学术讨论—第四章--肠道菌群的.ppt

第四章 肠道菌群的检验(JINYN)大肠菌群大肠菌群 Enumeration of Coliforms粪大肠菌群粪大肠菌群Enumeration of Faecal Coliforms大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)Enumeration of Escherichia coli第一页，共五十二页。一大群居住在人和动物肠道中生物学性状近似的革兰阴性(ynxng)杆菌属于(shy)肠杆菌科多数(dush)是肠道的正常菌群，至少有30个菌属，120个以上的菌种少数为致病菌，是胃肠传染病的最重要病原菌肠道杆菌肠道杆菌(ENTERIC BACILLI)第二页，共五十二页。乳糖发酵(fjio)试验共同共同(gngtng)特性特性1、相似的形态、相似的形态(xngti)染色染色2、简单的培养条件、简单的培养条件3、活泼的生化反应、活泼的生化反应重要试验初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌肠道致病菌肠道非致病菌多数不发酵不发酵乳糖多数发酵发酵乳糖第三页，共五十二页。5、抵抗力、抵抗力不强6、易变异、易变异(biny)溶源性转换(zhunhun)生化(shnhu)反应性变异通过引起耐药性变异毒力性变异转导接合4、抗原构造复杂、抗原构造复杂第四页，共五十二页。肠道杆菌(GNJN)生物特征1形态与结构：中小等大小两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，无芽胞，多数有鞭毛，大多有菌毛，少数有荚膜或包膜。2培养特性：需氧或兼性厌氧菌，在普通培养基和麦康凯培养基上生长良好，为中等大小的光滑型菌落。有些菌在血琼平板上出现型溶血，在液体培养中呈均匀混浊生长。3生化反应(fnyng)：发酵葡萄糖，氧化酶阴性。生化反应活泼，一般说来，生化反应的强弱与其致病作用成反比。第五页，共五十二页。肠道杆菌(GNJN)流行病学抵抗力：不强，加热60经30分钟即死亡。不耐干燥,胆盐、煌绿等对大肠杆菌等非致病菌有选择性作用(zuyng)，可制备肠道杆菌选择性培养基以分离肠道致病菌。对一般化学消毒剂如漂白粉,酚,甲醛均敏感,对低温有耐受力.临床意义:肠杆菌科细菌可致化脓性疾病,肺炎,脑膜炎,败血症以及伤口,泌尿道和肠道的感染,本科细菌占临床分离细菌总数的50%和临床分离的革兰氏阴性菌总数的80%,将近50%的败血症,70%以上的泌尿道感染是由肠杆科细菌引起.传播方式：污染的饮水及食物、经消化道传播。第六页，共五十二页。肠杆菌科中与卫生医学有关(YUGUN)的细菌 第七页，共五十二页。第八页，共五十二页。大肠菌群为革兰氏阴性菌第九页，共五十二页。一、大肠菌群检验(JINYN)第一法第一法 大肠菌群大肠菌群MPN法法第二法第二法 大肠菌群平板计数大肠菌群平板计数(j sh)(j sh)快速法快速法 大肠菌群大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法测试纸片法第十页，共五十二页。MPN最大或然数（最大或然数（most probable number，MPN）计数又称稀释培养计）计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群殊生理功能的类群其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化化(xio hu)(xio hu)、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。）的数量、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放。放。第十一页，共五十二页。MPN法的原理法的原理(YU(YUNLNL)第十二页，共五十二页。MPN法的局限性法的局限性相同相同(XI(XIN TN TN)N)MPN值，但含义不同值，但含义不同MPN值为90时，有四种不同(btn)情况的阳性管数。阳性管数为“0-0-0”“0-1-2”对应的最大概率（Pmax）极小，此时的MPN值90MPN/100ml(g）无意义，所以在FDA细菌学手册中，已删除了这两种情况。第十三页，共五十二页。MPN法的局限性法的局限性相同相同(XI(XIN TN TN)N)MPN值，但含义不同值，但含义不同阳性管数为“0-3-0”对应的最大概率（Pmax）为0.00417%，而国标中并没有列出相应的95%置信区间，是考虑到该置信区间过广，已没有很大的指导意义。阳性管数为“2-0-0”的最大概率（Pmax)为31.91613%，表明实际(shj)的菌落数在10360cfu/100ml(g）之间。所以，测定MPN值时，要考虑阳性管数。相同的MPN值，代表的实际菌落数范围却有很大的差别。假如你的产品标准为100MPN/100g，实测值为90MPN/100g（阳性管数“0-3-0”），那么很难判定你的产品是否合格。第十四页，共五十二页。MPN值的准确度随值的准确度随PMAX的减小而减小的减小而减小不同MPN值对应的Pmax值不同，且随着Pmax值的减小，MPN值的准确度也明显下降，所以在FDA细菌学手册中已删除(shnch)了极低Pmax值（0.004%）的情况，因为这些Pmax值对应的MPN值没有实际的指导意义。第十五页，共五十二页。MPN法检测法检测(JI(JIN CN C)的隐性成本的隐性成本产品的大肠菌群标准为30MPN/100g，而某个样品的检测结果为90MPN/100g，那么你可能(knng)会认为你的产品不合格。但是，让我们看一下90MPN/100g的置信区间，为10360cfu/100g，也就是说有部分结果为90MPN/100g的产品，且实际菌落数在1030cfu/100g之间，会被当作不合格产品处理。30MPN/100g的置信区间为590cfu/100g（阳性管数0-0-1）或5130cfu/100g（阳性管数0-1-0）。也就是说部分实际菌落数为30130cfu/100g的产品，会被当作合格产品，从而微生物风险增加。第十六页，共五十二页。大肠菌群大肠菌群系指一群在36能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此(y c)作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。第十七页，共五十二页。第一(DY)法大肠菌群计数MPN法第十八页，共五十二页。抑菌剂的选择抑菌剂的选择(XU(XUNZ)NZ)大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基(wn j)硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。第十九页，共五十二页。检样稀释检样稀释(X(XSH)SH)以无菌操作将检样25ml(或25g)放于含有225ml灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1：10的均匀稀释液。调pH为6.57.5。用1ml灭菌吸管吸取1：10稀轻液1m1注入含有9ml灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀作1：10的稀释液。另取1m1灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用 1支1m1灭菌吸管：根据食品卫生标准要求或对检样污染情况(qngkung)的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。第二十页，共五十二页。初发酵初发酵(F(F JIO)JIO)试验试验在乳糖发酵过程中，观察产气和产酸两个现象。将待检样品接种于LST发酵管内(un ni)，接种量在1ml以上者，用双料LST发酵管；1m1及1m1以下者，用单料LST发酵管，每一稀释度接种3管，置361温箱内，培养242小时，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，进行分离和鉴定。第二十一页，共五十二页。第二十二页，共五十二页。LST结果结果(JI(JI GU GU)判断判断大肠菌群的产气量，多者可以大肠菌群的产气量，多者可以(ky)(ky)使发酵倒管全使发酵倒管全部充满气体，少者可以部充满气体，少者可以(ky)(ky)产生比小米粒还小的产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以问时，可以(ky)(ky)用手轻轻打动试管。用手轻轻打动试管。第二十三页，共五十二页。复发酵复发酵(F(F JI JIO)O)第二十四页，共五十二页。大肠菌群最大可能(KNNG)数检索表第二十五页，共五十二页。其它其它(QT(QT)全部为0，报告为 最低检出线如样品中大肠菌群较少，可加大接种(jizhng)量，采取双料发酵管第二十六页，共五十二页。大肠菌群计数大肠菌群计数(J SH)(J SH)第二第二法法直接计数法直接计数法CFU通过通过(tnggu)数据数据直接直接求数求数学期学期望望第二十七页，共五十二页。倾注倾注(Q(QNGZH)NGZH)培养培养根据标准(biozhn)要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46结晶紫中性红胆盐琼脂培养基（VRBA平板）注入平皿约1520mL，并转动平皿，混合均匀。同时将1mL稀释液（不含样品）作空白对照。待琼脂凝固后，倒入34mL VRBA培养基铺面，培养基凝固后翻转平板，置361温箱内培养1824h。第二十八页，共五十二页。平板(PNGBN)菌落数的选择选取菌落数在15150之间的平板，分别计数典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围(zhuwi)有红色的胆盐沉淀环，菌落直径约为0.5mm。第二十九页，共五十二页。从VRBA平板上挑取10个不同(b tn)类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，361培养24h48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。证实(ZHNGSH)试验第三十页，共五十二页。大肠菌群平板(PNGBN)计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中(qzhng)10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。第三十一页，共五十二页。第三十二页，共五十二页。其他方法其他方法 大肠大肠(D(DCHCHNG)NG)菌群菌群PETRIFILMTM测试纸片法测试纸片法第三十三页，共五十二页。第三十四页，共五十二页。第三十五页，共五十二页。第三十六页，共五十二页。第三十七页，共五十二页。二、粪大肠菌群(FAECAL COLIFORM)定义：一群能在44.5,24-48h内发酵乳糖,产酸产气的需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢(y bo)杆菌检测意义：粪大肠菌群的来源是人和温血动物粪便，作为粪便污染的指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。比大肠菌群更加直接。第三十八页，共五十二页。粪大肠菌群(FAECAL COLIFORM)的测定(CDNG)GB4789.39-2013第三十九页，共五十二页。三、大肠杆菌(D CHN N JN)（E.coli）细菌域细菌域(Bacteria)、变形菌门、变形菌门(Proteobacteria)、-变形菌变形菌纲纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌、肠杆菌(gnjn)(gnjn)目目(Enterobacteriales)、肠杆菌科、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属埃希氏菌属(Escherichia)、大肠杆菌种、大肠杆菌种(E.coli)。它是一种普通的原核生物，是人类和大多数温血动物它是一种普通的原核生物，是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻，根据不同的生物学特性将致病引起不同症状的腹泻，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒、肠产毒性大肠杆菌性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血、肠出血性大肠杆菌性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。第四十页，共五十二页。大肠杆菌(D CHN N JN)（Escherichia coli，E.coli）定义：广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为或的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价(pngji)食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。IMViC生化试验：细菌的生化反应吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）、枸橼酸盐利用（C）四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。用于鉴别形态、革兰染色反应和培养特性相同或相似的细菌。第四十一页，共五十二页。大肠杆菌大肠杆菌(D(D CH CHN N N JN JN)N)G-短杆菌，大小短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。兼性厌氧菌。芽孢。兼性厌氧菌。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身(zhngshn)(zhngshn)相相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。第四十二页，共五十二页。大肠杆菌(D CHN N JN)测定EMB选择性分离鉴别EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色(ls)的金属光泽；该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。菌名菌落形态大肠埃希氏菌 紫黑色，有绿色金属光泽肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深阴沟肠杆菌粉色，中心色深弗氏志贺氏菌无色鼠伤寒沙门氏菌 无色粪链球菌无色第四十三页，共五十二页。大肠杆菌(D CHN N JN)的MPN计数法（GB4789.38-2012）第四十四页，共五十二页。大肠杆菌(D CHN N JN)在EMB平板第四十五页，共五十二页。大肠(DCHNG)埃希氏菌与非大肠(DCHNG)埃希氏菌的生化鉴别第四十六页，共五十二页。大肠埃希氏菌平板计数法检验(JINYN)程序（第二法）第四十七页，共五十二页。倾注(QNGZH)平板选取选取2个个3个适宜的连续稀释个适宜的连续稀释(xsh)(xsh)度的样品匀液，每个稀释度的样品匀液，每个稀释(xsh)(xsh)度接种度接种2个无菌平皿，每皿个无菌平皿，每皿1 mL。同时取。同时取1 mL稀释液稀释液加入无菌平皿做空白对照。加入无菌平皿做空白对照。将将10mL15mL冷至冷至450.5的结晶紫中性红胆盐琼的结晶紫中性红胆盐琼脂（脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL4 mL结晶紫中性红胆盐结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮）（甲基伞形酮）（VRBA-MUG）覆覆盖平板表层。凝固后翻转平板，盖平板表层。凝固后翻转平板，361培养培养18 h24 h。第四十八页，共五十二页。平板菌落(JNLU)数的选择选择菌落数在10CFU100CFU之间的平板，暗室中360nm366nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC25922）和产气肠杆菌(gnjn)（如ATCC13048）做阳性和阴性对照。第四十九页，共五十二页。大肠埃希氏菌平板计数(J SH)的报告两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g(mL)表示(biosh)。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。第五十页，共五十二页。第五十一页，共五十二页。内容(nirng)总结第四章 肠道菌群的检验。大肠菌群计数第二法直接计数法。大肠杆菌(d chn n jn)（Escherichia coli，E.coli）。大肠杆菌(d chn n jn)测定EMB选择性分离鉴别。EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长。将10mL15mL冷至450.5的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。大肠埃希氏菌平板计数的报告第五十二页，共五十二页。