglin9 eucalyptus leaf extract(G9EX)with common antioxidants(like tea polyphenols,BHA,BHT,TBHQ,Vc,VE),DPPH free radical scavenging,ABTS free radical scavenging,ferric reducing antioxidant power,lipid peroxidation and Oxygen radical absorbing capacity(ORAC)were used in experiment.The results show that,the DPPH free radical scavenging activity of G9EX was stronger than tea polyphenols,BHA,BHT and VE,but weaker than TBHQ and Vc.The ABTS free radical scavenging activity of G9EX was stronger than tea polyphenols,BHA,BHT,Vc and VE,but weaker than TBHQ.The ferric reducing antioxidant power of G9EX was stronger than tea polyphenols,BHA,BHT and VE,but weaker than Vc and TBHQ.The anti-lipid peroxideation ability of G9EX was signifi cant,with BHA,BHT,but weaker than tea polyphenol,TBHQ,桉叶提取物与常用抗氧化剂活性比较研究DOI:10.13684/ki.spkj.2013.08.009食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用 248 2013年 第38卷 第08期桉树是热带、亚热带地区重要的速生阔叶树种，具有生长快、适应自然环境能力强、抗病虫害、经济价值高等特点，已经成为世界性的造林树种1。广林9号桉树是国内以巨桉为母本，尾叶桉为父本人工育成的杂交种，适宜在热带、南亚热带沿海丘陵等地发展，是我国南方地区的主要造林树种之一2。目前，国内桉树人工林种植面积500多万公顷，每年桉树叶的产量为2000多万t3。但对于桉叶的利用率普遍偏低，除部分用于桉叶油提取，大多数都未能得到充分利用，造成大量浪费。相关文献表明，桉叶中含有大量黄酮类化合物、酰基间苯三酚衍生物、非挥发性萜类及苷类、鞣质等活性物质4-5。本课题组前期对国内15个桉树品种研究发现，桉树叶含有大量的多酚类物质，具有较优异的抗氧化活性，尤其以广林9号为代表的巨尾桉品种多酚含量与抗氧化活性均高于其他品种6，并在此基础上研究分离提取工艺，为桉叶的进一步开发利用打下了一定的基础。目前人工合成抗氧化剂TBHQ、BHA和BHT等因其良好的抗氧化性能，广泛应用于食品工业中，但化学合成抗氧化剂的安全性一直存在很大争议。以安全性高、抗氧化能力强、无副作用、防腐保鲜等特点的天然食物抗氧化剂日益受到重视，天然食品添加剂的开发已成为目前研究的热点8。本研究以G9EX为材料，采用清除二苯代苦味酰基(DPPH)自由基、清除2,2-联氨(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)自由基、对Fe3+还原能力(FRAP)、抗脂质过氧化以及氧自由基吸收能力(ORAC)5种抗氧化活性评价方法，比较G9EX与茶多酚、BHA、BHT、TBHQ、VE、Vc抗氧化能力，综合评价其抗氧化能力，分析其最佳抗氧化应用体系以及应用过程中可能出现的问题，为桉叶的回收利用以及新型天然食品抗氧化剂的开发提供有价值的参考。1 材料与方法1.1 材料与仪器1.1.1 材料 G9EX：广林9号桉叶采于广东湛江，自然晾干，粉碎后取60目试验，提取物由本实验室提取制备；茶多酚：潮州翼龙有限公司；BHA、BHT、TBHQ：广益食品添加剂公司；水溶性VE(Trolox)、2,2-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)、二苯代苦味酰基(DPPH)、2,2联氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)：美国Sigma公司；荧光素钠：上海灵锦精细化工有限公司；其他试剂均为分析纯。1.1.2 仪器 U-3010紫外-可见分光光度计：日本日立公司；MK-3酶标仪：美国Thermo Labsystems公司；AL104电子天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；WZ-100恒温水浴锅：上海申生科技有限公司。1.2 实验方法1.2.1 DPPH自由基清除能力测定9-10 用50%甲醇水溶液分别将G9EX、茶多酚、BHA、BHT、TBHQ、Vc、VE配成0.1 mg/mL浓度样液备用，取0.2 mL上述配制好的样液以及3.8 mL 110-4 mol/L DPPH溶液加入25 mL具塞试管中摇匀，室温下密闭静置30 min，用纯溶剂作参比，在517 nm波长下测定吸光度。每份样品平行操作3次，取平均值，计算清除率。式中：Ax为样品加DPPH溶液吸光度；Ao为样品加50%甲醇吸光度；Ac为50%甲醇加DPPH溶液吸光度。1.2.2 ABTS自由基清除能力测定 参考文献11方法制备ABTS自由基储备液备用，实验时用10 mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释ABTS自由基储备液，使其室温下734 nm波长下的吸光值为(0.700.02)，制成ABTS自由基工作液。用50%甲醇水溶液分别将G9EX、BHA、BHT、TBHQ、Vc、VE配成0.05 mg/mL浓度样液备用。96孔板的每孔中分别加入ABTS工作液200 L，样液10 L，以纯溶剂为空白，混合10 s，于5 min后读VE.The ORAC of G9EX were 5.46 mol TE/mg,higher than tea polyphenols(4.8 mol TE/mg),about 3.6 times of Vc,3.9 times of VE.Guanglin9 eucalyptus leaf extract has good application prospects as a natural antioxidant.Key words:eucalyptus leaf extract;antioxidant activity;free radical;lipid peroxidation;ORAC?食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用 249 2013年 第38卷 第08期取405 nm波长下的吸光度A。每份样品平行操作3次，取平均值，计算清除率。式中：A1为样品加ABTS工作液吸光度；A2为样品加50%甲醇吸光度。1.2.3 对Fe3+还原能力测定12-13 用50%甲醇水溶液将G9EX、茶多酚、BHA、BHT、TBHQ、Vc、VE配成0.05 mg/mL浓度样液备用。分别吸取2.5 mL样液、2.5 mL pH6.6的磷酸盐缓冲液和2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液加入25 mL具塞试管中混匀，50 恒温20 min后，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000 r/min离心分离10 min。取上述各样品离心后上清夜5 mL分别加入蒸馏水5 mL和0.1%FeCl3溶液1 mL，700 nm波长处测定吸光值。每份样品平行操作3次，取平均值。1.2.4 抗脂质过氧化能力测定 参考文献采用Schaal烘箱法14评价样品抗脂质过氧化能力。称约50 g的葵花籽油若干份于小烧杯中，一份作空白。用无水乙醇将G9EX、茶多酚、BHA、BHT、TBHQ、Vc、VE按2 g/kg质量比溶解后加入到油样中，以纯溶剂为对照，充分搅拌后置于60 干燥箱中诱导其氧化。每隔24 h搅拌一次，并更换它们在恒温箱中的位置。每隔24 h测定油样的过氧化值(POV)。参照国标(GB/T 5009，372006)测定各组油脂中过氧化值(POV)，连续测定6 d。1.2.5 ORAC法抗氧化能力指数测定 参考文献15-16方法，配制浓度为153 mmol/L的AAPH溶液、810-3 mol/L荧光素钠(FL)溶液和0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mmol/L的Trolox标准液备用。精密称取G9EX、Vc、VE各10 mg以50%甲醇溶解，配制成1000 mg/L样品母液，继而用75 mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液稀释成10 mg/L的样品溶液备测。反应时精密加入100 L FL稀释液于96孔荧光板，再加入不同浓度Trolox标准液或样品溶液50 L振荡3 min，以磷酸盐缓冲液为对照，37 温育10 min后迅速加入AAPH液50 L启动反应，在激发波长490 nm，发射波长514 nm荧光下进行测定并记录荧光值。反应过程中每隔90 s测定一次荧光值。直至荧光值衰减至最低。分别计算荧光衰退曲线下的面积(AUC)以及保护面积(AUCSample-AUCblank)。每份样品做4次平行，计算平均值。1.2.6 统计学分析方法 采用SPSS Statistics17统计软件分析。2 结果与分析2.1 清除DPPH自由基能力图1 G9EX与其他抗氧化剂清除DPPH自由基能力图2 G9EX与其他抗氧化剂清除ABTS自由基能力?DPPH是一种以N为中心稳定的自由基，加入抗氧化剂后反应体系在517 nm波长下的吸光值下降。DPPH法作为一种稳定、快速的检测方法被广泛应用于抗氧化评价。如图1所示，实验结果表明，G9EX有着良好的清除DPPH自由基能力。0.1 mg/mL G9EX清除DPPH自由基能力达到(81.13.3)%，高于茶多酚(62.22.3)%、HBA(78.43.0)%、BHT(52.51.5)%、VE(1 4.7 0.8)%，但 弱 于 相 同 浓 度 的TBHQ(95.494.1)%和Vc(92.012.7)%(P0.01)。各抗氧化剂清除DPPH自由基能力为：TBHQVcG9EXBHA茶多酚BHTVE。2.2 清除ABTS自由基能力清除ABTS自由基法利用96孔板进行操作，可用于多样品同时测定，有利于快速检测样品抗氧化活性，因而也被广泛用于食物以及化合物中抗氧化活性的评价。由图2可知，G9EX有着良好的清除ABTS自由基能力。在质量浓度为0.05 mg/mL时，与其他抗氧化剂进行对比，G9EX清除ABTS自由基能力达到(87.73.7)%，强于茶多酚(74.432.6)%、BHA(793.4)%、BHT(47.031.9)%、Vc(59.92.5)%、VE(16.631.1)%，但弱于TBHQ(94.214.2)%(P0.01)。各样品清除ABTS自由基能力大小为：TBHQG9EXBHA茶多酚食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用 250 2013年 第38卷 第08期VcBHTVE。2.3 对Fe3+还原能力2.5 抗氧化能力指数(ORAC)图4 G9EX与其他抗氧化剂抗脂质过氧化能力图6 G9EX、茶多酚、Vc、VE ORAC值?图3 G9EX与其他抗氧化剂对Fe3+还原能力?对Fe3+还原能力法基于单电子转移原理。有抗氧化剂存在时，抗氧化剂作为电子供体将无颜色的Fe3+复合物还原为在700 nm波长下有特征吸收的有颜色的Fe3+复合物。如图3所示，G9EX与其他抗氧化剂均为良好的电子供体。OD值结果显示，在浓度为0.05 mg/mL时，G9EX对Fe3+还原能力显著的强于茶多酚、BHA、BHT、VE，弱于TBHQ和Vc(P0.01)。对Fe3+还原能力大小为：VcTBHQG9EXBHA茶多酚BHTVE。2.4 抗脂质过氧化作用油脂暴露在空气中会自发地发生氧化反应，生成低级脂肪酸、醛、酮等，导致过氧化值的增高，Schaal烘箱法采用高温加速了油脂氧化反应过程。由图4可知，第1天到第2天，各组油样中POV值均并未明显升高，油样氧化程度并不深，因而各组样品抗脂质过氧化作用并不明显。至第3天，除TBHQ、VE组外各组油样POV值均显著增高(P0.01)。第4天到第6天，各组油样中POV值相比第1天均显著升高(P0.01)，其中TBHQ、VE组POV值有一定的升高，但均未超过20。G9EX组POV值(54.85.3)显著低于空白组POV值(80.45.7)(P0.01)，表现出一定的抗油脂氧化作用。相同的剂量添加情况下，G9EX抗脂质过氧化稍强于BHA、BHT，强于Vc，但弱于茶多酚。至第6天，各组样品抗脂质过氧化作用能力为大小为：TBHQVE茶多酚G9EXBHTBHAVc。图5 Trolox-AUC标准曲线ORAC法自20世纪90年代以来经过不断的发展与完善，是目前被广泛关注的抗氧化活性评价方法之一。该反应是基于抗氧化剂与荧光素钠(FL)在pH7.4磷酸盐缓冲液体系中争夺AAPH产生的自由基，通过延缓反应体系中荧光值的衰减程度而表现其抗氧化能力。如图5所示，荧光衰减曲线下面积(AUC)随着Trolox标准液浓度的增加而增加，由标准曲线建立线性回归方程：y=763.11x+11.813(R2=0.9916)，在0.010.1 mmol/L浓度范围内，Trolox浓度与曲线下面积(AUC)呈良好的剂量效应关系。根据标准曲线，分别计算G9EX、茶多酚、Vc、VE抗氧化能力指数。由图6可知，G9EX ORAC值为5.46 mol TE/mg，高于茶多酚(4.8 mol TE/mg)，约为Vc(1.5 mol TE/mg)3.6倍、VE(1.4 mol TE/mg)的3.9倍。3 结论与讨论本研究通过以上5种方法评价比较了G9EX与常用抗氧化剂茶多酚、BHA、BHT、TBHQ、Vc、VE抗氧化活性。实验结果表明，G9EX有着的良好的清除自由基能力，质量浓度为0.1 mg/mL清除DPPH自由基能力已经达到(81.13.3)%，高于相同浓度茶多酚、BHA、BHT、VE；质量浓度为0.05 mg/mL时清除ABTS自由基能力达到(87.73.7)%，高于相同浓度的茶多酚、BHA、BHT、Vc、VE；0.05 mg/mL的G9EX有着良好的对Fe3+还原能力，强于相同质量浓度的茶多酚、BHA、BHT、VE；葵花籽油中添加质量比为2g/kg的G9EX，显示出食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用 251 2013年 第38卷 第08期良好的抑制油脂氧化的作用，至反应第6天时，G9EX组POV值较空白组下降了约31.0%。抗氧化指数(ORAC)评价体系中，每毫克G9EX相当于5.46 mol的Trolox，高于茶多酚，约为Vc、VE的34倍。然而由于各评价方法反应机理不尽相同，不同体系中反映的结果并不一致。例如G9EX清除DPPH自由基能力弱于Vc，但其清除ABTS自由基能力强于Vc。抗氧化剂与自由基反应机制的复杂性，导致目前尚未有单一的评价体系可以精确地反映抗氧化剂清除自由基能力。于此同时，反应体系的极性(对不同物质的溶解性差异)也直接导致抗氧化评价结果不一致。例如VE在清除DPPH自由基、清除ABTS自由基、对Fe3+还原能力(FRAP)中均未显示出强于G9EX等的抗氧化作用，但在抗脂质过氧化实验中效果明显，抑制了油脂过氧化值(POV)的升高，其抗油脂氧化能力强于G9EX、茶多酚、BHA、BHT、Vc。VE由于在油溶性体系中良好的溶解性因而有着更强的抗脂质氧化作用，而G9EX等更易于在极性较强如水溶液体系的反应中表现出良好抗氧化性能。虽然G9EX表现出了一定的抑制油脂氧化的作用，但如果作为油脂抗氧化剂加以应用，首要应加强其油溶体系中的溶解性。综合5种抗氧化评价方法结果得出，广林9号桉叶提取物有着良好的抗氧化活性，其抗氧化能力强于合成抗氧化剂BHA、BHT，清除自由基能力与茶多酚相当，抗氧化能力指数(ORAC)远高于Vc与VE，有着广阔的应用前景。广林9号桉叶提取物适合于水溶液体系中作为抗氧化剂的应用，如果要将其运用于油溶性体系中，可利用包埋微胶囊化等方法增加其脂溶性，以提高利用效率。桉叶资源非常丰富，而且价廉易得，从桉叶中提取抗氧化成分，并将其作为一种低成本、效果好的新型天然抗氧化剂，有着良好的开发应用前景。参考文献：1宋永芳.我国桉树资源的利用与展望J.林产化工通讯,1998,32(4):3-72胡远琴.巨尾桉广林9、广林29的特征特性及丰产造林技术J.现代农业科技,2011,(8):1973韦学丰,邓年方.桉树叶的开发利用J.贺州学院学报,2008,(2):133-1364付文卫,王瑞杰,等.桉属植物的化学成分与生物活性J.国外医药:植物药分册,2003,18(2):51-585Amakura Y,Umino Y,Tsuji S,et al.Constituents and their antioxidative effects in eucalyptus leaf extract used as a natural food 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