缺血再灌注损伤的保护作用doc.docx

成绩：

山东大学医学院
机能学实验设计

题 目: 毒蕈碱对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

设计者：李彩娥 20052303035 李德全 20052303037
李 帅 20052303044 林冰钦 20052303053

专 业： 临床医学（七年制）

班 级： 2005级三班

联系方式：李彩娥

2008-5-30
立题依据（主要说明本研究的目的、意义、国内外研究现状及主要参考文献）
目的
在大鼠急性心肌缺血模型的基础上，观察M受体激动剂毒蕈碱对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其可能作用机制。
意义及研究现状
M受体存在于多种器官组织，目前已克隆出5个亚型： M1,M2,M0,M4及M5，其中M2，M4已证实存在于主要组织中。以往认为M2受体是新机上唯一有功能的乙酰胆碱受体亚型，今年来发现，心肌上还存在其他多种M受体亚型。其中M3受体倍受关注。1989年Mutschler等在狗心房组织匀浆中发现了M受体的mRNA有高表达。王志国通过全细胞膜片钳技术证明M受体也存在于心肌中，并研究了M受体激动剂胆碱（choline）对离体心肌细胞生理机能的影响及分子作用机制。
近年，M受体在心脏的生理作用已得到证实：M受体激动剂胆碱通过激动心脏M3受体产生负性肌力和负性频率作用。
心肌缺血时，交感神经系统呈激活状态，使心肌收缩力增强、耗氧量增多，血氧供需失衡加重。此时，若激动M受体，则可诱发一种延迟整流钾电流（Ikm3），使心率减慢、心肌收缩力减弱从而对抗交感神经过度兴奋，减少心肌耗氧量，对缺血心肌产生保护作用，故心肌M3受体成为抗心肌缺血性损伤药物作用的新靶点。M3受体激动剂毒蕈碱（muscarine）能激活心肌M3受体，诱发Ikm3，呈剂量依赖性调节心肌细胞电生理特性，即降低窦性节律、缩短动作电位时程、膜电位超极化，进而产生负性肌力作用和负性频率作用。因而推测，毒蕈碱可通过激动心肌M3受体对缺血心肌产生保护作用。
在第十五届世界药理学大会上，我国著名药理学家、哈尔滨医科大学校长杨宝峰教授做了有关心血管药物作用新靶点的研究报告，介绍了他领导的课题组在相关领域所取得的进展，引起与会者浓厚的兴趣。
杨宝峰教授的课题组利用膜片钳、基因钳、激光共聚焦及分子生物学技术等，清晰地阐述了M3受体的生理功能，并全面系统地揭示了乙酰胆碱受体的各个亚型在心脏的组织分布和细胞分布特点，他们通过实验首次发现M3受体亚型耦联的一种新的延迟整流性钾电流（IKM3）具有多种生理功能，与心律失常、心肌缺血损伤、心肌细胞凋亡等病理过程密切相关，可以作为有关药物的作用靶点，为筛选心血管病新药提供了新的途径。
本实验在总结其他M受体激动剂对心肌保护作用的基础上，通过检测冠状动脉复流量，MDA和SOD表达水平以及心肌坏死区范围大小，并与M3受体阻断药相对照，观察毒蕈碱通过激动M3受体对心肌产生的保护作用，并推测其可能机制。

参考资料
（1）李丹露，刘艳，王丽艳，单宏丽，吕延杰，杨宝峰。 M3受体激动剂毛果芸香碱对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 中国药学杂志 2007 October，Vol.42 No.19
（2）Kawamura M,S-sh/geⅣ,Imayoshi K.et a1.Enzyme/mmunoassayto detect antitubeiculous glycolipid antigen(anti-TBGL antigen)antibodies in senlgnfor in diagnosi-of tubeifulosi, J Clin lab Anal,1997.Ⅱ(3):140-145
（3）刘艳，王明，马满玲，张妍，李厚伟，陈庆文，杨宝峰 M3受体激动剂对大鼠和家兔心脏血流动力学的影响 药学学报 Acta Pharmachceuda Sinica 2001.36(2):84-87
（4）YUE P,ZHANG Y,DU Z M,el al.Ischemia impairs the association between conexin43 and M3 subtype of acetyleholine muscarinic recepter(M3-mAChR) in ventricular myocyte ［J］. Cell Physiol Biochem,2006.17:129-136.
⑸ XU S Y,BIAN R L,CHEN X. The Methodology of Pharmocology Experiment (药理学实验方法学)［M］.3rd ed Beijing:People Medical Publishing House,2002:986-1042.

实验材料(包括动物品种、规格、数量和来源；药品名称、规格和来源、主要仪器设备等)：
动物
健康Wistar大鼠，280～320g，清洁级，10-12周龄，32只（山东大学医学院实验动物中心）
药品和试剂
毒蕈碱(Sigma公司); 4-diphenylacetoxy-N—methylpiperidine．methiodide(4-DAMP, Sigma公司)；
戊巴比妥钠(pentobarbital，中国上试试剂二厂)；
肝素钠（heparin，中国上海第一生化药业公司制品厂）；K-H液（mmol/L:NaCl 118.5,KCl 2.5,NaCO3 25.0.KH2PO4 1.2,MgSO4.7H2O 1.2,Glucose 1.1,灌流液的PH为7.4）（实验室自配）；
丙二醛（MDA）和超氧化物岐化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；红四氮唑（red tetrazoline）（中国华东师范大学化工厂）；冰生理盐水（山东大学机能学实验室提供）
主要仪器
Langendoff灌流装置(埃德仪器国际贸易（上海）有限公司) ；
数控恒温浴锅（上海申胜生物技术有限公司）；DY89-1型电动玻璃匀浆机（宁波新芝科技股份有限公司）；
2100型&UV-2100型分光光度仪（尤尼柯（上海）仪器有限公司）；
小量筒8支（山东大学机能学实验室提供）。

试验方法（详细写明实验步骤，尤其是动物分组、给药途径和计量、观察指标、统计学处理方法及注意事项等）。
试验方法及步骤
1.实验动物分组
将32只大鼠分别称重，并进行随机分组，结果如下
序列号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
体重/g

随机数
03
28
28
29
08
73
37
32
04
05
69
30
16
09
05
88
除数
4
3
2
1
4
3
2
1
4
3
2
1
4
3
2
1
余数
3
1
2
1
4
1
1
1
4
2
1
1
4
3
1
1
组号
3
1
2
4
4
1
2
3
4
2
1
3
4
3
1
2

序列号
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
体重/g

随机数
69
58
28
99
35
07
44
75
47
21
99
21
81
69
22
93
除数
4
3
2
1
4
3
2
1
4
3
2
1
4
3
2
1
余数
1
1
2
1
3
1
2
1
3
3
1
1
1
3
2
1
组号
1
2
3
4
3
1
2
4
3
4
1
2
1
3
2
4
一组：空白对照组（Normal组 二组：单纯缺血再灌注组（MIRI组）
三组：毒蕈碱组（muscarine组） 四组：4-DAMP+毒蕈碱组（4-DMP+musarine组）
2.缺血再灌注损伤模型的制备
大鼠以1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉，经舌下静脉肝素化(500U/kg)，10min后固定在手术台上，剪去大鼠胸前手术区毛，分层剪开皮肤、皮下组织、胸前肌肉及筋膜3～4cm，于左侧第四肋间，用血管钳钝性分离肋间肌3cm长，沿胸骨左缘0.5厘米剪断第2～4肋骨，打开胸腔，剪破心包，小心快速分离心脏，在主动脉距其起始部4～5mm处迅速将主动脉和其他血管一并剪断，立即置于盛有4℃冷K-H液的培养皿中，洗净残血，在液面下找出动脉断端，迅速套入主动脉套管并固定（开胸、取心脏及插管一系列过程须在两分钟之内完成）。立即灌注通有95％02和5％CO2混合气体的K-H液。剪去心脏周围附着的组织，并于肺动脉起始部与右室圆锥部之间剪一小口，使冠脉回流液流出，维持灌注液高度在75cm左右，灌流液温度保持在37℃。稳定灌流10min后，①一组，正常K-H液连续灌流65min；②二组，正常K-H液灌流10min，然后全心停灌25min，再灌30min；③三组，用含有5umol/L毒蕈碱的K-H液灌流，余同②；④四组，用含有3nmol/L4-DAMP和5umol/L毒蕈碱的K-H液灌流，余同②。
3.观察指标
①冠脉流量的测定
分别将停灌前、复灌后1，5，10，l5，20，25，30min等8个时间点的冠脉流出液用量筒收集并测量其体积。以mL/min表示。将结果记入表格。
②心肌MDA含量和SOD活性的测定灌流
灌流结束后，每组一半心脏立即剪下左室，用冰生理盐水制10%心肌匀浆，用于测定心肌MDA含量和SOD活性。MDA采用硫代巴比妥酸法测定，SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定。
③心肌梗死范围的测定
灌流结束后，每组另一半心肌立即剪下左室，每隔2mm将心肌横切成片，用滤纸吸去表面水分，放入1%红四氮唑磷酸缓冲液（PH7.4）37℃染色15min。梗死心肌细胞中的脱氢酶因细胞膜损伤而完全释放丢失，因而梗死心肌不被染色；正常心肌细胞含有脱氢酶，可被染成红色。剪下梗死心肌称取质量，以梗死心肌占左室质量的百分比表示梗死范围。
统计学处理
所有数据均以x±s表示，组间采用t检验比较。采用SPSS10．0统计软件包进行统计学处理。
注意事项
⑴ 动物不能麻醉过深，以防发生死亡。
⑵ 始终维持灌注液高度在75cm左右，以保证有足够的K-H液流入冠脉，同时使心脏负荷不至于过重。
⑶ 随时滴加K-H液于心脏表面，使之保持湿润。
⑷ 肺动脉起始部与右室圆锥部之间剪的小口口径须大小一致。
⑸ 主动脉套管应始终保持竖直。
⑹ 开胸取心脏操作过程尽量迅速，以减少由操作误差而致的大鼠心脏的缺血性损伤。
⑺ 灌流结束后，应立即剪下左心室，每组分两份左心肌匀浆和心肌切片染色。
预期结果与分析
预期结果
1.冠脉复流量的变化

稳流
末
缺血
前
复灌后5min
复灌后15min
复灌后20min
复灌后25min
复灌后30min
Nor
MIRI
Mus
4-DAMP+Mus

① 各实验组的冠脉复流量随时间的演唱均称逐渐下降的趋势，其中空白对照组复流量高于各缺血再灌注组相对应是假的复流量。
② 单纯缺血再灌注的冠脉复流量随复灌时间的延长而显著下降，与空白对照组相比均有显著性差异。
③ 毒蕈碱组各时间点的冠脉复流量应明显高于相对应时间点的单纯缺血再灌注组，其中5min和10min时的冠脉复流量差别应最为明显，相差至少1.5ml/min。
④ 4-DAMP+毒蕈碱组（4-DAMP+muscarine组）各时间点的冠脉复流量应明显低于相对应的毒蕈碱组，而与单纯缺血再灌注相比则没有明显差别。
2.MDA含量和SOD活性

MDA umol/g
SOD U.mg
Nor

MIRI

Mus

4-DAMP+Mus

① 单纯缺血再灌注组相对于空白对照组MDA含量升高，而SOD活性降低。
② 毒蕈碱组与单纯缺血再灌注组MDA含量降低，而SOD活性升高。M3受体选择性拮抗剂4-DAMP使其作用消失。
3.心肌梗死范围
组数
梗死面积 （%）
MIRI

Mus

4-DAMP+Mus

毒蕈碱组心肌梗死面积与单纯缺血再灌注组相比下降，而4-DAMP可阻断其作用
结果分析
1.心肌缺血再灌注后，由于心肌细胞肿胀所致的对冠状动脉的压迫作用，血管内皮细胞的肿胀，以及各种血管收缩因子的作用，使得冠状动脉收缩，使其发生无复流现象，导致低灌和冠脉流量减少等现象。心肌缺血再灌注后冠状动脉的复流量可间接反映心肌受损的程度。毒蕈碱通过激动心肌M受体来改善冠脉流量、纠正心肌缺血状态。应用毒蕈碱后，则冠脉流量明显增加；预先给予4-DAMP阻断M3受体则毒蕈碱的作用受抑。
2.当组织细胞缺血缺氧时，氧自由基清除系统功能降低或丧失，而氧自由基生成系统活性增加，氧自由基大量产生与急剧堆积，引起心肌组织严重损伤；该损伤程度可通过心肌MDA含量变化和SOD活性变化间接评定，毒蕈碱通过激动心肌M3受体来抑制脂质过氧化过程、提高内源性抗过氧化酶活性，减轻氧自由基对心肌的损伤。这一作用可由激动心肌M3受体对心肌缺血诱导的氧化应激有保护作用的研究推测而知。因此运用毒蕈碱后，心肌MDA含量降低、SOD活性提高；预先给予4-DAMP阻断M3受体则毒蕈碱的作用受抑。
3.心肌缺血缺氧发生过程中，心肌细胞既出现坏死，同时又通过能量代谢障碍、氧应激和钙超载等机制发生凋亡。凋亡和坏死一起，参与缺血再灌注后心肌细胞的丧失。心肌细胞丧失决定心肌梗死面积的大小，而后者又间接反映心肌损伤的程度。毒蕈碱通过激动心肌M3受体来减轻心肌缺血再灌注损伤。这一作用可由激动心肌M3受体对心肌缺血诱导的心肌细胞凋亡有保护作用的研究推知。毒蕈碱可缩小心肌缺血再灌注时心肌梗死的面积，该作用可被4-DAMP阻断。
预期结论
M受体激动剂毒蕈碱通过激动心肌M3受体对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤产生保护作用。这不仅可以揭示毒蕈碱新的药理特性和作用，而且可以进一步激动心肌M3受体对离体缺血心肌的保护作用，可为研发防治心肌缺血再灌注损伤的药物提供新的思路。

教师评语

内容总结

9
医 学 院 机 能 学 实 验 设 计