高活菌数复合益生菌发酵乳工艺优化.pdf

第 29 卷 第 13 期 农 业 工 程 学 报 Vol.29 No.13 286 2013 年 7 月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Jul.2013 高活菌数复合益生菌发酵乳工艺优化 刘成国1,2，易文芝1，周 辉1,2（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）摘 要：益生菌发酵乳中的活菌数是保证其功能特性的关键因素，为提高益生菌发酵乳中的活菌总数，以干酪乳杆菌和双歧杆菌复合菌种为试验对象，以发酵过程中的 pH 值和吸光度平均值OD值为试验指标，在单因素试验的基础上，利用 Box-Benhnken 中心组合试验和响应面分析法研究了接种量、益生菌接种比例、发酵温度、葡萄糖添加量以及大豆多肽添加量对发酵乳 pH 值和活菌数的影响，并建立了复合益生菌发酵模型。响应面优化试验结果表明复合益生菌发酵的最佳工艺条件是脱脂乳乳固体质量分数为 12%,接种量为 6%，干酪乳杆菌：双歧杆菌接种体积比为 31，葡萄糖添加量为 2.9%，大豆多肽添加量为 0.8%，发酵温度为 34，在此条件下OD预测值为 1.076，验证试验得到实际OD值为 1.087，与理论预测值相比，相对误差为 1.0%。发酵乳最大活菌数为 4.11011 cfu/mL，与已有研究相比，活菌数提高了 12 个对数级。在 4条件下贮藏 21 d 后，发酵乳的活菌数仍然保持在4.71010 cfu/mL。研究结果为工业化生产高活菌数的益生菌饮料提供参考。关键词：发酵，优化，模型，益生菌，干酪乳杆菌，双歧杆菌 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2013.13.036 中图分类号：Q939.11+7 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2013)-13-0286-11 刘成国，易文芝，周 辉.高活菌数复合益生菌发酵乳工艺优化J.农业工程学报，2013，29(13)：286296.Liu Chengguo,Yi Wenzhi,Zhou Hui.Optimization of fermentation conditions of milk with blend probiotic strains based on high viable countJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2013,29(13):286296.(in Chinese with English abstract)0 引 言 益生菌是一类可通过改变肠道菌群平衡而对动物产生有利影响的活微生物添加剂，并广泛应用于食品生产中1-2。益生菌不仅可加工成为各种食品通过消化道产生有益功效，还可以外用于同样存在固有菌群的泌尿系统和皮肤3。研究发现4-5，益生菌在人体肠道内的存活和增殖对益生菌发挥保健功效起到决定性作用，要获得理想的治疗效果，益生菌必需达到足够多的数量。然而，益生菌最大的缺点是活菌期时间短6。在加工过程和贮藏期间保证其存活和保持生物活性仍是益生菌产品面临的挑战之一7。益生菌进入人体并发挥重要功效的主要产品载体是益生菌发酵乳。市场上的益生菌乳饮料普遍含菌数量少，随着货架期延长，益生菌数量逐渐下降8-9。相关研究表明，有些市售产品货架期结束后活菌数可达 90%的衰减10。因此，提高发酵乳中的活菌数是目前益生菌乳饮料需要解决的重大技术难题之一。收稿日期：2013-04-17 修订日期：2013-06-07 基金项目：国家自然科学基金（31101334）作者简介：刘成国（1964），男（汉族），湖南常德人，副教授，研究方向为农产品加工及质量控制。长沙 湖南农业大学食品科技学院，410128。Email： 目前相关研究主要集中在某一成分或发酵条件的探究，对于系统地研究整个发酵体系，包括发酵条件、营养物质之间的相互作用尚无文献报导。本试验将乳酸菌高密度培养技术应用于发酵乳的发酵工程中。为实现益生菌的高密度培养，应提供一个适宜环境供其生长，包括温度，溶氧量，营养条件11等。而发酵乳的发酵过程中，提供营养的主要为牛乳，牛乳的乳糖不足以满足益生菌生长的需求，葡萄糖能为菌种生长提供额外的能源物质12。大豆多肽是大豆蛋白质的酶分解产物，具有促进菌种繁殖和代谢的作用13。将葡萄糖和大豆多肽添加到牛乳中作为菌种的生长因子，同时研究发酵温度、益生菌（干酪乳杆菌：双歧杆菌）比例、接种量等发酵条件对益生菌生长的影响。相关研究表明，复合菌种发酵存在共生机制时，其发酵能力要优于单菌种发酵14；而干酪乳杆菌和双歧杆菌复合发酵的产酸能力和活菌数都明显高于其他复合菌种。为简化生产工艺、缩短生产周期，本试验选择直投式干酪乳杆菌和双歧杆菌为研究对象。在单因素试验基础上，利用 Box-Benhnken 中心组合试验和响应面分析法建立干酪乳杆菌和双歧杆菌复合益生菌发酵的数学模型15。通过优化发酵条件，提高益生菌发酵乳中的活菌数，为工业化生产高活菌数的益生菌饮料提供技术支持。第 13 期 刘成国等：高活菌数复合益生菌发酵乳工艺优化 287 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌种 干酪乳杆菌：丹麦科汉森有限公司；双歧杆菌：丹尼克斯（中国）有限公司。1.1.2 材料与试剂 脱脂奶粉：新西兰恒天然脱脂奶粉；大豆多肽：陕西汇能达生物科技有限公司；葡萄糖，市售一级；MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)合成培养基：广东环凯微生物科技有限公司；氢氧化钠、乙二胺四乙酸（Ethylenediamine Tetraacetic Acid,EDTA)，均为分析纯。1.1.3 仪器与设备 SW-CJ-1FD 型单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；MJ-250BS-型霉菌培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；101 型电热鼓风干燥器：北京市永光明医疗器械厂；S20 型 pH 计：梅特勒-托利多仪器有限公司；722S 型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。1.2 试验方法 1.2.1 接种菌液的制备 称取干酪乳杆菌、双歧杆菌冻干发酵剂各 1 g，分别投放于 99 mL 的灭菌脱脂奶中，摇匀，制成菌含量为 1%的接种菌液。发酵接种量以接种的脱脂乳体积计算。1.2.2 复合益生菌发酵乳制备工艺流程 脱脂奶粉+葡萄糖+水等6065溶解110杀菌 15 min冷却至 37左右接种发酵冷却至 154冷藏16 1.3 试验内容与设计 1.3.1 复合菌体最适吸收波长的确定 在脱脂乳乳固体质量分数为 12%的条件下，110灭菌 15 min 后制得灭菌乳。在此基础上，发酵温度为 37，干酪乳杆菌和双歧杆菌接种体积比为 11，接种量为 6%的条件下发酵 24 h，制得发酵乳。以去离子水为对照调零，取灭菌乳和发酵乳分别稀释 10 倍，在不同波长下用 1 cm 的光径比色皿测定吸光度（optical delnsity,OD），以此来分析最适吸收波长17。1.3.2 复合菌种发酵的单因素试验 1）益生菌接种量确定 以干酪乳杆菌、双歧杆菌为试验对象，在益生菌接种体积比为 11，发酵温度为 37，葡糖糖的添加量为 2.5%，大豆多肽的添加量为 0.6%，脱脂乳乳固体质量分数为 12%的条件下，研究不同的接种量（2%、4%、6%、8%、10%）对发酵乳的产酸量和活菌总数的影响，以每种发酵条件下测定的OD值和最终 pH 值做为试验指标。2）益生菌接种比例的确定 其他发酵条件不变，接种量为 1.3.2.1 确定的最佳接种量，研究干酪乳杆菌：双歧杆菌接种体积比（LB=11、12、13、21、31）对发酵乳产酸量和活菌数的影响，以每种发酵条件下测定的OD值和最终 pH 值为试验指标。3）葡萄糖添加量的确定 其他发酵条件不变，接种量为 1.3.2.1 确定的最佳接种量，益生菌接种体积比为 1.3.2.2 确定的最佳比例，研究葡萄糖的不同添加量（1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%）对试验结果的影响，以每种发酵条件下测定的OD值和最终 pH 值做为试验指标。4）大豆多肽添加量的确定 其他发酵条件不变，接种量、益生菌接种体积比、葡萄糖的添加量均为上述确定的最佳水平，研究大豆多肽的不同添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）对试验结果的影响，以每种发酵条件下测定的OD值和最终 pH 值为试验指标。5）发酵温度的确定 发酵条件均为上述单因素试验选出的最佳水平，研究不同的发酵温度（25、29、33、37、41）对试验结果的影响，以每种发酵条件下测定的OD值和最终 pH 值为试验指标。1.3.3 响应面法优化复合益生菌发酵技术的试验 对单因素试验结果进行显著性分析，选出差异显著的因素为 Box-Benhnken 设计的自变量，以发酵乳的OD值为响应面，通过响应面分析与模型的建立对复合益生菌发酵条件进行优化18-20。1.4 主要指标的测定方法 1.4.1 酸度的测定 pH 值：采用 S20 型 pH 计直接测定。1.4.2 OD 值的测定 乳酸菌生长动力学研究发现菌体的吸光度值与菌体的显微镜直接计数值之间呈相关关系，因此可以采用测定OD值的方法来评定发酵乳的活菌数21。本试验根据发酵乳中钙离子在碱性条件下与盐类络合而使发醉乳均匀分散成溶液状态的原理，选取乙二胺四乙酸（EDTA）为螯合剂，络合发酵乳中的钙离子，使待测溶液变澄清，其测定步骤如下：试管中加入 1 mL 的发酵乳加入 9 mL 0.2%的EDTA溶液调节pH值至12左右混匀并静置5 min以灭菌乳作为空白对照调零在最适波长处测定吸光度值菌体进入稳定期后 OD 值变化不明农业工程学报 2013 年 288 显22，此时发酵乳中的活菌数达到最大值。试验从发酵 48 h 起 OD 值变化不大。据此，从发酵 48 h开始，连续 3 d 测定 OD 值，以每种发酵条件下测定的吸光度平均值（The Average Optical Delnsity,OD）做为试验指标。2 结果与分析 2.1 菌体最适吸收波长的确定 灭菌乳和发酵 24 h 后的脱脂乳在不同波长下的 OD 值如图 1。从图中可以看出，350430 nm之间，发酵乳的吸光度比较大，但灭菌乳的吸光度也很大，所以透过比色皿的很大一部分光束被灭菌乳所吸收，影响了菌体的吸光度。在 540660 nm之间，虽然灭菌乳本身的吸光度很小，但是发酵乳的吸光度也不大。波长在 450500 nm 之间，灭菌乳的吸光度不大，但发酵乳的吸光度较大，在此波段中，发酵乳和灭菌乳差值最大的一组为 460 nm。因此选择该复合菌体的最适吸收波长为 460 nm。李学贵，袁生报道的微生物转化过程中利用 OD 值实时监测细菌生物量变化的研究17一文中测定的假单胞菌最大吸收波长为 470 nm，与本试验测定的复合菌体的最适吸收波长相差不大。图 1 发酵乳和灭菌乳在不同波长下的 OD 值 Fig.1 OD value of fermented milk and sterilized milk at different wavelengths 2.2 单因素试验结果与分析 2.2.1 接种量对发酵乳活菌数的影响 试验研究了不同接种量对发酵乳 pH 值和OD值的影响，试验结果见图 2。pH 值表示发酵过程的产酸量，预试验结果表明，当发酵结束后 pH 值达到 3.6 左右时，则在益生菌乳饮料的调配过程中不需要额外添加酸味剂。OD值表示发酵乳中的活菌数，OD越大，发酵乳的品质也就越高。从图中可以看出，当接种量大于 6%时，发酵乳的OD变化不明显。pH 值随接种量的增加呈现先下降后变化不大的趋势。当接种量为 6%时，发酵乳的OD值为0.878，pH 值为 3.20。考虑生产成本的节约，选择接种量为 6%为此单因素试验的最佳水平。采用方差分析法对发酵乳的OD值进行显著性分析，结果表明接种量对OD值的影响不显著（P0.05）。因此在响应面试验中，不将接种量列为试验因素。注：干酪乳杆菌与双歧杆菌的接种体积比为 11，发酵温度为 37，葡糖糖的添加量为 2.5%，大豆多肽的添加量为 0.6%。Note:Ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 1:1,fermentation temperature was at 37,glucose level was 2.5%,soybean peptide level was 0.6%.图 2 不同接种量对发酵乳的 pH 值和OD值的影响 Fig.2 Effect of different inoculation volume on pH value and average OD value of fermented milk 2.2.2 益生菌接种比例对发酵乳活菌数的影响 试验研究了不同益生菌接种比例（LB）对发酵乳 pH 值和OD值的影响，试验结果见图 3。注：接种量为 6%，发酵温度为 37，葡糖糖的添加量为 2.5%，大豆多肽的添加量为 0.6%。Note:inoculation volume was 6%,fermentation temperature was at 37,glucose level was 2.5%,soybean peptide level was 0.6%.图 3 不同益生菌比例对发酵乳的 pH 值和OD值的影响 Fig.3 Effect of different ratio of probiotics strains on pH value and average OD value of fermented milk 从图 3 中两条曲线可以看出，发酵乳的 pH 值和OD值成线性关系，OD值越大所对应的 pH 值就越小。当干酪乳杆菌：双歧杆菌的比值小于 2 时，发酵乳的OD值随着干酪乳杆菌：双歧杆菌的比值增大而上升。当干酪乳杆菌：双歧杆菌比例为 21时，OD值为 0.927，pH 值为 3.18，此条件下的发酵乳活菌总数和产酸量均最大。当干酪乳杆菌：双第 13 期 刘成国等：高活菌数复合益生菌发酵乳工艺优化 289 歧杆菌比例为 31 时，OD值下降。为进一步检验不同益生菌比例对发酵乳活菌总数的影响是否显著，对试验结果进行单因素方差分析，方差分析的结果为 P0.01，所以不同接种比例下的OD差异极显著。因此在益生菌比例单因素试验中，选择干酪乳杆菌双歧杆菌=21 为最佳水平。2.2.3 葡萄糖添加量对发酵乳活菌数的影响 试验研究了不同葡萄糖添加量对发酵乳 pH 值和OD值的影响，试验结果见图 4。由图中可以得到，发酵乳的OD值和 pH 值先随葡萄糖的增加几乎呈直线上升和下降的趋势，当添加量 3%时，OD值为 1.031，pH 值为 3.19，此条件下的发酵乳产酸量和活菌总数均达到最大值。当葡萄糖含量继续增加，产酸量和活菌总数反而出现下降的趋势。在发酵过程中，菌体大量繁殖，利用乳糖和葡萄糖做为能源物质23。当发酵乳中添加的葡萄糖不足以提供菌体繁殖所需要的能源物质时，菌体的繁殖受到影响。当发酵乳中的葡萄糖浓度过大时，菌体的生长也将受到抑制。采用方差分析法对发酵乳的OD值进行显著性分析，方差分析的结果表明葡萄糖添加量对OD值有极显著影响（P0.01)。此单因素试验中，最佳水平是葡萄糖的添加量为 3.0%。注：接种量为 6%，干酪乳杆菌与双歧杆菌的接种体积比为 21，发酵温度为 37，大豆多肽的添加量为 0.6%。Note:inoculation volume was 6%，the ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1,fermentation temperature was at 37,soybean peptide level was 0.6%.图 4 葡萄糖添加量对发酵乳的 pH 值和OD值的影响 Fig.4 Effect of different glucose contents on pH value and average OD value of fermented milk 2.2.4 大豆多肽添加量对发酵乳活菌数的影响 试验研究了不同大豆多肽添加量对发酵乳 pH值和OD值的影响，试验结果见图 5。从图中可以得到，发酵乳的活菌总数和产酸量先随大豆多肽添加量的增加而变大，当添加量达到 0.8%时，OD值为 1.067，pH 值为 3.17，此条件下的产酸量和活菌总数最大。当大豆多肽添加量大于 0.8%时，发酵乳的产酸量和活菌总数变化不明显。由于乳酸菌的蛋白水解能力弱，牛乳中酪蛋白形成的短肽和氨基酸不能完全满足乳酸菌高密度生长的需要24，将一定量的大豆多肽添加到牛乳中可为乳酸菌的生长提供足够的氮源，从而大幅度提高菌体数量。当牛乳中的大豆多肽继续增加时，菌体利用大豆多肽做为营养物质已达到限度，所以活菌总数和产酸量变化并不明显。为考查大豆多肽添加量对发酵乳活菌总数的影响是否显著，对试验结果进行单因素方差分析，不同大豆多肽添加量下的OD差异极显著（P0.01）。此单因素试验中，最佳水平是大豆多肽的添加量为 0.8%。注：接种量为 6%，干酪乳杆菌与双歧杆菌的接种体积比为 21，发酵温度为 37，葡萄糖的添加量为 3%。Note:inoculation volume was 6%,the ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1,fermentation temperature was at 37,glucose level was 3%.图 5 大豆多肽添加量对发酵乳的 pH 值和OD值的影响 Fig.5 Effect of different soybean peptide contents on pH value and average OD value of fermented milk 2.2.5 发酵温度对发酵乳活菌数的影响 试验研究了不同发酵温度对发酵乳 pH 值和OD值的影响，试验结果见图 6。由图中可以看出，2937之间的产酸量和活菌总数均较大，最佳发酵温度为 33，此时OD值为 1.083，pH 值为 3.18。发酵温度过低或过高，乳酸菌的细胞活性都不高，影响基因的表达与转录，菌体的大量繁殖将受到抑制。为进一步检验发酵温度对发酵乳活菌总数的影响是否显著，对试验结果进行单因素方差分析，结果表明发酵温度对OD值有极显著影响。此单因素试验中，发酵温度的最佳水平为 33。2.3 响应面优化试验结果与分析 2.3.1 响应面模型试验方案及结果 根据 Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上，固定接种量为 6%，脱脂乳乳固体质量分数为 12%，选取发酵温度、益生菌接种比例、葡萄糖添加量、大豆多肽添加量 4 个因素为Box-Benhnken 设计的自变量，利用响应面分析法对复合益生菌的发酵工艺条件进行优化。由单因素试验可知，总体上发酵乳的OD值越大所对应的 pH 值就越小，即发酵乳中的活菌数与产酸量成负相关。发酵结束后，发酵乳的 pH 值均在 3.6 以下，在后期工序农业工程学报 2013 年 290 的调配过程中无需额外添加酸味剂。而反映发酵乳品质的主要是活菌数，因此在响应面分析试验中仅以OD作为响应面。试验因素与设计见表 1。注：接种量为 6%，干酪乳杆菌与双歧杆菌的接种体积比为 21，大豆多肽的添加量为 0.8%，葡萄糖的添加量为 3%。Note:inoculation volume was 6%，the ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1,soybean peptide level was 0.8%,glucose level was 3%.图 6 发酵温度对发酵乳的 pH 值和OD值的影响 Fig.6 Effect of different fermentation temperature on pH value and average OD value of fermented milk 表 1 响应面分析因素与水平 Table 1 Variables and levels of response surface analysis 水平 Level 因素 Factors-1 0 1 干酪乳杆菌与双歧杆菌比例 Ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium 1:1 2:1 3:1 葡萄糖添加量 Glucose content/%2.5 3.0 3.5 大豆多肽添加量 Soybean peptide content/%0.6 0.8 1.0 发酵温度 Fermentation temperature/29 33 37 根据表 1 的试验因素与水平的设计，进行四因素三水平响应面试验，具体试验方案及结果见表 2。2.3.2 响应面模型的分析 以发酵乳的OD值为响应值，由软件 Design Expert 8.0 进行分析，得到的结果见表 3。表 2 响应面分析试验结果 Table 2 Results of response surface analysis 试验号 Test number A(干酪乳杆菌与双歧杆菌比例)Ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium B 葡萄糖添加量 Glucose content C 大豆多肽添加量 Soybean peptide content D 发酵温度 Temperature OD值 1 1 0 1 0 0.926 2 0 1 0 1 0.965 3 0 0 0 0 1.121 4 0 1 0 1 0.799 5 1 0 1 0 0.997 6 1 0 1 0 0.987 7 0 1 0 1 0.883 8 0 1 0 1 0.935 9 1 0 1 0 0.824 10 0 1 1 0 1.087 11 1 0 0 1 0.826 12 0 1 1 0 0.886 13 1 0 0 1 0.891 14 0 1 1 0 0.982 15 1 0 0 1 0.782 16 1 0 0 1 0.949 17 0 0 0 0 1.117 18 0 1 1 0 0.908 19 1 1 0 0 0.933 20 0 0 0 0 1.117 21 0 0 1 1 0.869 22 0 0 1 1 0.864 23 1 1 0 0 0.933 24 0 0 1 1 1.050 25 1 1 0 0 0.881 26 1 1 0 0 0.989 27 0 0 1 1 0.809 第 13 期 刘成国等：高活菌数复合益生菌发酵乳工艺优化 291 表 3 OD值响应面模型的方差分析表 Table 3 Analysis of variance table for response surface quadratic model of average OD value 项目 Iterm 平方和 Quadratic sum 自由度 DOF 均方 Mean square F 值 F value P 值 P value 显著性 Significance 模型 Model 0.25 14 0.018 454.65 0.0001*A 8.46010-3 1 8.46010-3 218.7 0.0001*B 7.75210-3 1 7.75210-3 196.22 0.0001*C 9.91910-3 1 9.91910-3 251.06 0.0001*D 0.040 1 0.040 1021.80 0.0001*AB 4.00010-6 1 4.00010-6 0.10 0.7558 AC 0.014 1 0.014 346.50 0.0001*AD 4.90010-5 1 4.90010-5 1.24 0.2872 BC 0.019 1 0.019 478.56 0.0001*BD 7.29010-4 1 7.29010-4 18.45 0.0010*CD 0.014 1 0.014 352.44 0.0001*A2 0.064 1 0.064 1610.04 0.0001*B2 0.031 1 0.031 786.60 0.0001*C2 0.030 1 0.030 766.13 0.0001*D2 0.11 1 0.11 2885.82 0.0001*残差(residue)4.47110-4 12 3.95110-5 失拟项(lack of fit)4.63410-4 10 4.63410-5 8.69 0.1075 净误差(net error)1.06710-5 2 5.33310-6 总误差(overall error)0.25 26 注：*代表极显著水平 P0.01，*代表显著水平 P0.05。Note:*represents the extremely significant level P0.01,*represents the significant level P0.05.经回归拟合后，根据各项的回归系数，去掉不显著项得到的模型方程如下：OD=1.12+0.027A0.025B+0.029C+0.058D 0.058AC0.069BC+0.014BD+0.059CD 0.11A20.076B20.075C20.015D2 （1）式中，OD为平均 OD 值；A 为干酪乳杆菌和双歧杆菌的接种体积比；B 为葡萄糖添加量，%；C 为大豆多肽添加量，%；D 为发酵温度，。经过表 3 的方差分析可得到，该模型达到极显著的水平（P0.0001)。同时，该模型的失拟度不显著（P0.1)，可见此方程跟实际数据拟合性良好，试验设计可靠，适用于复合益生菌发酵体系条件的优化。信噪比（Adeq Precision）的值为 71.880，远大于 4，因此该模型可用于预测试验数据。决定系数 R2=0.9981，调整后 R2=0.9959，说明该模型的变量与自变量之间关系显著。在此模型中，益生菌比例、葡萄糖添加量、大豆多肽添加量、发酵温度对发酵乳的OD值均有极显著的影响（P0.0001)。且益生菌比例与大豆多肽添加量、葡萄糖添加量与大豆多肽添加量、葡萄糖添加量与发酵温度、大豆多肽添加量与发酵温度之间的交互作用极显著（P0.0001)。2.3.3 各因素间的交互作用分析 对响应面模型中交互作用显著的因素（P0.01)进行分析。1）发酵温度与大豆多肽添加量的交互作用对试验结果的影响 发酵温度和大豆多肽添加量的交互作用如图 7所示。从图中可以看出，在较低的发酵温度下，随着大豆多肽添加量的增加，发酵乳的OD值变化趋势不明显。在较高的发酵温度下，发酵乳的OD值随大豆多肽添加量的增加先升高，后下降且幅度不大。在相同的大豆多肽添加量的情况下，发酵乳的OD值随着发酵温度的上升先增加后减少，且大豆多肽添加量高时的增幅比添加量低时的增幅大。在温度较低的情况下，细胞中酶活性不高，所以增加发酵乳中的营养因子浓度所起到提高活菌数的作用也就不大。当发酵乳中有足量的营养物质供菌体生长时，活菌数随温度的升高所呈现的增幅也变大。从图中OD值出现的最大值区域可以看出，适当地提高发酵温度和大豆多肽添加量有利于发酵乳活菌总数的增加。农业工程学报 2013 年 292 注：干酪乳杆菌和双岐杆菌接种体积比为 21，葡萄糖添加量为 3%，接种量为 6%，脱脂乳乳固体质量分数为 12%。Note:the ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1,glucose level was 3%,inoculation volume was 6%,the mass fraction of skim milk solid was 12%.图 7 发酵温度与大豆多肽添加量对OD值的影响 Fig.7 Combined effect of fermentation temperature and soybean peptide content on average ODvalue 2）发酵温度与葡萄糖添加量的交互作用对试验结果的影响 发酵温度和葡萄糖添加量的交互作用对试验结果的影响如图 8 所示。从图中可以看出，随着发酵温度和葡萄糖添加量的增加，发酵乳的OD值也不断地变大，当两者增大到一定程度时，发酵乳的OD值达到最大值，当发酵温度和葡萄糖添加量继续增加时，OD值反而下降。单独提高或降低发酵温度或葡萄糖添加量，都不会使发酵乳的OD值达到最大。因此，只有发酵温度和葡萄糖添加量同时取适中值时，才能提高发酵乳中的活菌数。注：干酪乳杆菌和双岐杆菌接种体积比为 21，大豆多肽添加量为 0.8%,接种量为 6%，脱脂乳乳固体质量分数为 12%。Note:the ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1,soybean peptide level was 0.8%,inoculation volume was 6%,the mass fraction of skim milk solid was 12%.图 8 发酵温度与葡萄糖添加量对OD值的影响 Fig.8 Combined effect of fermentation temperature and glucose content on averageODvalue 3）大豆多肽添加量和葡萄糖添加量的交互作用对试验结果的影响 注：干酪乳杆菌和双岐杆菌接种体积比为 21，发酵温度为 33，接种量为 6%，脱脂乳乳固体质量分数为 12%。Note:Ratio of Lactobacillus casei and Bifidobacterium was 2:1,fermentation temperature was at 33,inoculation volume was 6%,the mass fraction of skim milk solid was 12%.图 9 大豆多肽添加量与葡萄糖添加量对OD值的影响 Fig.9 Combined effect of soybean peptide content and glucose content on average OD value 大豆多肽添加量与葡萄糖添加量的交互作用对试验结果的影响见图 9。从图中可以看出，当葡萄糖添加量取值在 2.5%3%以及大豆多肽添加量在 0.8%1.0%时，OD值达到最大值范围。当葡萄糖添加量和大豆多肽添加量同时作为营养因子添加到发酵乳中，提高大豆多肽添加量所起到的增加活菌数作用要大于提高葡萄糖添加量所起到的作用。在发酵乳这个体系中，总营养物质的浓度在一定范围内对菌体的生长是有利的，而当总营养物质的浓度过高或过低时，对菌体的生长都起到抑制作用。因此，适当提高大豆多肽添加量的同时降低葡萄糖添加量有利于发酵乳中活菌数的提高。4）益生菌接种比例与大豆多肽添加量的交互作用对试验结果的影响 益生菌比例与大豆多肽添加量的交互作用对试验结果的影响见图 10，从图中可以得到，随着大豆多肽添加量和干酪乳杆菌：双歧杆菌比例的增加，发酵乳的OD值也不断变大，当干酪乳杆菌与双歧杆菌的比值增大到 1.52.5，大豆多肽添加量增加到 0.80%0.95%时，OD值达到最大值范围。当大豆多肽添加量和干酪乳杆菌：双歧杆菌比例继续增大时，发酵乳中OD值反而变小。大豆多肽做为氮源添加到牛乳中时，干酪乳杆菌和双歧杆菌对其利用情况不同，且双歧杆菌的需求量要大于干酪乳杆菌。因此OD值出现最大范围时，大豆多肽提第 13 期 刘成国等：高活菌数复合益生菌发酵乳工艺优化 293 高的幅度要大于干酪乳杆菌与双歧杆菌比值增加的幅度。单方面增加或减少益生菌接种比例和大豆多肽添加量都不能使OD值达到最大，只有两者均取适当值范围时才能使发酵乳中的活菌数达到最大值。注：葡萄糖添加量为 3%，发酵温度为 33，接种量为 6%，脱脂乳乳固体质量分数为 12%。Note:Glucose level was 3%,fermentation temperature was at 33,inoculation volume was 6%,the mass fraction of skim milk solid was 12%.图 10 大豆多肽添加量与益生菌接种体积比对OD值的响 Fig.10 Combined effect of soybean peptide content and ratio of probiotics strains on average OD value 2.3.4 复合益生菌发酵体系最佳工艺条件的优化与验证 利用 Design Expert8.0 软件进行分析，得到的复合益生菌发酵体系最佳工艺条件是益生菌比例为 2.841，葡萄糖添加量为 2.92%，大豆多肽添加量为 0.804%，发酵温度是 33.8，在此条件下OD预测值为 1.076。在工业生产中为了便于实践操作，对优化条件的参数取整后得到益生菌比例为 31，葡萄糖添加量 2.9%，大豆多肽添加量为 0.8%，发酵温度为 34，为检验响应面模型的可靠性，按上述最佳工艺条件重复 3 次试验并用平板计数法测定此条件下的最大活菌数，以及测定发酵乳的 pH 值。验证试验得到实际OD值为 1.087，与理论预测值相比，相对误差为 1.0%，可见通过响应面优化方法得到的复合益生菌发酵体系最佳工艺条件是可靠的。验证试验得到的发酵乳凝固状态均匀，乳清析出少，且有浓郁的发酵乳香味，风味纯正，无异味。经测定发酵乳的 pH 值为 3.17，最大活菌数为4.11011cfu/mL，陈健凯，潘裕添，林洵等在活性乳酸菌乳饮料高活菌数发酵工艺的优化16一文中探索了获取高活菌数的发酵乳饮料的发酵条件，试验中所用的乳酸菌为干酪乳杆菌。结果表明，获得高活菌数的发酵乳最佳工艺条件为：发酵温度为29，奶粉加入量(营养液质量浓度)为 10g/L,接种体积分数为 5%，在此条件下每毫升发酵液中能获得对数值为 9.57（3.17109 cfu/mL）的乳酸菌数。本试验将菌种高密度培养技术应用到发酵乳的整个发酵过程中，把葡萄糖和大豆多肽的添加量做为试验考查的因素，与文献相比，活菌数提高了 1-2个对数级。在 4条件下贮藏 21 d 后，优化后的发酵乳活菌数为 4.71010 cfu/mL，与有些市售产品货架期结束后活菌数仅为 105cfu/mL10相比，优化后的发酵工艺不仅提高了发酵乳中的活菌数，而且显著减缓了活菌数下降的速度。据BCC公司发布的市场研究报告数据显示25，2013 年全球益生菌消费市场总量约达 196 亿美元，中国的益生菌产品年消费市场总量达到 130 亿元至150 亿元人民币，其市场份额又以益生菌发酵乳制品为主。张天鸿报道的益生菌产品活菌数与保健效果关系之研究26一文从菌体细胞的大小角度分析得出，若产品含 1012 cfu/g 以上的活菌，则表明其生产效率已经达到理论值。本试验通过响应面法建立了复合益生菌发酵工程模型并得到最佳发酵工艺条件，在此条件下的发酵乳活菌数可达到4.11011 cfu/mL，解决了当前市售益生菌产品中活菌数不足的问题。本研究的结果表明，通过优化益生菌发酵条件，在发酵乳中添加适量的大豆多肽和葡萄糖能够显著提高发酵乳的活菌数（P0.0001)。大豆多肽的市售价格约为 200 元/kg，葡萄糖的市售价格约为3.5 元/kg，且两者的添加量很小，平均 1 kg 的发酵乳中所增加的成本大约为 1.7 元。主要的成本来源是大豆多肽，但是将其做为功能性成分添加到发酵乳中