吴琼03基因与研究方法.pptx

基因类别基因类别结构基因结构基因 包括编码结构蛋白和酶蛋白的基因，包括编码结构蛋白和酶蛋白的基因，也包括编码阻遏蛋白和激活蛋白的基因。也包括编码阻遏蛋白和激活蛋白的基因。调控基因调控基因 包括调节基因、启动基因和操纵基因。包括调节基因、启动基因和操纵基因。Operon:rDNA,tDNA思考思考操纵子操纵子（operon）？）？操纵基因操纵基因（operator）？）？调节基因调节基因（regulatory gene）？）？操纵子操纵子J.Monod与与F.Jacob断裂基因（断裂基因（Splite Gene）70年代由年代由R.J.Roberts和和P.A.Sharp首先报道。首先报道。10S 珠蛋白前体珠蛋白前体RNA以及其以及其15S 珠蛋白珠蛋白mRNA与小鼠与小鼠 珠蛋白基因杂交形成珠蛋白基因杂交形成R环的电镜图环的电镜图Intron，Extron卵清蛋白基因及其与卵清蛋白基因及其与mRNA或或cDNA的杂交图的杂交图1978年，年，Gilbert提出内含子、外显子概念。提出内含子、外显子概念。mRNA剪切剪切插入序列的生物学功能插入序列的生物学功能1 在在mRNA加工中改变拼接方式或途径可加工中改变拼接方式或途径可以增加基因片断的利用，使以增加基因片断的利用，使DNA信息储信息储藏量增加藏量增加。2 内含子的存在可能内含子的存在可能有利于进化有利于进化过程。过程。3 控制控制RNA拼接系统可以拼接系统可以调控基因调控基因的表达。的表达。4 内含子的内含子的相对性相对性。肌球蛋白轻链肌球蛋白轻链LC1与与LC3基因基因TATA TATA AATAAA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 转录 加工 1 4 5 6 7 8 9 polyA LC1mRNA LC3mRNA 2 3 5 6 7 8 9 酵母细胞色素酵母细胞色素b基因的内含子基因的内含子2参与编码成熟酶，成熟参与编码成熟酶，成熟酶又反过来参与内含子酶又反过来参与内含子2的剪接，产生成熟的的剪接，产生成熟的mRNA内含子编码内切酶内含子编码内切酶插入序列与间隔区插入序列与间隔区插入序列插入序列内含子内含子间隔区间隔区转录间隔区转录间隔区非转录间隔区非转录间隔区剪切的思考剪切的思考Crick1978年提出的几个问题年提出的几个问题剪切作用若是通过酶来作用的，酶是剪切作用若是通过酶来作用的，酶是如如何识别何识别RNA上特定位点上特定位点的？的？剪切酶有没有剪切酶有没有特异性特异性？不同？不同RNA是否需是否需要不同的酶？要不同的酶？切除的切除的RNA是以是以线状还是环状线状还是环状存在的？存在的？命运如何？命运如何？内含子有无内含子有无调控调控作用？作用？前体前体mRNA的拼接的拼接核酶的发现及意义核酶的发现及意义1981年，年，T.Cech和和S.Altman剪接识别顺序剪接识别顺序 Chambons rule GT-AG内含子结构内含子结构SnRNA在在RNA剪接中的作用。剪接中的作用。(small nuclear RNA)U-SnRNA 90-400nt编码核苷酸比实际多，编码核苷酸比实际多，Why？1978年，年，Sanger分析了分析了 174中的中的核苷酸，核苷酸，5386个。个。9个基因，编码个基因，编码2000个氨基酸。个氨基酸。?Barrell（Sanger实验室）实验室）重叠基因重叠基因噬菌体噬菌体 X174的重叠基因的重叠基因各基因的功能：各基因的功能：A，DNA单链合成和双链的复制；单链合成和双链的复制；B、C、D，单链的，单链的合成和（或）包装；合成和（或）包装；F、G、H，噬菌体衣壳的结构蛋白；，噬菌体衣壳的结构蛋白；J，参与病毒，参与病毒颗粒构成的一种小的碱性蛋白；颗粒构成的一种小的碱性蛋白；K，产物未知；，产物未知；E，细胞裂解，细胞裂解基因重叠的方式基因重叠的方式包含包含首尾重叠首尾重叠三个基因的三重重叠三个基因的三重重叠反向重叠反向重叠操纵子重叠操纵子重叠跳跃基因跳跃基因1950年，年，B.McClintock发现玉米中的发现玉米中的Ac-Ds系统。系统。转座子转座子转座子转移转座子转移原核生物的转座模型原核生物的转座模型转座带来的基因重排转座带来的基因重排转座子的遗传学效应转座子的遗传学效应引起引起插入突变插入突变。插入位置上出现插入位置上出现新基因新基因。原来位置上原来位置上保持或切离保持或切离着原有的转座子。着原有的转座子。造成插入位置上受体造成插入位置上受体DNA形成形成正向重复正向重复序列。序列。调节基因活动调节基因活动的开关。的开关。增加增加同源序列的整合同源序列的整合。C值矛盾值矛盾不同门类生物的不同门类生物的C值分布值分布基因特性基因特性结构基因，调控基因结构基因，调控基因操纵子，操纵基因操纵子，操纵基因断裂基因，断裂基因，Intron，Extron重叠基因重叠基因跳跃基因，转座子跳跃基因，转座子C值矛盾值矛盾DNA分析方法与技术分析方法与技术组成组成Hemoglobin的四种多肽链在发育中是变化的。的四种多肽链在发育中是变化的。我们要做什么？我们要做什么？将庞大的将庞大的DNA链切成小的可操作片断。链切成小的可操作片断。对要保存和进一步研究的对要保存和进一步研究的DNA片断进片断进行扩增。行扩增。证明、获取证明、获取DNA片断中所需基因。片断中所需基因。对感兴趣的片断进行表征。对感兴趣的片断进行表征。限制性内切酶限制性内切酶常用限制性内切酶常用限制性内切酶种类及特性种类及特性W.Arber和和H.O.Smith限制性内切酶的剪切方式限制性内切酶的剪切方式切点出现的频率及片断大小切点出现的频率及片断大小部分消化和完全消化部分消化和完全消化DNA限制酶分析限制酶分析其它工具酶其它工具酶连接酶连接酶T4 DNA Ligase 1967修补工具酶修补工具酶DNA聚合酶聚合酶I 大片断大片断 Klenow 1971末端加工酶末端加工酶S1核酸酶核酸酶 ，碱性磷酸单脂酶碱性磷酸单脂酶末端转移酶末端转移酶人工加人工加polyA 或或polyT 尾尾反转录酶反转录酶DNA扩增扩增PCR反应反应DNA片断的克隆片断的克隆载体载体:A specialized DNA sequence that can enter a living cell,signal its presence to an investigator by conferring a detectable property on the host cell,and provide a means of replication for intself and foreign DNA inserted into it.载体的条件载体的条件：a 复制起点复制起点 b 适宜的限制酶切点适宜的限制酶切点c 选择标记选择标记载体的类型载体的类型克隆载体克隆载体穿梭载体穿梭载体表达载体表达载体质粒质粒 噬菌体噬菌体 人工染色体人工染色体质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体粘粒载体粘粒载体酵母人工染色体酵母人工染色体基因文库的建立基因文库的建立A collection of DNA clones that contains multiple copies of nearly every fragment in the whole genome inserted into a suitable vector and placed into storage.重组重组DNA的鉴定的鉴定 遗传学方法遗传学方法免疫学方法免疫学方法如鸡的原肌球蛋白基因的检测如鸡的原肌球蛋白基因的检测肌球蛋白的免疫血清为抗体肌球蛋白的免疫血清为抗体表达产物为抗原表达产物为抗原重组重组DNA的鉴定的鉴定核酸分子杂交核酸分子杂交重组重组DNA的鉴定的鉴定Southern杂交检测杂交检测DNASouthern杂交检测杂交检测DNANorthern杂交检测杂交检测RNA如何进行分子遗传研究？如何进行分子遗传研究？限制性内切酶限制性内切酶PCR载体载体基因文库基因文库DNA检测的几种方法检测的几种方法