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含有明胶处方药物剂型的溶出性质的变化
含有明胶处方药物剂型的溶出性质的变化
对存在问题、实验方法及解决方法的回顾
药品生产厂家有责任保证他们生产的药品在药品标签中所注明的贮藏条件下符合溶出度的规定，这样做不仅是出于市场竞争及伦理的观点，也是为了符合法律。这很有必要，因为溶出度可以度量药品的吸收和生物利用度。
但是很不幸，对于一些药品，最后的溶出度发生变化是一个很普遍的问题。而配方中在外层含有明胶（软胶囊或者硬胶囊）或者糖包衣的片剂是其中的典型。这个问题被归咎于随时间延长而发生的明胶交联结合。由于这个趋势，人们对明胶的使用曾经产生质疑。然而，尽管曾经有很多尝试用别的材料来取代明胶，明胶目前依然广泛应用。
本文回顾了有关含明胶处方广泛存在的溶出度降低的文献和有关体内体外临界观察值的文献。包括对明胶的简介，以及一些报道的溶出度降低的例子，还有一些报道的解决方法。
明胶——简介
明胶是胶原水解后得到的水溶性蛋白质的混合物（1）。蛋白质片段几乎全部以氨基酸形式存在（见表I）这些氨基酸以氨基联结形成分子量从15，000到25，000的线性聚合物。
表I 氨基酸及明胶中氨基酸的成分
氨基酸
百分含量
氨基乙酸
25.5
脯氨酸
18.0
羟(基)脯氨酸
14.1
谷氨酸
11.4
丙氨酸
8.5
精氨酸
8.5
天(门)冬酰胺酶
6.6
赖氨酸
4.1
亮氨酸
3.2
缬氨酸
2.5
苯基丙氨酸
2.2
苏氨酸
1.9
异亮氨酸
1.4
甲硫氨酸
1.0
组氨酸
0.8
酪氨酸
0.5
丝氨酸
0.4
胱氨酸
0.1
半胱氨酸
0.1
明胶的类型。 明胶的的两种类型是以制造方式不同划分的。A型明胶（pH3.8-6.0；等电点6-8）是用酸水解猪皮得到的，可塑性和弹性较好。B型明胶（pH5.0-7.4；等电点4.7-5.3）是水解骨头及动物皮肤得到的，硬度较好。尽管有时候单独使用A型明胶或者或者B型明胶，但是大多数药用明胶是以上两种类型明胶的混合物（2）。市场上有不同等级、不同颗粒大小及不同分子量的明胶出售，它们是半透明的薄片或者颗粒状或者是粉末。明胶通常是以冻力划分等级的，冻力是以勃鲁姆强度（bloom strength）表示的，就是用6.66%（w/w）的明胶水溶液灌入冻容器中，并使用12.7mm直径的活塞，当形成精确的4mm深的凹槽时的克数。
性质 实际上明胶既没有气味也没有味道。它在丙酮、氯仿、乙醇、乙醚、甲醇中不可溶。它可溶于甘油、酸和碱中，尽管强酸和强碱可以使蛋白质变性（precipitation）。在水中蛋白质膨胀，软化，逐渐吸收5-10倍于自身重量的水分。在热水中，它的溶解度增大。冷却至35-40℃蛋白质形成凝胶或胶冻。大于40℃时，以溶胶形式存在。与酸性介质相比，在碱性介质中形成的凝胶粘性较大。（3）
由于明胶是蛋白质，明胶也表现出蛋白质的化学性质（如明胶可被大多数蛋白质水解系统水解产生氨基酸组分）。明胶可以和酸、碱、乙醛、醛酸、阴离子及阳离子聚合物、电解液、金属离子、可塑剂、防腐剂和表面活性剂反应。
应用 在制药工业中明胶具有巨大价值，因为很多处方都要用到明胶，它也是软胶囊和硬胶囊中唯一用于定形的成分。它可广泛应用于溶液剂、糖浆剂、片剂、糖衣片、吸入剂和牙科用药、阴道用药、局部用药以及注射液的制备。它的其它应用还包括制备糊剂、锭剂、栓剂。此外，它还可以作为非肠道用药的赋形剂、片剂的粘合剂和包衣片的包衣材料。低分子量明胶因为有提高口服药物溶出度的作用，而一直被研究。
明胶也被用来将药物制备成微囊，就是将有活性的药物包封在微小的囊状物中，最后可能处理成粉末状物质。在脱水剂（如乙醇或7％硫酸钠）的作用下，当温度大于40℃时明胶可以形成单凝聚层。Peter et al.研究了复凝聚法形成过程中明胶的性质（4）。明胶胶囊还可以被包衣用于某些用途（5）。明胶软胶囊还可以包薄膜衣和糖衣。
在胶囊烘干前后的明胶交联作用可以使药物延缓释放（8）。甲醛也用来将软胶囊和硬胶囊包肠溶衣（2，9，10）。也有报道在甲醛和明胶相互作用的胶囊上钻孔以控制药物的释放（11）。有人观察过通过这种方式制成的维拉帕米胶囊的药物达到零级（zero-order）释放。也有一些报道描述明胶的微球配方及与微球戊二醛交联作用后可以达到控制药物释放的目的（12）。交联作用后明胶凝胶因为具有生物附着性以及延缓药物的释放可以用于活体组织中（15）。以盐诱导通过明胶的复杂凝聚过程可制成DNA-明胶乳酸纳米粒，在此基础上用于基因传递的新系统和质粒DNA已经得到了开发。它由200－700nm的 球形微粒组成，其中含有25－30％（w/w）的DNA。这些微粒可以通过明胶的交联作用变得稳定。（16）
在医疗方面，明胶可以作为血浆的代用品，及伤口上的敷料。明胶制成的胶囊中装入放射性标记的药物进行过放射性追踪研究（17）。明胶还广泛应用于食品工业和照相用的乳液中。
一般说来，在口服药处方中，明胶被认为是一种无毒性，没有刺激性的材料。然而，少数文章报道明胶胶囊可以在食道内粘着，而这可以引起局部疼痛。也有文章报道在非口服应用明胶材料后出现了包括过敏反应在内的超敏反应（21）。
官方状态（Offical status） 明胶被收录于FDA的非活性成分目录之中。在英国它可以作为合法药物使用，在各国药典中也都对明胶有所描述。
明胶交联作用及溶出度变化的问题
以明胶为主的处方出现一个最主要的问题就是在很长时间之后溶出度会有明显的下降，这个问题被归咎于明胶的交联作用。交联作用可以使整个处方变成膨胀的、薄的坚韧而有弹性的水溶性膜，也可以称作薄膜。薄膜作为一层屏障，限制了药物的释放。而且在轻微搅拌下，薄膜也不容易破裂，溶出度值常常会降低到零点（rejection point）。
有些文献报道了对明胶溶出度发生变化的各种研究。本部分讨论一下各种不同处方的实例。
糖衣片（SCTs） 在糖衣片中，明胶的作用主要是粘合剂、膜赋形剂及包衣材料，它可以用于片剂的打底。在打底过程中，应在片芯上交替使用包衣液和粉衣层（dusting powder），并作适当干燥。这样的程序会形成粘合剂与粉末层层交错的层积式结构或薄三明治结构。通过对原本凹凸不平的片芯的包衣，可以使片剂表面光滑，以方便最后着色剂的包衣。
Khalil et al.的研究中很早就强调了糖衣片溶出度降低的问题。他们制成由蔗糖、葡萄糖、果糖、碳酸钙组成的明胶薄膜（cast gelatin film） 所构成的糖衣片打底系统。将薄膜分别在70℃，80℃，90℃，110℃温度下储藏不同时间，从中发现在储藏温度与薄膜的溶解度值间存在重要的相关性。随着储藏温度的提高，明胶的崩解和溶出能力下降了。
后来Barrett和Fell报道了老化对保泰松糖衣片溶出度的影响（24）。保泰松糖衣片分别被保存在20℃、37℃、50℃温度下。最终明胶的崩解及溶出度的下降与片芯外明胶底层包衣层的粘附有关。存放时间较长的片剂（5年时间）其溶出度及崩解的降低与在37℃存放的片剂情况相似。而在20℃和37℃保存的糖衣片其分解时间几乎没有受到影响，仅仅是在37℃保存14周后的片剂其分解时间受到了影响。据Warren和Rowe报道环噻嗪和利血平的糖衣片在不同温度下保存一年其溶出时间延长（25）。同样也发现溴化普洛盘舍啉的糖衣片其溶出度降到很低（26）。El-fattah和Khalil检测了14批盐酸氯丙嗪的溶出度，结果发现所有批次在0.1N盐酸中的分解试验均符合美国药典的规定，却没有一个批次溶出度符合不低于80％的规定（27）。Ondari et al.观察了市售氯丙嗪糖衣片在等温条件下（30℃）及循环条件（30℃下12小时，室温12小时，30℃及湿度90％下12小时）下保存4周之后其溶出时间的延长（28）。
在另一项研究中，将八种市售品牌的布洛芬片剂在37℃和湿度75％条件下保存四周对它们的溶出度进行了研究（29）。在接近四周的时候发现糖衣片的溶出度有明显的下降，而薄膜衣片却没有受到影响。糖衣片溶出度的降低会造成临床药效的下降。在对核黄素的研究中，将两个品牌十批的核黄素保存在不同的密封容器内，容器内的温度从18℃到28℃，容器外的温度为45℃。结果发现，底层衣中含有明胶的那个牌子与另一个牌子相比其溶出度明显下降（30）。Dahl et al.经研究发现明胶包衣的扑热息痛片在室温条件下保存7个月或不到7个月后其体外的溶出度没有变化（31）。而把这些药品在高湿度下分别保存3.5和7个月后，发现其药物溶出均有明显下降，而且在任意时间点均可看到标准偏差。
Shah和Parsons比较了丙戊酸的薄膜衣片、糖衣片及未包衣片在加速保存后的体外溶出行为（32）。在40℃、75％湿度下加速保存至少3个月后，未包衣片和薄膜衣片的溶出度没有下降。在加速一个月后，糖衣片中丙戊酸的溶出百分量没有明显变化。然而在加速两个月，三个月后，丙戊酸在第一个小时的溶出量明显下降了。溶出度的下降被归咎于糖衣层的崩解出了问题，然而事实上在溶出度试验的最后阶段片芯依然是干燥的，这表明片剂的密封衣层或是底衣层发生了粘附。
在最近的一项研究中，Singh et al.将磷酸氯喹糖衣片分别在25℃60％湿度、40℃75％湿度、25℃60％湿度有光照以及40℃75％湿度有光照四种条件下保存，然后对药物释放量进行研究（33）。在25℃60％湿度有光照条件下保存16天后，溶出度明显减少。在40℃75％湿度有光照条件下保存8天溶出效果更差。
明胶硬胶囊 硬胶囊的囊皮一般含有13％－16％的水分，在40％到60％湿度下硬胶囊可以保存而不影响质量。水分在13％到16％变化不会削弱囊皮的完整性。当囊皮含有少于12％水分时，囊皮会变脆而易断裂；当囊皮所含的水分大于18％时囊皮变潮、软、发生变形，而且如果胶囊内容物有吸湿性的话，囊皮具有将其中的水分转移到内容物中去的倾向（34）。受贮存环境影响的囊皮水分含量主要影响硬胶囊的溶出稳定性。胶囊的明胶囊皮中水分可作为增塑剂使硬胶囊有韧性。在不同贮藏条件下引起的不同的囊皮水分含量会造成硬胶囊发生糟糕的物理变化，如变脆，胶囊粘着。内容物中的水分可转移至囊皮，这将引起潜在的软化和粘着问题。例如，内容物中含有风化性成分就会出现这种问题。相反，当内容物中含有溶解性和吸湿性成分时囊皮中的水分也可转移进入胶囊内容物。在40℃、50℃以及40℃75％湿度条件下保存时水分在囊皮和内容物之间发生转移可能是明胶性质改变的原因之一。（35）
Langenbucher 观察了处方中含有乳糖的胶囊在11％－67％的湿度条件下保存2－8周后溶出度的下降。Khalil et al.研究了老化对四种品牌的氯霉素硬胶囊的崩解性和溶出度的影响（23）。所有这些药品在25℃不同湿度条件下在敞口的容器中保存32周。在49％和66％湿度条件下保存的样品其溶出度没有发生变化。而保存在80％湿度条件下的胶囊在第一个小时内没有药物溶出。在另一项研究中，将四环素和氯霉素的市售胶囊在30℃和75％湿度条件下在敞口容器中保存1个月，其体外药物溶出比保存前有明显减慢。在实验条件下囊皮并不崩解（37）。Mohamad et al.在将盐酸四环素胶囊保存48个月之后也发现明胶囊皮具有局部不溶解性（38）。Georgarakis et al.研究了保存在不同湿度条件下（50％－90％）三水苄青霉素胶囊其储藏条件对药效的影响，并且发现胶囊的溶出有明显的减慢（39）。这被归咎于水分从囊皮转移进入内容物而引起的内容物凝聚并且稍后结块。
Murthy et al.用三种药品作为模型系统评估了加速贮藏条件对硬胶囊溶出性质的影响（40，41）。在这项研究中，所使用的硬胶囊了含有不同色素如FD&C3号红、40号红、5号黄、28号红、1号蓝。使胶囊的囊体和囊帽中均含有着色剂以及在双色胶囊的囊帽中含有着色剂，对光、湿度以及二者共同的因素所造成的影响进行了评价。在荧光、80％湿度条件下保存2天后，FD&C5号黄、3号红、1号蓝的胶囊释放药物完全。在环境光和80％湿度条件下保存2周或在紫外光和80％湿度条件下保存2天后发现药物的全部释放量有明显下降。而将同样药物装入透明胶囊后在高强度荧光80％湿度条件或环境光80％湿度条件下保存4周后，发现胶囊的溶出及分解性质没有变化。因此可以推断胶囊所发生的变化是由色素引起的，而光线和高湿度则加速了这种变化。这项研究强调了在贮藏囊皮含FD&C色素的胶囊时避免高湿度及使用避光容器的必要性。
Dey et al.指出没有外包装包装或用PVC或PVC－聚三氟氯乙烯包装的etodolac胶囊（200或300mg）在加速条件下（40℃75％湿度）保存后，30min的溶出度均不符合80％的规定，而用高密度聚乙烯（HDPE）的瓶子做外包装的胶囊在同样条件下保存溶出度却符合规定（42）。在另一项研究中对布洛芬硬胶囊保存在高温高湿及有光和无光条件下的溶出度进行了研究。结果发现在有光及高温高湿的条件下药物的溶出度明显减少。
明胶软胶囊 软胶囊的溶出度问题也是一个普遍存在的问题，尽管有关这方面的文献并不是很多。药物在软胶囊中以溶液或分散液形式存在。软胶囊的囊皮中含有增塑剂（主要是甘油或山梨醇）、聚乙二醇（PEG）、聚乙烯糖醚（ethers of polyethylenated glycosides）和明胶、水。高湿度可以使胶囊变软、粘、膨胀并可能引起囊皮中水分进入内容物中。这种水分的转移潜在的影响药物化学和溶出的稳定性（43－45）。由于软胶囊中明胶使用量更大，软胶囊和硬胶囊的囊皮厚度经常不同。
经研究Chafetz et al.发现吉非罗齐软胶囊的溶出度明显下降（47）。这些胶囊分别在37℃、37℃80％湿度和45℃，并在保存1、2、3个月后进行测定。所有含有吐温－80的胶囊在37℃80％湿度保存1个月后胶囊表面形成一层膜。Bottom et al对两个批次的硝苯吡啶软胶囊进行溶出度试验，结果均不合格（48）。在最近的一项研究中，将市售的nimcsulide软胶囊在40℃、75％湿度有光照条件下保存不同时间，对其溶出度进行试验。结果表明溶出度变化明显，而在第8天和8天后取出的样品根本不溶出。
以明胶作为粘合剂的片剂 目前对以明胶为粘合剂的片剂存在不同的报道。Asker et al.进行的一项研究中，对以明胶作为粘合剂的可的松片剂分别在50℃83%湿度和70℃96％湿度条件下保存7周（49）。两种条件下保存的片剂分解和溶出时间均延长。但是最近对氯奎片剂（同样含有明胶作为粘合剂）进行的一项研究中，却没有显示出这样的结果。将所有的片剂在40℃75％湿度、光下保存3周，与外层含明胶的药物不同的是，这些片剂分解完全，溶出时间也是几乎没有延缓。
交联作用的明胶处方的生物利用度及胃肠道酶的作用
Johnson et al.对地高辛的软胶囊进行了生物利用度的研究，将其在37℃下保存10个月（50）。尽管溶出率下降了，但是吸收程度却没有下降。同样，Chafetz et al.也没有发现体内体外的结果存在相关性。他们的结果表明吉菲罗齐胶囊当外面已经形成一层膜时生物利用度与易溶出的药物等同。然而Martin et al.发现苯妥英胶囊暴露在高湿下会破坏它的临床药效（51）。后来，Mohamad et al.也报道了对四环素胶囊保存42个月后，尽管体外溶出度下降了，但是体内的生物利用度没有发生变化（38，52）。
胃肠道酶的作用 由于在体外溶出度下降的配方在体内并不引起溶出下降，可以得出结论是体内的胃肠道酶消化了变性的明胶。也许是这个原因，在60年代以前当使用模拟胃液和肠液作为溶出介质验证胃肠道酶的作用时，几乎没有关于含明胶处方药物在贮存后溶出度下降的报道。Rather指出胃液中的蛋白酶加速了溶出缓慢胶囊的溶解。因此Murthy et al.进行了一项更大规模的研究以确证溶出介质中的酶对加速条件下储存的两种处方药物其药物释放的特性的影响。他们的研究表明湿度、光照加速条件所造成的溶出度的下降程度会被含酶的溶出介质所降低。
Dahl et al.进行了同样的实验，表明对乙酰氨基酚的明胶包衣片在湿度箱中保存7个月后，以1％的胰酶水溶液作为溶出介质，其溶出度与新制得的对乙酰氨基酚的明胶包衣片相同（31）。同样，Dey et al.证明了加速保存的（40℃75％湿度）含有200或300 mg etodolac明胶硬胶囊在体外以磷酸盐缓冲液（pH7.5）为溶出介质时测定的溶出度下降，而以含有1％w/v胰酶的磷酸盐缓冲液为溶出介质时（pH7.5）测定的溶出度却符合规定（30分种内溶出度不低于80％）。此外，加速保存的200或300 mg 依托度酸胶囊在狗体内的吸收程度与室温保存的而且体外溶出度合格的胶囊等同。同样，加速的300－mg胶囊溶出度不符合规定而在一项24例成人人体的研究中其生物利用度却与控制胶囊（新包装的）等同。
最新研究 在最近的一项研究中，将两批的硝苯地平明胶软胶囊在10－20ppm和80ppm甲醛环境中保存（48）。在保存1.5年后第一批胶囊与新胶囊生物等效，而第二批在保存1年后即生物不等效。在另一项研究中，将维生素的明胶软胶囊在40℃、75％湿度条件下保存6个月，25℃、60％湿度条件下保存1年，然后研究其崩解时间（54）。在缺酶的崩解介质中该药物结果不合格，而在含有酶的介质中结果符合规定。尿检结果显示两种条件保存的药品体内崩解率都正常。
Brown et al. 使用微克闪烁扫描法比较了未处理及适度处理的扑热息痛硬胶囊（用甲醛处理）的崩解行为。结果两组胶囊崩解性质均没有发生变化。Digenis et al进行了相同而且更深层次的研究，他用微克闪烁扫描法研究了经甲醛处理的阿莫西林硬胶囊在体内的破裂和GI转移，同时该胶囊进行了6例（six-way）单剂量的生物等效性研究（55）。研究表明发生严重交联作用的明胶胶囊在体内的分解时间延迟，接着又导致胶囊的吸收和Tmax延迟。然而，AUC（0-α）或Cmax却没有发生变化。在更新的一项研究中用甲醛对对乙酰氨基酚软胶囊和硬胶囊进行不同程度的交联作用，发现Cmax和Tmax均增大。尽管严重交联和适度交联的胶囊AUC（0-α）相同，但是从Cmax上看，两者不具有生物等效性。
美国药典关于含酶的双级溶出实验
由于在溶出液中添加胃肠酶（胃蛋白酶或胰液酶）后溶出效果好，因此建议在美国药典中对特定检测含明胶药品的溶出介质中增加酶（22）。这项建议是以酶可以消除高度交联的明胶胶囊外壁对药物分子所形成的阻碍屏障为基础的，溶出液加酶后会降低实验时间和实验成本。
因此，1993年7月美国药典溶出度及生物利用度分委员会（DBA）建议制定第二实验方法，对按照第一实验方法不符合规定的老化胶囊使用含有酶的介质。同时此项建议也声明胶囊的生物利用度不能因此变化而降低这一条件。1994年年初这项建议被提交到美国药典论坛。几乎同时，FDA的工业明胶胶囊生产组成立，美国药典委员会也是其中参与者之一。因此DBA决定推迟这一建议的正式化，直至生产组完成他们关于生物利用度－生物等效性问题的研究。1997年初，美国药典论坛对按照正式实验方法不合格的硬胶囊推出了双级（two-tier）实验。最初曾建议在每个药物的各论中增加第二实验方法的使用条件。而在1997年九十月间出版的美国药典中，第二溶出实验介质被写入总论<711>“溶出度”中，这一双溶出液实验方法最终出现在美国药典25版上（57）
双级实验（The two-tier test）
双级实验包括药物的各论中规定的最初溶出液中不含酶的方法。第二溶出试验是在含有酶的介质中进行的。在不同pH条件下，推荐使用两种酶。各论中规定的水或介质pH＜6.8时推荐使用纯胃蛋白酶，它可以引起≤750000单位／1000ml的活性；而介质pH≥6.8时，在介质中不应加入超过0.05g/1000mL的胰酶。
将本实验扩大到可溶性药物中 最近人们试图使含可溶性药物的处方其溶出度测定也可以使USP双级实验。为了得到应用目的，人们考虑使用非离子表面活性剂配合胃蛋白酶（58）。
造成问题的化学过程（The chemistry of the problem）
Digenis et al.的一篇极好的综述中描述了相关制药环境所造成的明胶交联作用的合理机制（mechanistic rationalizations）。因此本文并没有详细讨论这种机制。
假定的化学过程 下面三种化学过程被假定涉及相互交联作用。
l 明胶与三氨基酸赖氨酸的反应性增高。彼此邻近的赖氨酸残基氧化脱氨产生最终的乙醛集团。一部分乙醛集团被相邻的赖氨酸的自由ε－氨基集团攻击产生亚胺，随后经过醛醇浓缩反应产生了含有吡啶环的交联作用的产品。
l 当杂质中含有乙醛时，赖氨酸的自由ε－氨基集团与乙醛反应。反应产生羟基甲氨酸（hydroxymethylamino）衍生物，然后脱水形成阳离子亚胺。后者与其他羟基甲氨酸（hydroxymethylamino）赖氨酸的残余物质反应形成乙烯醚（dimethylene ether），并最终重排形成彼此以亚甲基联接的两个赖氨酸自由ε－氨基集团，导致随后的交联作用。
l 明胶交联作用的第三种形式是自由氨基集团与阳离子亚胺中间体（见前面黑体字）反应产生的氨化形式和乙缩醛的胺形式。这种类型的反应中外界的pH值发挥着很大的作用。
l 葡萄糖或药物配方中常用的其它醛糖会发生与之类似的反应。这些糖类的醛基与游离氨基集团反应，形成亚胺，并且通过重排产生酮糖。随后酮糖的羰基集团与另一个胺反应，形成交联明胶。
不仅仅有赖氨酸-赖氨酸交联，赖氨酸-精氨酸交联和精氨酸-精氨酸交联也有报道。总而言之，明胶多肽的交联能够以以下两种方式进行：
l 同一多肽链内部发生架桥（链内，分子内交联）
l 两个相邻肽链上的氨基酸可桥联（链间，分子间交联），这一过程增加了明胶的分子量（39）。
交联导致在最初分子间排列紧密时形成的粒子间键脱去，代之以新键形成，最终形成了一种具有不同的多孔性和多孔结构的剂型，因此体外释放模式也会与原来不同（34）。
导致交联的几个原因
人们发现：一些化学物质，高湿，高温和光照对于外层含明胶的配方的体外溶出时间延长起到了单独或协同影响。本节将讨论一些已有报道的例子。
化学物质：
普遍知道的可引起明胶变性的化学物质已列在表II中。在列出的化学物质中，甲醛研究的最为深入（9）。在剂型中，它从增塑剂、防腐剂、脂肪和聚乙烯化合物中释放出来，如PEG、PEG和脂肪醇或苯酚形成的酯，聚乙烯甘油酯（polyehtylenated glyceride）非离子型表面活性剂（聚山梨酸酯，不饱和脂肪酸酯）以及含六亚甲基四胺为稳定剂的玉米淀粉（9，38，47，52，59）。为了在甲醛浓度和含明胶制剂的溶出度降低程度之间寻找相互关系已经做了大量工作（60-64）。相反，人们已利用明胶与甲醛的交联反应生产肠溶胶囊（2，9-11，65）。
表II 已报道的引起明胶交联的物质
物 质
参考文献
醛（糠醛，丙烯醛，甲醛，戊二醛，glycery(乙醛)
2，47，48，52，65，81，86
亚胺
22
酮
22
糖类（葡萄糖和醛糖）
2
色素（FD&C,3号红，40号红和1号蓝
2
磺酸和对甲基苯磺酸
41，86
碳二酰亚胺（1-乙烯基-3-（3-二甲胺基-丙基）碳二酸亚胺盐酸盐，盐酸胍）
81，86
苯
86
对苯二酰氯
8
也已知道色素，特别是FD&C 3号红和FD&C 40号红在明胶结构特性的变化及导致其溶解性降低方面起到了重要作用（66，67）。色素与明胶通过疏水键合或氢键键合的方式相互作用（9，66）。Murthy 等人发现当含有FD&C 3号红的胶囊在高湿和光照下贮藏时，其溶出度明显下降。
Ray-Johnson and Jachson报道了明胶与碳酸钙和其它水不溶性化合物如硫酸钙、碳酸镁的反应（68）。但是，对于水溶性盐类（如氯化钙和氯化镁）没有发现有不良作用。因此，推断在不溶性钙盐存在时明胶性质的变化是由于片剂包衣内部的物理变化导致，而不是离子和明胶间的化学反应导致。
另外的两项研究报道了填充在装有胶囊的高密度聚乙烯瓶口处的人造丝线圈也会对胶囊的溶出度产生负面影响。人造丝产生糠醛，当其以饱和气体存在时会很快降低胶囊的溶解性（65）。
Hartauer等人（89）报道了在2个月和3个月的加速环境条件下贮藏，含人造丝线圈的包装中装有的少量胶囊（10个）的溶出度显著下降。
湿度
湿度是另一个导致明胶制剂中明胶交联的主要因素。对下列药物的研究突出了其有害的影响：氯霉素（23），吉非罗齐（47），苯妥英胶囊（51）以及扑热息痛明胶包衣片（31）。
推测湿度是通过以下途径起作用的：
l 间接地催化形成亚胺——所有交联反应的第一个中间体。
l 催化辅料的分解，分解产物可引起明胶交联。例如：玉米淀粉中偶尔含有微量的稳定剂六亚甲基四胺会在高湿条件下分解成氨和甲醛（38）。
l 影响精氨酸-精氨酸交联速度。
l 提供明胶变性的媒介。
温度
升高温度会使明胶交联的速度加快。Barrett和Fell发现在20℃和37℃保存SCTs不会影响其崩解时间，37℃保存14周除外。但是，50℃就会发生一个明显的变化（24）。贮藏5年的片剂其变化的形式与50℃保存的那些非常相似。Hakata等人报道了SGCs在大于等于40℃条件下贮藏后，崩解性显著降低（70-72）。在其它研究中，开发了一种模型系统，主要由含葡萄糖、蔗糖、果糖的明胶薄片和碳酸钙组成（30，73）。这些系统分别在70，80，90℃和110℃保存不同的时间。在这期间，所有明胶薄片的崩解度都显著下降。
光
光或UV-可见射线也会影响含明胶处方的溶出特性。Lengyel等人观察到当明胶暴露在电离幅射中和用作片剂和胶囊的粘合剂时，片剂的稳定性和胶囊的性质就会发生变化（74）。Murthy等人在一项对于含不同色素的双氢氯噻嗪和盐酸苯海拉明胶囊的研究中观察到UV-可见射线对明胶交联的影响（41）。他们发现强烈的UV或可见光照射促进胶囊的变化，特别是那些含FD&C3号红色素的胶囊。结果造成其体外溶出度下降。他们也观察到当同时存在高湿度时，光线的这种不良影响会加强。近来，Singh等人（33）报道了三种环境因素——温度、湿度和光——结合，具有更加显著的影响。这种更加不良的影响可在所有类型的含明胶制剂：SGCs，HGCs和SCTs的外层见到。
用导致明胶交联的加速法（stress method）来研究聚合作用的特性
为了研究聚合作用的特性，需要使制剂中的明胶交联，使用了一种加速法，即使用甲醛或环境因素如温度、湿度和光照（单独或结合使用）。试验的环境和持续时间列在表III和表IV中。FDA工业胶囊工作组织主要使用甲醛（46，48，56）。将不同浓度的甲醛填充至HGCs和SGCs中，将这些配方在加速条件下（温度40℃，湿度75%）放置，时间小于等于六个月（见表III）。表IV显示了用湿度、温度和光照单独或结合使用短期或稍长时期的加速试验。
表III 已报道的含明胶制剂中使用甲醛引起交联的例子
剂型和药物
甲醛含量
保存条件和时间
溶出度结果
参考文献
硬胶囊：
阿莫西林
乳糖中含18ppm
室温6个月，40℃和75%RH
明显降低
55
硬胶囊壳
乳糖中分别含0，20，120ppm
40℃和75%RH而后25℃和50%RH保存6周
明显降低
60
软胶囊：
扑热息痛和硝苯地平
0，20，80ppm
25℃和60%RH和40℃，75%RH208天
20ppm或更低的量尚可， 80ppm就明显降低
48
扑热息痛
乳糖中含20ppm
40℃，75% RH一天，而后室温6天
明显降低
56
表Ⅳ 文献报道的温度，湿度和光照对于含明胶处方制剂的溶出的影响
剂型和药物
温度（℃）
相对湿度（%）
紫外和可见光照射
时间
对溶出的影响
参考文献
糖衣片：
保泰松
20,37,50
——
——
2到14周
50℃储存14周后降低
24
丙戊酸
45
40
——
75
——
1，2和3个月
两个月和三个月的样品溶出显著降低
89
布洛芬
37
75
——
4周
显著降低
29
核黄素
45
——
——
——
显著降低
30
扑热息痛
室温
室温
——
高
——
——
7个月，
3，5和7个月
无变化
显著降低
31
硬胶囊：
氯霉素
25
49
66
80
——
32周
无变化
无变化
直到一小时都未释放
23
呋喃妥因
40
79

2和10周
10周的样品显著降低
90
吉非罗齐
37
37
45
——
80
——
——
——
——
1，2和3个月
——
一个月后显著降低
——
47
装入不同颜色胶囊中的疏水药物
——
80
80
80
环境光
荧光
紫外
2周
2周
2天
显著降低
显著降低
显著降低
41
装入透明胶囊中的疏水药物
——
80
环境光
荧光
4周
4周
无变化
无变化
41
依托度酸
40
75
——
8到20周
全部显著降低
42
Triamterene/氢氯噻嗪
40
85
——
4周
两种药都显著降低
86
水不溶性药物
40
75
——
正在进行稳定性研究
显著降低
58
扑热息痛
40
25
75
60
——
55天
52周
显著降低
显著降低
56
硬胶囊壳
81
37
——
12到14和21周
全部显著降低
60
软胶囊：
地高辛
5，25和37
——
——
1，3，6和10周
10周的样品显著降低
50
中链甘油
三酯
≥40
——
——
6个月
显著降低
71，72
扑热息痛和硝苯地平
25
40
60
75
——
2到26周
显著降低
显著降低
48
维生素
40
75
——
6到24个月
全部显著降低
54
扑热息痛
40
25
75
60

55天
52周
显著降低
显著降低
56
这些试验方法的一个主要缺点就是在观察到足够显著的不良结果前需要将温度和湿度加速条件持续很长时间。几个月的等待时间无疑是漫长的，特别是在开发配方和确定包装形式时必须要进行重复试验。因此，一种更好的令人更易接受的方法是持续时间短从而有机会进行重复试验的方法。
一种快速的试验方法
近来，Singh等人（33）提出了一种持续时间更短的试验方法，这种方法同时使用三种环境因素——温度、湿度和光，而不是仅用一种或两种因素（表IV）。将样品放置在光照培养箱中，温度40℃，湿度75%，照度为可见光2,000,000Lux h，紫外光大于200℃，仅8天就在所有含明胶处方的制剂外层形成了薄膜。与FDA-USP工业胶囊工作组织使用甲醛（46，48，56）不同，这一试验方法可以模仿产品在其生产、运输、销售和贮藏中暴露的环境。这一试验使用了ICH指南（其中规定了药物和药品加速稳定性试验）中推荐的条件（75）。
正如一个最近的研究报告所述，Venugopal和Singh（64）将这项试验适用范围扩展至可用于明胶原料的性能评价。这个试验的目的就是预先确定几种不同来源的明胶原料中的哪一种在用于生产时导致产品溶出度降低的可能性最小。由不同的原料制成的明胶片放在光照培养箱中，同时也放在不同浓度的甲醛溶液中。这两种加速法的试验结果是相同的。基于这些结果，有可能将不同来源的明胶原料按照它们发生交联的潜在程度的大小进行系统化。就是说，每一种原料都被标明当其用于产品配方中时，能够发生交联问题的程度。
用于检测明胶交联程度和特性的技术
没有几项技术可用于测定加速试验后的明胶片和配方或上市配方在其保存期内发生明胶交联的特性和程度。在本节中将一一描述这些技术。
C13 核磁共振（C13 NMR）
这一技术可用于研究交联发生的机理和部位（63，76-78）。这一技术检测与甲醛反应后赖氨酸-赖氨酸、赖氨酸-精氨酸、精氨酸-精氨酸交联中的氨基集团。Gold等人使用C13NMR确定了胰酶（一种存在于胃肠道中的蛋白水解酶）可使交联的明胶去极化（76）。
傅立叶变换近红外光谱（FT-NIR）
这一技术非常先进，因为其检测快速且对样品无破坏。Gold等人报道怎样用这一技术来监测甲醛从填充在SEGCs的明胶壳内的PEG中逸出（61，62）。将胶囊中填入含不同浓度甲醛的PEG溶液，室温放置48小时。然后倒出胶囊内容物，在NIR光谱仪上扫描胶囊壳，发现不同浓度甲醛产生的交联数量与其NIR光谱存在线性关系。
傅立叶变换红外光谱（FT-IR）
Salsa等人报道了使用FT-IR检测与甲醛反应后的明胶交联（79）。在甲醛水溶液与明胶反应的不同时间，其色谱图记录在溴化钾的小球中。对检验结果的解析涉及到对主要成份的回归分析。已确定交联反应的发生以羟甲基赖氨酸的形成开始，随后形成羟甲基精氨酸链，最后产生赖氨酸-精氨酸交联。
紫外和荧光色谱
Ofner等人报道了一种化学分析方法，使用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）试剂产生一个UV发色团，在346nm处有吸收（14，60，80，81）。TNBS与明胶的主要氨基集团的反应确定了未交联的氨基集团的量，从而揭示出ε-氨基集团的损失量，即沉淀于交联过程中的氨基集团。另一项近期研究报道了使用荧光检测描述与戊二醛（82）反应的明胶的构型变化。
核磁共振成像（MRI）
MRI方法用于研究明胶交联是最近由Rochest Institute of Technology的J.H.Hornak博士领导的一个小组开发的。（纽约，Rochest ）小组得出结论：此项技术可用于分析交联后明胶的构型和进入明胶-水骨架内部的离子扩散。
监测溶解性和溶出度
用于检测明胶交联的另外方法就是测定明胶片的溶解性和制剂的溶出度（64，83）。虽然这些测定并不能提供关于反应机理或反应部位的信息，也不能在分子水平上对交联程度定量，但是它们可以给出一个大略的交联程度大小的信息，因为溶解性或溶出度的减少与交联的程度呈线性关系（64）。也在使用一些间接的方法测定处于未溶解状态的明胶的量（如重量分析，蛋白质含量测定：包括与BCA发生显色反应，然后在214nm处测UV吸收度。）（60，83）
抑制明胶交联的途径
在保护处方中含明胶的制剂使其在溶出性质上不发生变化方面进行了大量的努力。达到这一目的有许多方法，如使用添加剂和直接使用抑制剂（见表V）和控制湿度和光照（photostabilization）。
表Ⅴ 抑制明胶交联的试剂
抑制剂
制剂
观察到的结果
参考文献
盐酸半咔唑，盐酸羟胺，吡啶，哌啶，甘油，对氨基苯甲酸
未说明
交联抑制剂
85
山梨醇作为增塑剂
明胶薄片
（B型胶）
溶出度增加
91
盐酸半咔唑（1%）
L-组氨酸（1%）
柠檬酸（1%）

减少交联
减少交联
减少交联

氨基乙酸（2.5%w/w）
配方
溶出度有改善，但不能阻止明胶交联
86
柠檬酸（0.5%w/w）

溶出度有改善，但不能阻止明胶交联

氨基乙酸（2.5%w/w）和
柠檬酸（0.5%w/w）

阻止明胶交联

使用B型胶
有文献指出B型胶比A型胶少交联，但不幸的是未见详细的研究报道（84）。因此可以做一些试验来进行使用B型胶开发更加稳定的药物处方的评价（84）。
采取保护措施阻止醛类释放或阻止醛类形成
化合物如赖氨酸、苯胺、谷氨酰胺（glutamine），盐酸羟胺