Waters_质谱培训教材.pdf

Quattro UltimaQuattro Ultima培训教程培训教程Waters中国有限公司Waters中国有限公司2/202/20Quattro Ultima pt质谱仪质谱仪3/203/20仪器示意图仪器示意图4/204/20仪器结构示意图仪器结构示意图1.经经HPLC分离的样品进入大气压电离源分离的样品进入大气压电离源1.经经HPLC分离的样品进入大气压电离源分离的样品进入大气压电离源2.样品离子经六极杆透镜聚焦进入质量分析器样品离子经六极杆透镜聚焦进入质量分析器2.样品离子经六极杆透镜聚焦进入质量分析器样品离子经六极杆透镜聚焦进入质量分析器3.样品离子根据其质荷比在样品离子根据其质荷比在MS1中过滤分析中过滤分析3.样品离子根据其质荷比在样品离子根据其质荷比在MS1中过滤分析中过滤分析4.被分析离子在六极杆碰撞室中进行被分析离子在六极杆碰撞室中进行CID分析分析4.被分析离子在六极杆碰撞室中进行被分析离子在六极杆碰撞室中进行CID分析分析5.碎片离子根据其质荷比在碎片离子根据其质荷比在MS2中过滤分析中过滤分析5 5.碎片离子根据其质荷比在碎片离子根据其质荷比在MS2中过滤分析中过滤分析6.光电倍增器检测分析离子光电倍增器检测分析离子6.光电倍增器检测分析离子光电倍增器检测分析离子5/205/20四极杆理论四极杆理论 RF透镜透镜RF 透镜透镜这是六极杆示意图。这是六极杆示意图。六极杆用射频脉冲信号和一很小的偏置电压控制，六极杆用射频脉冲信号和一很小的偏置电压控制，RF透镜传输所有离子，但不过滤离子。透镜传输所有离子，但不过滤离子。确保离子在较低的真空区域能很好地聚焦。确保离子在较低的真空区域能很好地聚焦。离子能被聚焦成紧密的一束进入四极杆质量分析器。离子能被聚焦成紧密的一束进入四极杆质量分析器。注意注意:电压极性是固定的。电压极性是固定的。6/206/20四极杆质量分析器离子稳定示意图四极杆质量分析器离子稳定示意图-1去检测器去检测器-+-+XY四极杆上的电压四极杆上的电压-ve 0 +ve?X被分析离子由被分析离子由DC和和RF电压控制电压控制Y来自离子源来自离子源RF 周波周波7/207/20四极杆质量分析器离子稳定示意图-2四极杆质量分析器离子稳定示意图-201020304050607080900200400600800RF 振幅振幅 Vo(伏特伏特)DC 电压电压 U(伏特伏特)X 稳定稳定Y 不稳定不稳定X 不稳定不稳定Y 稳定稳定X 和和 Y 都稳定都稳定Y 稳定性分界线稳定性分界线X 稳定性分界线稳定性分界线8/208/20预四极杆过滤器和四极杆质量分析器理论预四极杆过滤器和四极杆质量分析器理论预四极杆过滤器四极杆质量过滤器预四极杆过滤器四极杆质量过滤器四极杆分析器四极杆分析器丢弃的离子丢弃的离子稳定的离子稳定的离子9/209/20质谱分辨率的定义质谱分辨率的定义传统分辨率的定义传统分辨率的定义:分辨率分辨率R=m/mat 5%valley 单位质量分辨率单位质量分辨率:FWHM=0.5-0.8 amuwith 10-20%valley10/2010/20单位质量分辨率单位质量分辨率半峰高处的峰宽为半峰高处的峰宽为 0.5-0.8 amu 半峰宽半峰宽=0.6m/m=133/0.6=222半峰宽半峰宽=0.5m/m=1009/0.5=201811/2011/20分辨率设置分辨率设置LM/HM分辨率分辨率=15:1/2 峰高处的峰宽峰高处的峰宽=0.7 amu0.7 amu12/2012/20分辨率设置分辨率设置LM/HM 分辨率分辨率=11:1/2 峰高处的峰宽峰高处的峰宽=1.4 1.4 amu低分辨低分辨13/2013/20分辨率设置分辨率设置LM/HM 分辨率分辨率=18:1/2 峰高处的峰宽峰高处的峰宽=0.3 amu高分辨高分辨14/2014/20大气压电离技术大气压电离技术ESI和APcI 的区别ESI和APcI 的区别 离子化方式不同离子化方式不同?ESI ESI 在溶液中进行离子化在溶液中进行离子化?APcIAPcI 在气相中进行离子化在气相中进行离子化 分析样品类型不同分析样品类型不同?ESI ESI 极性化合物和生物大分子极性化合物和生物大分子?APcIAPcI 弱性极化合物、小分子化合物(相对于ESI方式而言)，并有一定的挥发性弱性极化合物、小分子化合物(相对于ESI方式而言)，并有一定的挥发性 要求的流动相流速不同要求的流动相流速不同?ESI-0.001 to 1 mL/minESI-0.001 to 1 mL/min?APcI-0.2 to 2 mL/minAPcI-0.2 to 2 mL/min15/2015/20Electrospray Theory?A video clip will be shown here16/2016/20电喷雾离子化理论电喷雾离子化理论毛细管电压毛细管电压 3 kV离子从液滴表面蒸发出去离子从液滴表面蒸发出去当小液滴蒸发时，表面电荷增多，液滴中离子向表面移动。当小液滴蒸发时，表面电荷增多，液滴中离子向表面移动。17/2017/20电喷雾离子化电喷雾离子化探头电离电压探头电离电压 3 kV探头电离电压探头电离电压 3 kV用氮气去除溶剂用氮气去除溶剂用氮气去除溶剂用氮气去除溶剂锥孔电压锥孔电压 10-100 V锥孔电压锥孔电压 10-100 V离子蒸发离子蒸发离子离子离子蒸发离子蒸发18/2018/20Z SPRAYTM电离源电离源19/2019/20电喷雾电喷雾 Tune Page 设置(1)设置(1)毛细管电压毛细管电压ESI+ESI-ESI+ESI-2.502.502.502.503.753.753.753.752.002.002.002.003.003.003.003.0020/2020/20电喷雾电喷雾 Tune Page 设置(2)设置(2)锥孔电压锥孔电压35353535100100100100锥孔电压锥孔电压21/2021/20电喷雾 Tune Page 设置(3)电喷雾 Tune Page 设置(3)0 0 0 0250250250250RF 透镜 1 电压RF 透镜 1 电压0 0 0 01 1 1 1缝隙电压缝隙电压0 0 0 01 1 1 1RF 透镜 2 电压RF 透镜 2 电压RF透镜和缝隙电压透镜和缝隙电压22/2022/20电喷雾电喷雾 Tune Page 设置(4)设置(4)注射流速(5-40 l/min)注射流速(5-40 l/min)源温度源温度8080脱溶剂气脱溶剂气120120HPLC(100-300 l/min)HPLC(100-300 l/min)源温度脱溶剂气源温度脱溶剂气120120140140350350400400离子源温度离子源温度23/2023/20电喷雾电喷雾 Tune Page 设置(5)设置(5)锥孔气脱溶剂气锥孔气脱溶剂气3003003003001000100010001000100100100100N2流速流速24/2024/20探头位置探头位置25/2025/20用于单级MS的推荐设置用于单级MS的推荐设置注意注意:入口和出口的电压设置在入口和出口的电压设置在20-100V之间碰撞能量要小之间碰撞能量要小,大约大约 2-3 eV之间之间26/2026/20Quattro Ultima MS-MS?低能量碰撞(获得简单碎片的途径)低能量碰撞(获得简单碎片的途径)?碰撞气选用氩气(Argon)碰撞气选用氩气(Argon)?碰撞气的压力通常是固定的(2 310-3mbar),而通常用碰撞能量来调节断裂的程度碰撞气的压力通常是固定的(2 310-3mbar),而通常用碰撞能量来调节断裂的程度?钠和钾的加合物通常都非常稳定,以至于用低的碰撞能量不足以使之碎裂钠和钾的加合物通常都非常稳定,以至于用低的碰撞能量不足以使之碎裂27/2027/20用于用于 MS-MS的推荐设置的推荐设置注意:注意:入口和出口电压的变化以及分辨率的变化入口和出口电压的变化以及分辨率的变化28/2028/20推荐的质量分析器的参数设置推荐的质量分析器的参数设置MS 扫描MS 扫描MS/MS 扫描MS/MS 扫描MRMMRM29/2029/20数据采集方式-数据采集方式-ContinuumContinuum 扫描方式扫描方式?每次扫描的数据都存贮 可查看每次扫描的质谱图或累加后的质谱图。每次扫描的数据都存贮 可查看每次扫描的质谱图或累加后的质谱图。?这种类型的扫描其数据要占据大量的计算机存贮空间。这种类型的扫描其数据要占据大量的计算机存贮空间。30/2030/20数据采集-数据采集-Continuum 扫描方式扫描方式数据采集数据采集一段扫描的平均质谱图一段扫描的平均质谱图31/2031/20数据采集方式-数据采集方式-CentroidCentroid(“棒图(“棒图”)扫描方式)扫描方式?每次扫描的数据都存贮 可查看每次扫描的质谱图或累加后的质谱图。Continuum方式采集的数据能自动处理并以Centroid 格式存贮数据。每次扫描的数据都存贮 可查看每次扫描的质谱图或累加后的质谱图。Continuum方式采集的数据能自动处理并以Centroid 格式存贮数据。?质谱图显示的是离子峰的中心质荷比，可用其进行精确质量测量（HRMS）。质谱图显示的是离子峰的中心质荷比，可用其进行精确质量测量（HRMS）。?质谱棒图不能进行分辨率测定，而且如不进行同位素峰标记，其质荷比可能是不准确的。质谱棒图不能进行分辨率测定，而且如不进行同位素峰标记，其质荷比可能是不准确的。?数据占用空间比Continuum方式小。数据占用空间比Continuum方式小。32/2032/20数据采集-数据采集-Centroid 扫描方式扫描方式数据采集数据采集一段扫描的平均质谱图一段扫描的平均质谱图33/2033/20数据采集方式-数据采集方式-MCA多通道分析扫描多通道分析扫描(MCA)方式方式?采集的数据是所有扫描质谱累加后的数据。采集的数据是所有扫描质谱累加后的数据。?随机噪声信号没有样品数据累加的快，所得到的是一张平均质谱图，它只关心样品数据。随机噪声信号没有样品数据累加的快，所得到的是一张平均质谱图，它只关心样品数据。?这种扫描方式不能这种扫描方式不能实时实时监测采集的质谱数据。监测采集的质谱数据。?数据所占用的存贮空间比数据所占用的存贮空间比Continuum方式小。方式小。34/2034/20数据采集-数据采集-MCA 扫描方式扫描方式数据采集生成一张加和质谱图数据采集生成一张加和质谱图35/2035/20最高扫描速度指南最高扫描速度指南Continuum 扫描方式扫描方式1000 amu/secCentroid 扫描方式扫描方式2000 amu/secMCA 扫描方式扫描方式1000 amu/sec扫描速度可以达到扫描速度可以达到 4000 amu/sec,但是当用较低扫描速度时，数据的重现性更好但是当用较低扫描速度时，数据的重现性更好.36/2036/20仪器校正曲线仪器校正曲线?三重四极串联质谱仪要求对三重四极串联质谱仪要求对MS1和和MS2进行三次校正，进行三次校正，给出最多六条校正曲线给出最多六条校正曲线:静态静态:精确校正仪器，使四极杆质量分析器准确地精确校正仪器，使四极杆质量分析器准确地停停在指定的在指定的质荷比质荷比(如如:Tuning,SIR,MRM)。扫描扫描:校正能确保所采集到的质谱峰进行精确质量测量校正能确保所采集到的质谱峰进行精确质量测量(如在全如在全扫描方式扫描方式)扫描速度补偿扫描速度补偿:当仪器进行快速扫描时，对系统进行当仪器进行快速扫描时，对系统进行延时延时补偿补偿校正。校正。?每次选择校正类型，都要采集参考化合物的质谱图。每次选择校正类型，都要采集参考化合物的质谱图。37/2037/20校正仪器的准备校正仪器的准备选择每道尔顿选择每道尔顿16个点的样品扫描速率，将允许仪器在校正时，进行质谱峰的精确描述。个点的样品扫描速率，将允许仪器在校正时，进行质谱峰的精确描述。选择适合的离子点数预置选择适合的离子点数预置(0-50)38/2038/20校正仪器的准备校正仪器的准备调谐调谐(TUNING)当向仪器注入参考化合物时，调整离子源参数，优化质谱峰强度和峰形。当向仪器注入参考化合物时，调整离子源参数，优化质谱峰强度和峰形。设置设置MS1和和MS2的分辨率和离子能量参数的分辨率和离子能量参数39/2039/20校正仪器的准备校正仪器的准备40/2040/20校正仪器的准备校正仪器的准备41/2041/20校正仪器的参数校正仪器的参数42/2042/20校正仪器的参数校正仪器的参数43/2043/20校正仪器的参数校正仪器的参数44/2044/20仪器校正采集仪器校正采集45/2045/20仪器校正采集仪器校正采集46/2046/20仪器校正采集仪器校正采集 扫描时间计算扫描时间计算?扫描时间=(质量范围/扫描速率)扫描间隔时间扫描时间=(质量范围/扫描速率)扫描间隔时间 典型的例子:典型的例子:?慢扫描速率=100 amu/秒:扫描时间=(1000/100)-0.1=9.9 秒慢扫描速率=100 amu/秒:扫描时间=(1000/100)-0.1=9.9 秒?快扫描速率=1000 amu/秒:扫描时间=(1000/1000)-0.1=0.9 秒快扫描速率=1000 amu/秒:扫描时间=(1000/1000)-0.1=0.9 秒47/2047/20仪器校正采集仪器校正采集扫描速度扫描速度=质量范围 质量范围(扫描时间扫描时间+扫描间隔时间扫描间隔时间)常用参数常用参数:低扫描速度低扫描速度=100 amu/sec.快速扫描速度快速扫描速度=1000 amu/sec.要求最小扫描次数要求最小扫描次数=3最小运行时间最小运行时间=(三倍低扫描时间三倍低扫描时间)+(二倍扫描间隔时间二倍扫描间隔时间)48/2048/20仪器校正采集仪器校正采集49/2049/20仪器校正曲线仪器校正曲线50/2050/20仪器预置门槛仪器预置门槛51/2051/20仪器门槛:参数设置仪器门槛:参数设置Continuum扫描方式基线设置扫描方式基线设置在在Continuum数据采集方式下使用如数据采集方式下使用如 MS 扫描，此值可正可负。扫描，此值可正可负。每道尔顿的数据点每道尔顿的数据点可选择可选择16,8 或或 4 点。对于小分子化合物可选点。对于小分子化合物可选16点点/amu（STD）。）。SIR基线设置基线设置与与Continuum方式基线设置相同，但当进行方式基线设置相同，但当进行SIR/MRM 数据采集时，只能设正值数据采集时，只能设正值离子计数离子计数这是最重要的参数，建议此值设置在这是最重要的参数，建议此值设置在 0 100之间。之间。52/2052/20仪器门槛:离子计数仪器门槛:离子计数Threshold=30Threshold=30Threshold=30Threshold=20Threshold=20Threshold=20Threshold=10Threshold=10Threshold=10Threshold=0Threshold=0Threshold=053/2053/20仪器门槛:离子计数仪器门槛:离子计数Threshold=30Threshold=20Threshold=10Threshold=054/2054/20锥孔电压（锥孔电压（CV）断裂）断裂红霉素Erythromycin红霉素Erythromycin55/2055/20锥孔电压与质谱碎片的关系锥孔电压与质谱碎片的关系?高锥孔电压可促使样品在源内碎裂。高锥孔电压可促使样品在源内碎裂。如果母离子不稳定，通过监测碎片离子可提高检测灵敏度。如果母离子不稳定，通过监测碎片离子可提高检测灵敏度。用全扫描比用子离子扫描能提供更丰富的结构信息。用全扫描比用子离子扫描能提供更丰富的结构信息。?可进行可进行MS-MS-MS分析，但更重要的是确保改变锥孔电压能产生真实的结构碎片信息。分析，但更重要的是确保改变锥孔电压能产生真实的结构碎片信息。56/2056/20CV 断裂与断裂与 MS-MS的比较的比较红霉素Erythromycin红霉素Erythromycin57/2057/20多电荷离子的识别多电荷离子的识别?质谱仪所监测的是带电样品离子的质荷比(m/z)。质谱仪所监测的是带电样品离子的质荷比(m/z)。质谱峰一般按下述方式出现(i.e.m/z=m)质谱峰一般按下述方式出现(i.e.m/z=m)单电荷Mass=(M+H)单电荷Mass=(M+H)双电荷Mass=1/2(M+2H)双电荷Mass=1/2(M+2H)n 电荷Mass=1/n(M+nH)n 电荷Mass=1/n(M+nH)?双电荷离子的同位素峰相差 0.5 Da双电荷离子的同位素峰相差 0.5 Da58/2058/20多电荷离子多电荷离子59/2059/20多电荷离子多电荷离子(M+2H)2+(M+2H)2+(M+H)+(M+H)+60/2060/20多电荷离子的MS-MS 多电荷离子的MS-MS?一般都用丰度最强的质谱峰进行质谱质谱分析，即使它是多电荷离子。一般都用丰度最强的质谱峰进行质谱质谱分析，即使它是多电荷离子。?多电荷离子一般比单电荷离子需要更高的碰撞气电压多电荷离子一般比单电荷离子需要更高的碰撞气电压?碎片离子可能比多电荷离子的质荷比大。碎片离子可能比多电荷离子的质荷比大。61/2061/20扫描类型选择扫描类型选择?子离子扫描子离子扫描(DAU)?母离子扫描母离子扫描(PAR)?中性碎片丢失扫描中性碎片丢失扫描(CNL)?单离子监测单离子监测(SIR 或或 MRM)62/2062/20子离子质谱图子离子质谱图MS1MS2碰撞室碰撞室静态静态扫描扫描用用MS2质量分析器扫描指定母离子的子离子碎片，所得到的质谱图只能是由指定母离子经碰撞产生。质量分析器扫描指定母离子的子离子碎片，所得到的质谱图只能是由指定母离子经碰撞产生。63/2063/20子离子扫描质谱图子离子扫描质谱图64/2064/20母离子质谱图母离子质谱图MS1MS2碰撞室碰撞室扫描扫描静态静态用用MS1质量分析器扫描能丢失指定质谱碎片的母离子，所得到的母离子质谱峰一定是能丢失指定质谱碎片的母离子。质量分析器扫描能丢失指定质谱碎片的母离子，所得到的母离子质谱峰一定是能丢失指定质谱碎片的母离子。65/2065/20母离子扫描质谱图母离子扫描质谱图66/2066/20中性碎片丢失扫描质谱图中性碎片丢失扫描质谱图MS1MS2碰撞室碰撞室扫描扫描扫描扫描MS1质量分析器扫描能丢失指定中性碎片的母离子，质量分析器扫描能丢失指定中性碎片的母离子，MS2质量分析器扫描丢失指定中性碎片的离子，所得到的质谱图是由质量分析器扫描丢失指定中性碎片的离子，所得到的质谱图是由MS1扫描的母离子，母离子只能是丢失指定中性碎片的离子扫描的母离子，母离子只能是丢失指定中性碎片的离子67/2067/20中性碎片丢失扫描质谱图中性碎片丢失扫描质谱图68/2068/20选择离子记录选择离子记录(SIR)MS1碰撞室碰撞室MS2静态静态MS1质量分析器是静态，并且只监测指定的离子。质量分析器是静态，并且只监测指定的离子。69/2069/20多反应监测多反应监测(MRM)MS1MS2碰撞室碰撞室静态静态静态静态指定的母离子产生一指定的子离子，两个质量分析器都是静态的。指定的母离子产生一指定的子离子，两个质量分析器都是静态的。70/2070/20多反应监测扫描多反应监测扫描71/2071/20APcI Theory?A video clip will be shown here72/2072/20大气压化学电离大气压化学电离(APcI)?适合小分子化合物(1000 Da)适合小分子化合物(1000 Da)?单电荷质谱单电荷质谱?即使锥孔电压很小，源内也能产生碎片,这是因为高温引起的。即使锥孔电压很小，源内也能产生碎片,这是因为高温引起的。?流动相可以是非极性溶剂(正相色谱)流动相可以是非极性溶剂(正相色谱)73/2073/20APcI电离源电离源74/2074/20APcI理论理论?通过加热探头，有助于去除溶剂，并形成气溶胶。通过加热探头，有助于去除溶剂，并形成气溶胶。?流动相蒸发进入离子源，通过电晕放电针，使溶剂流动相蒸发进入离子源，通过电晕放电针，使溶剂分子带电，形成离子。分子带电，形成离子。?分析物分子与这些溶剂离子反应，一般会获得或失分析物分子与这些溶剂离子反应，一般会获得或失去一个质子，形成正离子或负离子。去一个质子，形成正离子或负离子。?形成的样品离子进入形成的样品离子进入Z-Spray 离子源，同离子源，同ESI方式分方式分析。析。75/2075/20APcI Tune Page设置设置(1)电晕针电流电晕针电流正 APcI负正 APcI负 APcI0.00.010.010.00.00.010.010.076/2076/20APcI Tune Page设置设置(2)锥孔电压锥孔电压3535100100锥孔电压锥孔电压77/2077/20APcI Tune Page设置设置(3)0 0 0 0250250250RF 透镜 1电压250RF 透镜 1电压0 0 0 01 1 1 1缝隙电压缝隙电压0 0 0 01 1 1 1RF 透镜 2电压RF 透镜 2电压RF 透镜和缝隙电压透镜和缝隙电压78/2078/20APcI Tune Page设置设置(4)HPLC(0.2-2 ml/min)离子源温度HPLC(0.2-2 ml/min)离子源温度120120150150APcI 探头温度APcI 探头温度300300600600离子源和探头温度离子源和探头温度79/2079/20APcI Tune Page设置设置(5)气流量气流量锥孔气脱溶剂气锥孔气脱溶剂气10010025025010010080/2080/20ESI 与与APcI的比较的比较电离技术流速质量范围生成的离子电离技术流速质量范围生成的离子(ml/min)ESI0.001 0.3200,000 Da(M+H)+(M-H)-(M+nH)n+APcI0.2 2.01000 Da(M+H)+(M-H)-