CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项.doc

C8检测细胞增殖/毒性得原理、方法及注意事项一、K检测细胞增殖/毒性得原理Cell Countg Kit8(简称CCK8)试剂可用于简便而准确得细胞增殖与毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有W8【化学名:2-(2-甲氧基4-硝基苯基)3-(-硝基苯基)5(2,4-二磺酸苯)2H-四唑单钠盐】,它在电子载体1-甲氧基5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-MehoxyPMS)得作用下被细胞中得脱氢酶还原为具有高度水溶性得黄色甲瓒产物(Frza dye)。生成得甲瓒物得数量与活细胞得数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖与毒性分析。用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验C8得优点: 使用方便,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素与有机溶剂; CCK8法能快速检测; CK8法得检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度; K-法得重复性优于MTT 法; CCK-法对细胞毒性小; CCK8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用。CCK得缺点: 与MTT法相 比,CCK8与XT得价格比较贵、 CC8试剂得颜色为淡红色,与含酚红得培养基颜色接近,不注意得话容易产生漏加或多加。与以往得增殖毒性测定试剂相比较:检测方法TT法XT法ST1法CK8法甲臢产物得水溶性差(需加有机溶剂溶解)好好好产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高检测时间较长较短较短最短检测波长60600nm42-8nm20480n49nm细胞毒性高,细胞形态完全消失很低,细胞形态不变很低,细胞形态不变很低,细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷二、C8检测细胞增殖毒性得方法实验一:细胞增殖分析1、制备细胞悬液:细胞计数2、接种到孔板中:根据合适得铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样得样本可做3个重复。、37培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养-小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。4、加入1ulCK8:由于每孔加入CK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀、或者直接配置含0K8得培养基,以换液得形式加入。5、培养1小时:细胞种类不同,形成得omazan得量也不一样。如果显色不够得话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别就是血液细胞形成得omaza很少,需要较长得显色时间(56小时)。6、测定50nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长45-40nm,参比波长000nm。实验二:细胞毒性分析1、制备细胞悬液:细胞计数2、接种到96孔板中:根据合适得铺板细胞数,每孔约10细胞悬液,同样得样本可做个重复。3、37培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。4、加入不同浓度得毒性物质5、37培养箱中培养:加入毒性物质得培养时间,要瞧毒性物质得性质与细胞得敏感性,一般要根据细胞周期来决定,起码要一代以上得时间、6、加入1u CC8:由于每孔加入CC量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀、培养4小时:细胞种类不同,形成得oraza得量也不一样。如果显色不够得话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别就是血液细胞形成得Foaa很少,需要较长得显色时间(56小时)。8、测定45nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长50490m,参比波长60650nm。注: 若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 L 0、M得HC溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。 如果待测物质有氧化性或还原性得话,可在加CK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新得培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小得情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后得空白吸收即可。三、CCK8检测细胞增殖/毒性得注意事项 当使用标准96孔板时,贴壁细胞得最小接种量至少为1,00 个/孔 (00 l 培养基)。检测白细胞时得灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,50 个/孔 (100 l 培养基)、 酚红与血清对CK8法得检测不会造成干扰,可以通过扣除空白孔中本底得吸光度而消去。 CCK8可以检测大肠杆菌,但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定得过程中需要避免细菌污染,以免影响结果。 CC8在05下能够保存至少6个月,在-20下避光可以保存年。 当在培养箱内培养时,培养板最外一圈得孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差、一般情况下,最外一圈得孔只加培养基,不作为测定孔用。 在培养基中加入CCK8,培养一定得时间,测定450nm得吸光度即为空白对照。在做加药实验时,还应考虑药物得吸收,可在加入药物得培养基中加入CCK8,培养一定得时间,测定450 m得吸光度作为空白对照、 金属对CCK8显色有影响:当终浓度为 mM得氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5、15、9得显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度就是0 mM得话,将会100抑制。 悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量与延长培养时间。