复习基因工程.pptx

基因工程专题复习基因工程专题复习1.1 DNA1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具基因工程是指按照基因工程是指按照 ，进行，进行严格的设计，并通过严格的设计，并通过 DNA重组和转重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在类型和生物产品。由于基因工程是在 水平上进行设计和施工的，水平上进行设计和施工的，因此又叫做因此又叫做 。一、基因工程的概念一、基因工程的概念人们的意愿人们的意愿体外体外DNA重组技术重组技术DNA分子分子可以说这既是概念，也是原理。可以说这既是概念，也是原理。操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达人类需要的基因产物人类需要的基因产物(定向定向改造生物遗传特性改造生物遗传特性)实质：基因重组实质：基因重组基因工程的特点：基因工程的特点：二、基因操作的工具二、基因操作的工具v1 1、基因的剪刀、基因的剪刀限制性内切酶限制性内切酶v2 2、基因的针线、基因的针线DNADNA连接酶连接酶v3 3、基因的运输工具、基因的运输工具运载体运载体识别双链识别双链识别双链识别双链DNA DNA 分子的某种分子的某种分子的某种分子的某种特定特定特定特定的核苷酸的核苷酸的核苷酸的核苷酸序列，并且使每一条链中序列，并且使每一条链中序列，并且使每一条链中序列，并且使每一条链中特定部位特定部位特定部位特定部位的两的两的两的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。断开。断开。具有异性具有异性具有异性具有异性主要是从主要是从主要是从主要是从原核生物原核生物原核生物原核生物中分离纯化出来的一中分离纯化出来的一中分离纯化出来的一中分离纯化出来的一种酶种酶种酶种酶 化学本质：化学本质：蛋白质蛋白质。1、来源：、来源：3、作用：、作用：4、结果：、结果：形成两种末端形成两种末端形成两种末端形成两种末端“分子手术刀分子手术刀”限制酶限制酶黏性末端黏性末端平末端平末端可用于目的基因和载体的切割可用于目的基因和载体的切割2、特性：、特性：限制酶是一类酶，而不是一种酶。限制酶是一类酶，而不是一种酶。限制酶是一类酶，而不是一种酶。限制酶是一类酶，而不是一种酶。G A A T T CGC T T A AA A T T CG限制酶切割限制酶切割DNA分子示意图分子示意图 C T T A A G黏性末端黏性末端EcoREcoR中轴线中轴线 C C C G G G限制酶切割限制酶切割DNA分子示意图分子示意图 G G G C C C平末端平末端SmaSma C C C G G GG G GC C C中轴线中轴线GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGEcoREcoRG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G GG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G G不同来源的不同来源的不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合片段混合片段混合将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的DNADNA片段连接起来片段连接起来片段连接起来片段连接起来生物生物生物生物A A基因片段基因片段基因片段基因片段生物生物生物生物B B基因片段基因片段基因片段基因片段G G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G G酶切酶切酶切酶切GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G GG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G G同一种同一种用同一种限制性酶处理不同用同一种限制性酶处理不同DNA片段，会片段，会形成形成同样的黏性末端同样的黏性末端，可进行重组，可进行重组。E EcoliDNAcoliDNA连接酶：连接酶：连接黏性末端连接黏性末端T T4 4DNADNA连接酶：连接酶：连接黏性末端和平末端连接黏性末端和平末端1.DNA1.DNA连接酶的种类连接酶的种类2.DNA连接酶的作用部位：连接酶的作用部位：脱氧核苷酸链上相邻的两个脱氧核苷脱氧核苷酸链上相邻的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键酸之间的磷酸二酯键“分子缝合针分子缝合针”DNA连接酶连接酶DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶作用实质作用实质催化相邻二个核苷酸形成磷酸二酯键催化相邻二个核苷酸形成磷酸二酯键模板模板不需要不需要需要需要连接连接DNA链的方式链的方式双链双链单链单链作用过程作用过程在两个在两个DNA片片段之间形成磷段之间形成磷酸二酯键酸二酯键以一条以一条DNA链为模板，链为模板，将单个核苷酸通过磷酸将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板二酯键形成一条与模板链互补的链互补的DNA链链作用结果作用结果将将DNA双链上双链上的两个缺口同的两个缺口同时连接起来时连接起来合成新的合成新的DNA分子分子作用：作用：具备的条件具备的条件种类：种类：将外源基因送入受体细胞。将外源基因送入受体细胞。对受体细胞的生存没有决定性作用对受体细胞的生存没有决定性作用能在宿主细胞内复制并稳定地保存能在宿主细胞内复制并稳定地保存具有多个限制酶切点具有多个限制酶切点具有某些标记基因具有某些标记基因质粒、噬菌体和动植物病毒。质粒、噬菌体和动植物病毒。使用运载使用运载体的目的体的目的用它作为运载工具，将目的基因送用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去。到宿主细胞中去。“分子运输车分子运输车”载体载体质粒的特点质粒的特点 （）质粒上会存在某些标记基因，标记基因有（）质粒上会存在某些标记基因，标记基因有什么用途？什么用途？思考思考质粒：是一种质粒：是一种 的、的、，并具有，并具有 能力的能力的 。裸露裸露结构简单结构简单独立于细菌染色体（拟核）之外独立于细菌染色体（拟核）之外自我复制自我复制双链环状双链环状DNA分子分子鉴别和筛选含有目的基因的细胞鉴别和筛选含有目的基因的细胞基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因例子：例子：苏云金杆菌抗虫基因、人苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因胰岛素基因、人干扰素基因2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增也可以是一些具有也可以是一些具有调控作用的因子调控作用的因子初始目的基因的来源初始目的基因的来源1.从生物中直接获取从生物中直接获取2.人工合成人工合成 （目的基因的核苷酸序列已知且较简单）目的基因的核苷酸序列已知且较简单）补充：基因的结构补充：基因的结构（1）原核生物基因结构原核生物基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游编码蛋白质编码蛋白质调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达（调控程序）（调控程序）AATGTGCACGTAGTTAGTTACACGTGCATCAATC启动子启动子终止子终止子编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子ATGTGCACGTAGTTAATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATTACACGTGCATCAATRNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶AUGUGCACGUAGUUAAUGUGCACGUAGUUA 启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶聚合酶结合并能起结合并能起始始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。RNA RNA聚合酶聚合酶:能够识别能够识别启动子上的结合位点启动子上的结合位点并与其结合并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它片断，它能阻碍能阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离模板链上脱离下来，使转录终止。下来，使转录终止。编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区（能编码蛋白质）（能编码蛋白质）启动子启动子终止子终止子（2）真核与）真核与原核生物基因结构的比较原核生物基因结构的比较外显子外显子内含子内含子编码蛋白质编码蛋白质（不能编码蛋白质）（不能编码蛋白质）相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区。调控作用的非编码区。不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。核细胞的编码区是间隔的，不连续的。（2）真核生物基因结构）真核生物基因结构外显子外显子：真核细：真核细胞基因胞基因DNA中的中的编码序列，这些编码序列，这些序列被转录成序列被转录成RNA并进而翻译并进而翻译为蛋白质。为蛋白质。内含子内含子：真核细：真核细胞基因胞基因DNA中的间插序中的间插序列，这些序列被列，这些序列被转录成转录成RNA，但，但随即被剪除而不随即被剪除而不翻译。翻译。1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导入到片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因，称为基因文库.基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）基因文库基因文库提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库a.a.直接分离法直接分离法(鸟枪法鸟枪法)如何构建如何构建基因文库？基因文库？某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶b.b.反转录法：反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解如何构建如何构建基因文库？基因文库？基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较为什么要构建基因文库？为什么要构建基因文库？目的目的怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?便于在便于在不知道目的基不知道目的基因核苷酸序因核苷酸序列列的情况下，的情况下，获得所需的目的基因。获得所需的目的基因。依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据如：根据基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质基因翻译产物蛋白质 等特性。等特性。概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、_、_ _、_ (Taq (Taq酶）酶）.原理：原理：_聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制模板模板DNA DNA 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNADNA引物引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶2.2.利用利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：使使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增一段已知目的基因的核一段已知目的基因的核苷酸序列苷酸序列指数指数2n过程过程a a、变性、变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、复性、复性（复性复性55-6055-60）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链5 5/3 3/GGGGTCTC3 3/5 5/AGAGCCCC5 5/3 3/引物引物GGGG 变性变性（90-90-9595）退火退火(55-(55-65)65)延伸延伸（70-70-7575）5 5/3 3/AGAG引物引物PCRPCR技术扩增目的基因的过程：技术扩增目的基因的过程：3.3.人工合成人工合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成已知核苷酸序列的已知核苷酸序列的较小基因可以较小基因可以化学化学合成，不需要模板。合成，不需要模板。质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同一种同一种1.1.过程过程二二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核心限制酶切割位点的选择必须保证目的基因，标限制酶切割位点的选择必须保证目的基因，标记基因的完整性，以便于检测和表达。记基因的完整性，以便于检测和表达。2、目的：、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代并且可以遗传给下一代同时使目的基因能够表达和发挥作同时使目的基因能够表达和发挥作用。用。3 3、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化：（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法钙离子处理钙离子处理目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的色体的DNA上。上。过程：过程：优点：经济、有效优点：经济、有效（2）基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射 带目的基因受精卵带目的基因受精卵 新性状动物新性状动物2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：3 3、导入微生物细胞、导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少单细胞、遗传物质少用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合 感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNADNA分子分子方法：方法：四四、目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂杂交交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起 一、蛋白质工程的崛起的缘由一、蛋白质工程的崛起的缘由基因工程产物基因工程产物 基因工程在原则上只能生产基因工程在原则上只能生产自然界自然界已存在的已存在的蛋白质。蛋白质。这些这些天然蛋白质天然蛋白质是生物在长期进化过程是生物在长期进化过程中形成的中形成的,它们的结构和功能符合特定物它们的结构和功能符合特定物种生存的需要种生存的需要,却却不一定完全符合人类生不一定完全符合人类生产和生活的需要。产和生活的需要。二、蛋白质工程的基本原理二、蛋白质工程的基本原理1 1、蛋白质工程的目标、蛋白质工程的目标 根据人们对根据人们对蛋白质功能蛋白质功能的特定需求，的特定需求，对蛋白质的对蛋白质的结构结构进行分子设计。进行分子设计。2 2、天然蛋白质的合成过程、天然蛋白质的合成过程DNADNA（基因）（基因）转录转录mRNAmRNA翻译翻译蛋白质蛋白质基因基因表达（转录和翻译）表达（转录和翻译）形成氨基酸序列的多肽形成氨基酸序列的多肽链链形成具有高级结构的蛋白质形成具有高级结构的蛋白质行使生物功能行使生物功能、蛋白质工程的基本途径、蛋白质工程的基本途径预期的蛋白质功能预期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）（基因）4 4、蛋白质工程的概念、蛋白质工程的概念 是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，通过基因修饰或基因合成，对对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。以满足人类的生产和生活的需求。蛋白质工程的基础蛋白质工程的基础:蛋白质分子的结构规律及其生蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系物功能的关系蛋白质工程的实质：蛋白质工程的实质：改造基因改造基因蛋白质工程的产物：蛋白质工程的产物：新的蛋白质新的蛋白质5 5、蛋白质工程与基因工程的关系、蛋白质工程与基因工程的关系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延延伸出来的伸出来的第二代基因工程第二代基因工程，是包含多学科的，是包含多学科的综合科技工程领域。综合科技工程领域。基因工程基因工程是通过基因操作把外源基因转是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品是该基因编码的的产品是该基因编码的天然存在的蛋白质天然存在的蛋白质。注意：注意：1、改造蛋白质是通过改造基因实现的，、改造蛋白质是通过改造基因实现的，这样的改造可遗传给后代，而且改造基因这样的改造可遗传给后代，而且改造基因容易操作。容易操作。2、改造基因时，要对基因进行修饰或合、改造基因时，要对基因进行修饰或合成基因，需要用到基因工程中的工具酶。成基因，需要用到基因工程中的工具酶。3、改造后的基因需要表达出相应的蛋、改造后的基因需要表达出相应的蛋白质，一般让其在受体细胞中表达，导白质，一般让其在受体细胞中表达，导入受体细胞前，仍然需要构建基因的表入受体细胞前，仍然需要构建基因的表达载体。达载体。