DB15∕T 2993-2023 首蓿中阿维菌素残留量的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 04 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 29932023 苜蓿中阿维菌素残留量的测定 高效液相色谱法 Determination of avermectin residue in alfalfa-high-performance liquid chromatography 2023-05-11 发布 2023-06-11 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 29932023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古自治区农畜产品质量安全中心、锡林郭勒盟农牧业科学研究所、阿拉善盟农畜产品质量安全中心、咸阳市动物疫病预防控制中心、鄂尔多斯农牧技术推广中心、内蒙古农业大学。本文件主要起草人：王文曦、吴洪新、云颖、康博洋、盈盈、刘宇宁、湖日尔、张燕东、贾红勋、斯琴高娃、李润航、朝鲁孟、刘江英、邱鹏程、刘洪林、王志军、卫媛、降晓伟、赵志惠、李坤娜、李薇、付慧。DB15/T 29932023 1 苜蓿中阿维菌素残留量的测定高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了苜蓿中阿维菌素残留量的高效液相色谱的测定方法。本文件适用于苜蓿中阿维菌素残留量的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T 20195 动物饲料试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 试样中阿维菌素残留物经过乙腈提取，提取液经过滤浓缩后，用SPE氨基柱净化，洗脱液经浓缩后，用配有紫外检测器的高效液相色谱仪测定，外标法定量。5 试剂和材料 乙腈（CH3CN）：色谱纯。二氯甲烷（CH2Cl2）。甲醇（CH3OH）：色谱纯。氯化钠（NaCl）。甲醇+水溶液（9+1，v/v）：量取 9.0 mL 甲醇，加入水 1.0 mL，混匀。甲醇+二氯甲烷溶液（5+95，v/v）：量取 5.0 mL 甲醇，加入二氯甲烷 95.0 mL，混匀。阿维菌素标准品：阿维菌素（C48H72O14）纯度不小于 95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。阿维菌素标准储备液（1.0 mg/mL）；准确称取适量的阿维菌素标准物质，用甲醇溶解并配制成（1.0 mg/mL）的标准储备液，保存于-18 冰箱内，有效期 6 个月。阿维菌素标准使用液(10.0 g/mL)：准确吸取 0.10 mL 阿维菌素的标准储备液至 10.0 mL 棕色容量瓶内，用甲醇稀释定容至刻度，配制成 10.0 g/mL 的标准使用溶液，于-18 冰箱内避光保存，有效期 1 个月。DB15/T 29932023 2 阿维菌素标准系列工作液：分别吸取浓度为 10.0 g/mL 阿维菌素标准液 0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL 于 10 mL 容量瓶，用甲醇+水（5.5）定容至刻度，该标准系列阿维菌素浓度分别为 0.05 g/mL、0.10 g/mL、0.15 g/mL、0.20 g/mL、0.25 g/mL，现用现配。固相萃取柱：NH2，500 mg/6 mL（使用前活化）。微孔过滤膜：0.45 m 有机相。水为 GB/T 6682 规定的一级水。6 仪器和设备 高效液相色谱仪：配有紫外检测器（或二极管阵列检测器）。分析天平：感量 0.01 mg 和 0.01 g。高速匀浆机：转速10 000 r/min。涡旋混合器。氮吹仪。粉碎机。样品筛：筛孔尺寸 1.0 mm。水浴锅（可控温）。7 试样制备 按照GB/T 14699.1中有关规定采集样品，去杂质后充分混匀，按照GB/T 20195有关规定制备试样，利用四分法取样后，充分研磨，过1.0 mm筛，为草粉样，新鲜样品利用四分法取样后，充分破碎作为新鲜分析样品备用。将处理好的试样放置-18 冰箱保存。8 测定步骤 提取 称取新鲜试样25 g（精确至0.01 g）或草粉试样2 g（精确至0.01 g）于100 mL的玻璃烧杯中，加入50.0 mL的乙腈（5.1），在匀浆机中高速匀浆2 min后用滤纸过滤，滤液收集到装有5 g7 g氯化钠（5.4）的100 mL具塞量筒中，收集滤液40 mL50 mL，盖上塞子，剧烈震荡1 min，在室温下静置30 min，使乙腈相和水相分层。净化 从具塞量筒中吸取10.0 mL乙腈溶液，放入150 mL烧杯中，将烧杯放在70 水浴上加热，杯内缓缓通入氮气，蒸发至近干，加入2 mL的甲醇+二氯甲烷（5.6）溶解残渣，待净化。将氨基柱（5.11）用4 mL甲醇+二氯甲烷（5.6）活化柱子，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即加入上述待净化液体，用10 mL离心管收集洗脱液，用2 mL的甲醇+二氯甲烷（5.6）洗烧杯后过柱，并重复一次。将离心管置于氮吹仪上，50 条件下氮吹至尽干，用5.00 mL甲醇-水（5.5）溶解、涡旋混匀，过0.45 m微孔过滤膜，待测。测定 8.3.1 液相色谱条件 DB15/T 29932023 3 具体参考条件如下：a)色谱柱：C18型柱，长 150 mm，内径 4.6 mm，粒径 5.0 m 或等效的色谱柱；b)流动相：A:甲醇（5.3）+B:水=90+10（v/v）；c)流速：1.0 mL/min；d)进样量：10.0 L；e)柱温：40；f)检测波长：245 nm。8.3.2 标准曲线的制定 按照8.3.1测定条件，将标准工作液（5.10）注入高效液相色谱仪中进行测试。测定相应的峰面积，以标准工作液（5.10）的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。8.3.3 试样溶液的测定 按照8.3.1测定条件，将待测样品溶液注入高效液相色谱仪中进行测试。待测样品溶液中目标物质的响应值应在仪器线性范围内，否则应适当稀释。标准工作液与待测样品溶液等体积进样。根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对试样溶液的色谱峰根据保留时间进行定性，外标法定量。阿维菌素标准溶液色谱图参见附录A中图A.1。平行实验 按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。空白实验 除不称取试样外，均按上述分析步骤进行。9 结果计算和表示 试样中阿维菌素含量X按式（1）计算：X=(0)V(1)式中：X 试样中阿维菌素残留量的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C 待测试样中阿维菌素残留量的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；C0 试剂空白中阿维菌素残留量的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；V 试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；M 试样的称样量，单位为克（g）。结果用2次平行测定结果的算术平均值表示，保留两位有效数字。10 精密度和定量限 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算数平均值10%。定量限 DB15/T 29932023 4 本文件阿维菌素残留量的定量限为0.060 mg/kg。11 回收率 苜蓿样品中添加阿维菌素的浓度和回收率的实验数据：在 0.060 mg/kg 时，回收率为 79.5%；在 0.12 mg/kg 时，回收率为 83.1%；在 0.60 mg/kg 时，回收率为 87.4%。DB15/T 29932023 5 A A 附录A （资料性）阿维菌素标准溶液液相高效色谱图 高效液相色谱法测定阿维菌素标准溶液典型色谱图见图A.1。图A.1 高效液相色谱法测定阿维菌素标准溶液典型色谱图