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细胞工程复习
细胞工程基础
1、 细胞工程: 是指以生物细胞或组织为研究对象, 按照人们的意愿进行工程学操作, 从而改变生物性状, 以获得生物产品, 为人类生产和生活服务的科学。
2、 细胞工程的研究内容可分为七大类:
1） 器官、 组织和细胞培养
2） 原生质体培养
3） 植物胚胎培养
4） 动物胚胎培养
5） 转基因动植物
6） 胚胎干细胞
7） 染色体工程
3、 实验室组成
1） 动物细胞工程实验室组成: 无菌操作室、 培养室、 细胞学鉴定室、 制备室、 储藏室、 清洗灭菌室
2） 植物细胞工程实验室组成: 无菌操作室、 制备室、 清洗灭菌室以及具备光照条件的培养室和试管苗移栽所需的温室
4、 玻璃器皿清洗注意事项
1） 浸泡: 用水浸泡——①初次使用: 经稀盐酸( 5%) 浸泡; ②用过的: 用后立即用清水浸泡。
2） 刷洗: 宜选用软毛刷和优质的洗涤剂。器皿数量大时, 可使用超声波清洗器清洗, 冲洗干净
3） 酸洗: 刷洗不掉的微量杂质经过清洗液的强氧化作用可被除掉。常见的清洗液: 浓硫酸、 重铬酸钾及蒸馏水配制而成。具有高度腐蚀性, 酸缓慢放入水中。
4） 冲洗: 用水充分冲洗, 不留任何残迹, 然后用蒸馏水漂洗数次, 烘箱内烘干备用。
5、 物理灭菌方法
1） 湿热灭菌
2） 过滤除菌
3） 干热灭菌
4） 紫外线灭菌
6、 化学灭菌方法: 1) 熏蒸消毒; 2) 药剂喷雾消毒
7、 无菌操作室消毒

8、 培养基的成分( 植物) :

9、 培养基的成分( 动物) :
10、 生物安全: 是指对由动物、 植物和微生物等生物体给人类健康和自然环境可能造成的不安全的防范, 主要是针对病原微生物或具有潜在危害的重组DNA等生物危险的防范。
11、 生物安全实验室分为四级:
植物细胞工程
12、 植物细胞全能性的含义:
1) 每个植物细胞都具有它母体的全部遗传特性
2) 每一个细胞都能够在特定条件下发育成为母体一样的植株。
13、 植物细胞具有全能性的原因

14、 一个已分化的细胞要实现其全能性一般要经历两个过程: 一是脱分化, 二再分化
15、 实现细胞全能性的条件: ①具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影响下解脱出来, 使其处于独立发育的离体条件下; ②赋予离体细胞一定刺激, 包括营养物质、 植物激素、 光周期、 温度, 酸碱度
16、 细胞分化: 是指由发育起始状态的合子沿个体发育方向不断分化形态结构、 生理功能不同的细胞、 组织、 器官而最终形成完整植株的过程, 即由于细胞的分工而导致其结构和功能改变或发育方式改变的过程。
17、 分化细胞差异与功能相适应, 其含义为:
18、 在一个分化的成熟细胞中, 一般仅5%~10%的基因处于活化状态。
19、 脱分化( 去分化)
20、 高等植物细胞脱分化和再分化示意图
21、 植物愈伤组织
22、 分类

23、 长期培养物形态发生潜力的丧失( 三种学说)
1) 生理学说

2） 遗传学说

3) 竞争学说

24、 外植体的极性: 一般是指在器官、 组织甚至细胞中, 在不同的轴向上存在某种形态结构和生理生化上的梯度差异。
25、 植物激素对愈伤组织培养的调控作用:
( 1) 生长素
( 2) 细胞分裂素
( 3) 脱落酸
( 4) 乙烯
26、 器官发生: 是指植物根、 茎、 叶、 花、 果实等器官的分化与形成。
器官发生的三种方式: 第一种是先形成芽, 然后在芽形成的茎基部长根而形成小植株:
第二种是先根后芽
第三种是在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根, 然后两者结合起来形成一株植物, 这种情况在很多植物中均发生。
27、 体细胞胚( SE) 或胚状体的含义: ①体细胞胚是离体培养的产物, 只限于离体培养范围使用, 以区别体于无融合生殖胚; ②体细胞胚起源于非合子细胞, 区别于由受精卵发育而成的合子胚; ③体细胞经过了胚胎发育过程, 具有胚根、 胚芽和胚轴的完整结构, 并与原外植体的微管组织无联系, 是个相对独立的个体, 区别于组织培养中以器官发生方式分化的不定芽和不定根。
与器官发生相比, 体细胞胚胎发生在组织学上具有明显的特点:
第一、 体细胞胚最根本的特征为两极性
第二、 体细胞胚的微管组织分布是独立的”Y”字形结构, 与外植体组织无结构上的联系, 出现所谓的生殖隔离现象, 这种结构便于细胞的分化和全能性的分化
第三、 由体细胞胚形成的再生植株其遗传性相对稳定, 差异性远小于由器官发生途径形成的再生植株
28、 影响体细胞胚胎发生的因素
1、 氮源
2、 生长素
3、 组织起源
29、 P56人工种子示意图

30、 控制胚性细胞同步化的方法
1、 抑制剂法促进细胞同步分裂
2、 低温处理促进细胞同步分裂
3、 渗透压控制同步化法
4、 同步胚的分段收集筛选法
5、 通气法
动物细胞培养技术
1、 动物细胞培养是用无菌操作的方法将动物细胞体内的组织或器官取出, 模拟动物体内的生理条件, 在体外进行培养, 并观察细胞的生长、 发育及衰老等生命现象的技术
2、 生物学特征的两重性
1、 基本生物学特征与体内细胞相似
2、 差异性
3、 细胞分化;在个体发育中, 细胞后代在形态结构和功能上发生稳定性差异过程。
4、 去分化( 也叫脱分化) : 是指各种分化细胞, 逐渐失去各自的形态与功能个性, 表现出某种趋同性的过程。
5、 体外培养细胞的形态
1、 贴附型细胞:在体外培养时能贴附于支持物表面生长, 大致分为
1) 成纤维细胞型:
2) 上皮细胞型:
3) 游离细胞型:
4) 多型细胞型:
2、 悬浮型细胞:
6、 接触抑制和密度抑制
接触抑制: 细胞相互接触后, 如果培养的是正常细胞, 由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动, 这种现象称接触抑制。( 接触抑制可作为区别正常细胞与癌细胞标志之一)
密度抑制: 细胞接触汇合成片后, 随发生接触抑制, 但只要营养充分, 细胞依然能够进行增殖分裂, 因此细胞数目仍在增多。但当细胞密度进一步增大, 培养液中的营养成分减少, 代谢产物增多时, 细胞因营养的枯竭和代谢物的影响, 则发生密度抑制, 导致细胞分裂停止。
7、 传代: 当细胞增殖到一定密度时, 则需要分离出一部分细胞并更新营养液, 否则将会影响细胞的继续生存。
8、 培养细胞生命期: 是指细胞在体外培养条件下持续增殖和生长的时间。
9、 细胞系的生长过程( P230)

10、 细胞系: 初代培养细胞一经传代后便改称细胞系。
细胞株: 细胞系经过克隆或用其它方法而得到的由单一类型的细胞群体建立的亚系。
无限细胞系: 细胞获得持久性增殖的能力的细胞群体。
11、 细胞”一代”: 是指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。
细胞生长曲线( P231)

12、 细胞培养的一般过程

传代培养传代时要特别注意: ①细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前, 不要急于传代; ②原代培养时细胞多为混杂生长, 上皮样细胞和成纤维细胞并存的情况很多见, 传代时不同细胞有不同的消化时间, 因而要根据需要注意观察并及时进行处理; ③首次传代时细胞接种数量要多一些, 使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。
冻存细胞的复苏的原则: 冻存细胞较脆弱, 要轻柔操作, 融化要快速, 解冻后直接加入完全生长培养基。
13、 细胞克隆培养: 又称单细胞分离培养, 即把一个单细胞从群体中分离出来单独培养, 使之重新繁衍成为一个新的细胞群体的培养技术。
克隆形成率或克隆率: 细胞群中单个细胞形成克隆的百分数
14、 单细胞分离培养技术分三种, 其中饲养层克隆法
15、 动物细胞大规模培养方法与微生物细胞相比, 有显著差别:
①动物细胞比微生物细胞大得多, 无细胞壁, 耐机械强度低, 对剪切力敏感, 适应环境能力差;
②倍增时间长, 生长缓慢, 易受微生物污染, 培养时须用抗生素;
③培养过程需氧量少;
④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;
⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;
⑥代谢产物具有生物活性, 生产成本高, 但附加值也高。
方法: 1、 转瓶培养
2、 反应器贴壁培养
3、 悬浮培养
4、 固定化培养:
固定化培养方法:
（1） 微载体培养系统
（2） 中空纤维培养系统
（3） 微囊培养系统
优点: ①可防止细胞在培养过程中受到物理损伤; ②活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜, 从而提高细胞密度和产物含量, 并方便分离纯化处理
缺点: ①微囊制作复杂, 成功率不高; ②微囊内死亡的细胞会污染正常产物; ③收集产物必须破壁, 不能实现生产连续化。
16、 细胞分裂指数: 体外培养细胞的生长、 分裂增殖能力, 可用分裂指数来表示。分裂指数是指细胞群体中分裂细胞所占的百分比, 即细胞群的分裂相数/1000个细胞。
17、 细胞同步化: 是指研究细胞周期的不同阶段的生化特征, 必须获得与细胞周期一致性的细胞。
18、 细胞融合: 是指两个会两个以上来源相同或不同的细胞合并成一个细胞的过程。
19、 杂种细胞: 是指当异核体同步进入有丝分裂后, 细胞核的核膜崩解, 而且不同来源的核染色体汇合, 使得融合细胞内只含有一个源自不同基因组的细胞核。由于这个细胞核是由不同亲本的细胞核融合形成, 因此, 这个细胞即称为杂种细胞。
20、 人工诱导细胞融合方法
1) 病毒诱导融合
2) 化学方法诱导融合
3) 电诱导融合
21、 细胞融合的关键步骤是两亲本细胞的质膜发生融合, 形成同一的质膜( 细胞膜) 。
22、 杂交细胞的筛选: ①非选择性筛选; ②选择性筛选
非选择性筛选: 根据杂交细胞的表型特征和物理特性的差异, 用机械方法筛选杂交细胞的方法。包括:①利用细胞形态、 大小、 密度与颜色标记上的差异, 能够识别和筛选杂交细胞; ②经过离心方法能够筛选不同密度的杂交细胞; ③利用杂种细胞在显微镜下可辨别的特性, 可用显微操作技术进行分选; ④在不同亲本细胞上加不同的荧光标记后细胞融合产生双亲标记, 然后利用荧光激活分选技术对杂种细胞进行筛选。
选择性筛选: 经过改变培养基成分或添加药物对杂种细胞进行筛选的方式。( 原理P265)
1） 利用基因缺陷互补的筛选
2） 利用抗性标记筛选
3） 利用营养缺陷的筛选
4） 利用温度敏感突变特性的筛选
23、 克隆化培养: 是指使单个杂交细胞在一个独立空间中生长增殖, 最终扩增为一群相对较纯的, 且能够稳定表示某些特定性状的细胞群体的培养方式。
24、 杂交瘤: 是指肿瘤细胞与正常细胞的融合。专指淋巴细胞杂交瘤, 获得目的: 用来生产单克隆抗体。具体方法
25、 抗原逃逸变种: 虽然单一的肿瘤抗原也可诱导体内产生抗肿瘤的免疫细胞, 可是若肿瘤组织不再表示该抗原时, 就会逃逸免疫细胞的杀伤, 使肿瘤复发。
26、 细胞融合在基础理论方面的应用
1) 基因定位: 是指某一特定基因在染色体上的位置被确定的过程。
原理:

27、 杂交瘤技术的基本原理: 是将骨髓瘤细胞与淋巴细胞进行融合, 获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的功能, 又具有骨髓瘤细胞能够在体外长期快速生长的特性。

28、 单克隆抗体( McAb) 的特性
1、 高度特异性
2、 高度稳定性
3、 高抗体活性
4、 不可知性
29、 基因工程抗体: 是将抗体的基因重组并克隆到表示载体中, 在适当的宿主中表示并折叠成有功能的一种抗体分子的技术。
30、 建立T细胞杂交瘤的方法
1、 用作融合亲本的瘤系
2、 特异T淋巴细胞的富集
3、 细胞融合
4、 融合细胞的筛选
5、 抗原特异的杂交瘤的筛选
6、 克隆化过程
胚胎工程
1、 胚胎移植:
2、 胚胎移植的基本程序P277

3、 供体的选择时, 应考虑: ①具有遗传学价值; 应选择生产性能优良的无遗传缺陷的品种或个体; ②供体最好是有一胎以上的正常繁殖史既往繁殖力记录较高的母畜, 或已充分发育成熟的后备母畜; ③健康状况良好, 无生殖器官疾病, 发情周期正常。
4、 受体的选择应注意:①健康状况良好、 无生殖器官疾病、 发情周期正常的适繁母畜; ②体型过小的母畜不宜作受体。
5、 超数排卵: 在动物发情周期的适当时期, 用促性腺激素进行处理, 诱发其卵巢上大量卵泡同时发育并排卵的技术。
6、 供体超排中常见的生殖激素
1） 促性腺激素
1、 促卵泡素( FSH)
2、 促黄体素( LH)
3、 孕马血清促性腺激素( PMSG)
4、 人绒毛膜促性腺激素( hCG)
5、 促排卵3号
2） 孕激素
3） 前列腺素
7、 超排的基本原理
影响卵泡的发育及排卵的三个因素
1、 垂体分泌的促性腺激素
2、 卵泡产生的雄激素
3、 卵泡液的作用
8、 胚胎回收: 也称采卵, 就是把胚胎从供体的生殖道中冲洗出来, 提供移植或其它胚胎工程研究应用。
方法: 手术回收和非手术回收
牛的胚胎回收( 大家畜非手术回收) P283
羊、 猪或其它中小动物( 手术回收)
9、 净化处理: 就是把检出的胚胎移入含胚胎培养液的捡卵杯中冲洗2或3次, 以除去附着于胚胎上的污染物。
10、 胚胎的保存: 是指胚胎在正常发育温度下暂时储存于体内或体外而不使其失去活力; 或者将其保存于低温或超低温情况下, 使细胞处于新陈代谢和分裂速度减慢或停止的状态, 一旦恢复正常发育温度时, 又能继续发育。
11、 胚胎冷冻保存的原理( 概括) P289

12、 胚胎冷冻方法
( 1) 常规冷冻法( 慢速冷冻法或逐步降温法) , 需专用冷冻仪, 是当前生产中广泛采用而且最为成功的冷冻方法。
( 2) 一步冷冻法: 利用高浓度的抗冻剂使胚胎在冷冻前脱水, 从而减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成,
( 3) 玻璃化法
如何减少高浓度溶液对胚胎的毒害作用: ①经过两步平衡胚胎; ②缩短平衡时间; ③降低平衡温度; ④使用蔗糖、 海藻糖等抗毒性物质。
13、 体外受精技术主要包括: 卵母细胞的获取, 未成熟卵母细胞的体外成熟培养, 精子的体外获能, 成熟卵母细胞与获能精子的体外受精, 受精卵的体外培养和移植。
14、 精子获能: 哺乳动物的精子必须在子宫或输卵管内存留一段时间, 并经发生一定的生理变化, 才能获得受精能力, 将此现象称为精子获能。
15、 超活化运动:
16、 顶体反应: 获能时精子头部的去能因子被除掉, 引起精子头部质膜形态上的发生改变, 同时顶体内酶被激活, 这一过程称为顶体反应。其主要变化: 精子质膜与顶体外膜融合, 出现空泡结构, 顶体内膜暴露, 顶体酶释放。
17、 体外发育阻断: 体外培养液中缺少像体内那样对胚胎发育有利的物质。
18、 影响胚胎发育的因素: ( P299)
1) 培养液的体积
2) 培养液渗透压
3) 氧气含量的变化
4) 水分
5) 培养液中的缓冲成分
6) 培养液中过氧化物对胚胎发育的影响( 解除过氧化物毒性的过氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶)
7) 培养液中胚胎数的影响( 多枚胚胎培养)
19、 共同培养系统: 是将胚胎与其它组织细胞( 体细胞) 共同培养, 组织细胞产生的物质供胚胎发育所需, 从而有利于胚胎克服体外发育阻断, 改进胚胎发育。
20、 克隆: 在生物学中, 是指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。在动物繁殖学中, 是指不经过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。
21、 动物克隆的基本原理: ( P303)

22、 胚胎分割: 就是采用显微操作系统将哺乳动物附植前的胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术, 运用胚胎分割可获得同卵双生后代。
23、 胚胎融合: 是指经过显微操作技术使2枚或2枚以上的受精卵或胚胎发育成为1枚胚胎的技术, 由此发育而成的个体称为嵌合体。
24、 克隆技术尚需进一步解决的问题
1.提高成功率
2.解决部分个体生理或免疫缺陷问题
3.解决受体细胞质与供体细胞核周期相容性的问题
4.经过核移植产生的重构胚能否完成整个发育过程的问题
5.减少或避免供体线粒体的带入
25、 动物的性别控制: 是经过对动物的正常生殖过程进行人为干预, 使成年雌性动物产生人们所期望的性别后代的一门技术。
26、 动物性别控制原理:(P311)

动物干细胞技术
1、 胚胎干细胞具有体外培养无限增值、 自我更新和分化为三个胚层组织细胞的能力, 因而被称为”万能细胞”。
2、 干细胞: 是指具有无限或较长期的自我更新能力, 并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞。
干细胞分类:
1) 根据细胞分化潜能的大小: 全能干细胞、 三胚层多能干细胞、 单胚层多能干细胞和单能干细胞;
2) 根据细胞来源不同: 胚胎性干细胞和成体干细胞

3、 ES细胞的来源( 3种途径)
早期胚胎(主要途径)
妊娠早期胎儿组织
体细胞核移植胚胎
诱导多能性干细胞
4、 ES和EG细胞系的特性和鉴定( P324)
一、 特性
1） 无限增值性
2） 分化潜能性
3） 种系传递性
二、 鉴定方法
1） 形态学特征

2） 特异性标志分子的表示

3） 分化潜能的检测

5、 细胞分化: 是指同一来源的细胞在细胞分裂过程中, 细胞间产生形态结构、 生化特征和生理功能有稳定性差异的过程。
6、 ES/EG细胞维持为分化的分子机制
1） LIF/STAT3通路

2） Oct-4

7、 ES细胞体外诱导分化的方法: 基因外诱导和基因修饰
转基因动物
1、 转基因动物: 是指经过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、 早期胚胎干细胞或早期胚胎, 使之整合到受体细胞的基因组中, 经发育而产生的个体。
2、 转基因动物的6个常见技术( P333)
一、 原核期胚胎的显微注射技术

二、 反转录病毒技术

三、 慢病毒载体技术

四、 精子载体技术

五、 体细胞核移植转基因技术

六、 胚胎干细胞介导技术

3、 动物转基因技术在生命科学基础研究领域中的应用:
1） 研究基因结构和功能
2） 研究组织表示特异性
3） 研究发育相关基因的表示与调控
4） 基因多级调节系统的研究
5） 细胞功能的研究
动物染色体过程
1、 染色体过程: 是指人们按照一定的设计, 有计划地合并、 添加、 替换、 消减或易位单条染色体或染色体片段, 对生物染色体组成或染色体结构进行改造, 以定向改变物种遗传特性的新技术。
2、 动物的单倍体育种: 是指人工单性生殖, 其方法主要包括雌核发育和雄核发育。
3、 染色体的结构变异
1） 染色体缺失

2） 染色体重复

3） 染色体倒位

4） 染色体易位

4、 染色体结构的改造
1) 染色体片段的删除和重排

2) 染色体的易位工程
5、 染色体数目变异( 2种情况)
6、 ”赫特威效应”原理

7、 雌核发育鉴别
1、 以颜色、 形态作为鉴别依据
2、 生化方法鉴别
3、 细胞学方法
4、 遗传标志方法
8、 染色体加倍技术
1． 化学诱导方法

2． 物理诱导方法

3． 生物学方法
9、 人工染色体: 是指人工组建的具有染色体功能的DNA分子。