华东理工大学现代发酵调控学发酵过程优化.pptx

发酵的定义 狭义的发酵是指在厌氧条件下葡萄糖通过狭义的发酵是指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢过程。过程。广义则将发酵看作是微生物把一些原料养广义则将发酵看作是微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢途分在合适的发酵条件下经特定的代谢途径转变成所需产物的过程。径转变成所需产物的过程。发酵过程优化发发酵酵是是一一种种很很复复杂杂的的生生化化过过程程，其其好好坏坏涉涉及及诸诸多因素。多因素。除除了了菌菌种种的的生生产产性性能能，还还与与培培养养基基的的配配比比，原原料料的的质质量量，灭灭菌菌条条件件、种种子子的的质质量量、发发酵酵条条件件和过程控制等有密切关系。和过程控制等有密切关系。因因此此，不不论论是是新新，老老品品种种，都都必必需需经经过过发发酵酵研研究究这这一一关关，以以考考查查其其代代谢谢规规律律、影影响响产产物物合合成成的因素，优化发酵工艺条件。的因素，优化发酵工艺条件。发酵过程优化发酵生产受许多因素的影响和工艺条件的发酵生产受许多因素的影响和工艺条件的制约，同一生产菌种和培养基配方，不制约，同一生产菌种和培养基配方，不同厂家的生产水平也不一定相同。同厂家的生产水平也不一定相同。这是由于各厂家的生产设备，培养基的来这是由于各厂家的生产设备，培养基的来源，包括水质和工艺条件各不尽相同。源，包括水质和工艺条件各不尽相同。公用系统的成本公用系统的成本不同，会采用不同工艺。不同，会采用不同工艺。发酵过程优化 通通常常，菌菌种种的的生生产产性性能能越越高高，其其生生产产条条件件越难满足。越难满足。高高产产菌菌种种对对工工艺艺条条件件的的波波动动往往往往比比低低产产菌菌种种更敏感更敏感。掌掌握握生生产产菌菌种种的的代代谢谢规规律律和和发发酵酵调调控控的的基基本本知知识识对对生生产产的的稳稳定定和和提提高高具具有有重重要要的的意义。意义。微生物发酵过程培养方式微微生生物物发发酵酵过过程程可可分分为为分分批批、补补料料-分分批批和和半连续半连续(发酵液带放发酵液带放)和连续等几种方式。和连续等几种方式。不同的培养技术各有其优缺点。不同的培养技术各有其优缺点。了了解解生生产产菌菌种种在在不不同同工工艺艺条条件件下下的的细细胞胞生生长长、代代谢谢和和产产物物合合成成的的变变化化规规律律将将有有助助于发酵生产的控制。于发酵生产的控制。分批培养（batch）分批发酵 分分批批发发酵酵是是一一种种准准封封闭闭式式系系统统，种种子子接接种种到到培培养养基基后后除除了了气气体体流流通通外外发发酵酵液液始始终终留在生物反应器内。留在生物反应器内。在在此此简简单单系系统统内内所所有有液液体体的的流流量量等等于于零零，故由物料平衡得式故由物料平衡得式5-15-3的微分方程：的微分方程：分批发酵dX/dt=X (5-1)dS/dt=qS X (5-2)dP/dt=qP X (5-3)式中X为菌体浓度(g/L);t 为培养时间(h):为比生长速率（1/h);S为基质浓度(g/L);-qS 为比基质消耗速率(g/g)/h；P为产物 浓 度(g/L);qP为 比 产 物 形 成 速 率(g/g)/h。分批发酵 分批发酵过程一般可分批发酵过程一般可粗分为粗分为4期，即停滞期，即停滞(适应适应)期、对数期、对数(指数指数)生长期、静止生长期、静止(稳定稳定)期和死亡期；期和死亡期；也可也可细分为细分为六期：即停滞期、加速期、六期：即停滞期、加速期、对数期、减速期、静止期和死亡期，如对数期、减速期、静止期和死亡期，如图图5-1所示。所示。分批发酵 工工业业生生产产从从发发酵酵产产率率和和发发酵酵指指数数以以及及避避免免染菌考虑，希望尽量缩短适应期。染菌考虑，希望尽量缩短适应期。在停滞期(I),即刚接种后的一段时间内，细胞数目和菌量不变，因菌对新的生长环境有一适应过程，其长短主要取决于种子的活性、接种量和培养基的可利用性和浓度。分批发酵 加速期加速期()通常很短，大多数细胞在此期的比生长速率可在短时间内从最小升到最大值。如这时菌已完全适应其周围环境，有充足的养分而又无抑制生长的物质便进入恒定的对数或指数生长期指数生长期()分批发酵 在对数生长期的比生长速率达最大，在对数生长期的比生长速率达最大，可用可用 max表示，指数生长期的长短主表示，指数生长期的长短主要取决于培养基要取决于培养基,包括溶氧的可利用包括溶氧的可利用性和有害代谢产物的积累。性和有害代谢产物的积累。分批发酵 在减速期在减速期()随着养分的减少，有害代谢随着养分的减少，有害代谢物的积累，生长不可能再无限制地继续。物的积累，生长不可能再无限制地继续。这时比生长速率成为养分、代谢产物和这时比生长速率成为养分、代谢产物和时间的函数，其时间的函数，其细胞量仍旧在增加细胞量仍旧在增加，但，但其其比生长速率不断下降比生长速率不断下降，细胞在代谢与，细胞在代谢与形态方面逐渐蜕化，经短时间的减速后形态方面逐渐蜕化，经短时间的减速后进入生长静止进入生长静止(稳定稳定)期。期。分批发酵 减速期的长短取决于菌对限制性基质的亲和力(Ks值)，亲和力高，即Ks值小，则减速期短。分批发酵静止期静止期(V)，实际上是一种生长和死亡的动，实际上是一种生长和死亡的动态平衡，净生长速率等于零，即态平衡，净生长速率等于零，即 ,式中式中 为比死亡速率。为比死亡速率。此期菌体的次级代谢十分活跃，许多次级此期菌体的次级代谢十分活跃，许多次级代谢产物在此期大量合成，菌的形态也代谢产物在此期大量合成，菌的形态也发生较大的变化，如菌已分化，染色变发生较大的变化，如菌已分化，染色变浅，形成空胞等。浅，形成空胞等。分批发酵当当养养分分耗耗竭竭，对对生生长长有有害害代代谢谢物物在在发发酵酵液中大量积累便进入死亡期液中大量积累便进入死亡期()。这时这时 ,生长呈负增长。生长呈负增长。工工业业发发酵酵一一般般不不会会等等到到菌菌体体开开始始自自溶溶时时才结束培养。才结束培养。发发酵酵周周期期的的长长短短不不仅仅取取决决于于前前面面五五期期的的长短还取决于长短还取决于Xo。分批发酵 将对数期称为生长期将对数期称为生长期(trophophase)。将静止期称为分化期将静止期称为分化期(idiophase)。生长期末为产物的形成创造了必要的条生长期末为产物的形成创造了必要的条件。件。分批发酵(1)(1)生长关联型生长关联型 根据产物的形成是否与菌根据产物的形成是否与菌体生长同步关联，体生长同步关联，Pirt将产物形成动力学将产物形成动力学分为生长关联型和非生长关联型。分为生长关联型和非生长关联型。一般，一般，初级代谢产物初级代谢产物的形成与生长关联；的形成与生长关联；而而次级代谢产物次级代谢产物的形成与生长非直接关的形成与生长非直接关联。联。分批发酵qp=Yp/x 对与生长关联的产物形成，对与生长关联的产物形成，比产物形成比产物形成速率随比生长速率的增长而提高速率随比生长速率的增长而提高。这类产物通常是微生物的分解代谢产物，这类产物通常是微生物的分解代谢产物，如酒精。如酒精。由根霉产生的脂肪酶和由树状黄杆菌产由根霉产生的脂肪酶和由树状黄杆菌产生的葡萄糖异构酶也属于这一类型。生的葡萄糖异构酶也属于这一类型。分批发酵(2)(2)非非生生长长关关联联型型 此此类类型型的的产产物物形形成成只只与与细细胞的积累量有关，可用式胞的积累量有关，可用式5-9表示：表示：dP/dt=X (5-9)式式中中dP/dt为为产产物物形形成成速速率率(g/L)/h；为为比比例例常数。常数。由由此此式式可可见见，产产物物形形成成速速率率与与菌菌的的生生长长速速率率无无关关，而而与与菌菌量量有有关关。次次级级代代谢谢产产物物中中的的一一些抗生素的产物合成即属于这一类。些抗生素的产物合成即属于这一类。分批发酵分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响在在浓浓度度较较低低的的(AB)范范围围内内，静静止止期期的的细细胞胞浓浓度与初始基质浓度成正比，可用式度与初始基质浓度成正比，可用式5-10表达：表达：X=Y(SoSt)(5-10)式式中中So为为初初始始基基质质浓浓度度(g/L);St为为经经培培养养时时间间t的的基基质质浓浓度度(g/L)；Y为为得得率率系系数数(g细细胞胞/g基基质质)在在A-B的区域，当生长停止时，的区域，当生长停止时，St等于零。等于零。方方程程5-10可可用用于于预预测测用用多多少少初初始始基基质质便便能能得得到到相应的菌量相应的菌量。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响在在C-D的的区区域域，菌菌量量不不随随初初始始基基质质浓浓度度的的增加而增加。增加而增加。这这时时菌菌的的进进一一步步生生长长受受到到积积累累的的有有害害代代谢物的限制。谢物的限制。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响用用Monod方程可描述比生长速式中方程可描述比生长速式中 max是是最大比生长速率最大比生长速率(h-1);Ks 为基质利用常数为基质利用常数率和残留的率和残留的限制性基质浓度限制性基质浓度之间的关系：之间的关系：max S/(Ks+S)(5-11)，相当于相当于 max/2时的基质浓度时的基质浓度(g/L),是菌对基质的亲和力的一种度量。是菌对基质的亲和力的一种度量。分批培养中基质初始浓度对菌的生长的影响分分批批培培养养中中后后期期基基质质浓浓度度下下降降，代代谢谢有有害害物物积累，已成为生长限制因素，积累，已成为生长限制因素，值下降。值下降。其其快快慢慢，取取决决于于菌菌对对限限制制性性基基质质的的亲亲和和力力大大小。小。Ks小小，对对 的的影影响响较较小小，当当St接接近近0时时，急急速速下降；下降；Ks大大，随随St的的减减小小而而缓缓慢慢下下跌跌，当当St接接近近0时时，才迅速下降到零，见图才迅速下降到零，见图5.4。分批发酵中重要参数的变化分批发酵的优缺点 对不同对象，掌握工艺的重点也不同。对不同对象，掌握工艺的重点也不同。对对产产物物为为细细胞胞本本身身，可可采采用用能能支支持持最最高高生生长量的培养条件；长量的培养条件；对对产产物物为为初初级级代代谢谢物物，可可设设法法延延长长与与产产物物关联的对数生长期；关联的对数生长期；对对次次级级代代谢谢物物的的生生产产，可可缩缩短短对对数数生生长长期期，延延长长生生产产(静静止止)期期，或或降降低低对对数数期期的的生生长长速率，从而使次级代谢物更早形成。速率，从而使次级代谢物更早形成。分批发酵的优缺点 分分批批发发酵酵在在工工业业生生产产上上仍仍有有重重要要地地位位。采采用用分分批批作作业业有有技技术术和和生生物物上上的的理理由由，即即操操作作简简单单，周周期期短短，染染菌菌的的机机会会减减少少和和生生产产过过程程，产产品品质质量易掌握。量易掌握。分分批批发发酵酵不不适适用用于于测测定定其其过过程程动动力力学学，因因使使用用复复合合培培养养基基，不不能能简简单单地地运运用用Monod方方程程来来描描述述生生长长，存存在在基基质质抑抑制制问问题题，出出现现二二次次生生长长(diauxic growth)现象。现象。分批发酵的优缺点如如对基质浓度敏感对基质浓度敏感的产物，或次级代谢物，的产物，或次级代谢物，抗生素，用分批发酵不合适，因其周期抗生素，用分批发酵不合适，因其周期较短，一般在较短，一般在13天，产率较低。天，产率较低。由于养分的耗竭，无法维持下去。据此，由于养分的耗竭，无法维持下去。据此，发展了补料发展了补料-分批发酵。分批发酵。补料-分批发酵 补料补料(流加流加)-分批分批(fed-batch)发酵是在分发酵是在分批发酵过程中补入新鲜料液，以克服由批发酵过程中补入新鲜料液，以克服由于养分的不足，导致发酵过早结束。于养分的不足，导致发酵过早结束。由于只有料液的输入，没有输出，因此，由于只有料液的输入，没有输出，因此，发酵液的体积在增加。发酵液的体积在增加。(除取样外除取样外)目前工厂最常用的操作模式。目前工厂最常用的操作模式。Fed-batch准稳态补料-分批发酵恒恒化化器器的的稳稳态态和和补补料料-分分批批发发酵酵的的准准稳稳态态的的主主要要区区别别在在于于恒恒化化器器的的 是是不不变变的的，而而补补料料-分分批批发发酵酵的的 是是降降低低的。的。补料-分批发酵 补补料料-分分批批发发酵酵的的优优点点在在于于它它能能在在这这样样一一种种系系统统中中维维持持很很低低的的基基质质浓浓度度，从从而而避避免免快快速速利利用用碳碳源源的的阻阻遏遏效效应应和和能能够够按按设设备备的的通通气气能能力力去去维维持持适适当当的的发发酵酵条条件件，并且能减缓代谢有害物的不利影响。并且能减缓代谢有害物的不利影响。减少初始配料体积，有利于消毒时液面减少初始配料体积，有利于消毒时液面控制。控制。比生长速率的最佳策略 比生长速率是过程的重要参数之一，表比生长速率是过程的重要参数之一，表征生物反应器的动态特性。征生物反应器的动态特性。为了获得最大的细胞产量，应在培养期为了获得最大的细胞产量，应在培养期间使间使值最大。为此，应使培养基中的值最大。为此，应使培养基中的糖浓度保持在一最适范围。如没有现成糖浓度保持在一最适范围。如没有现成的在线葡萄糖监控仪，的在线葡萄糖监控仪，可控制可控制RQ值和乙值和乙醇浓度醇浓度。分批补料的优化 为了获得最大的产率为了获得最大的产率,需优化补料的策略。需优化补料的策略。通过一描述通过一描述比生长速率比生长速率与比生产速率与比生产速率之间的关系之间的关系的数学模型，藉最大原理的数学模型，藉最大原理(Maximum Principle)可容易获得比生长可容易获得比生长速率的最佳方案。这可以从实际分批速率的最佳方案。这可以从实际分批-补补料培养中改变补料的速率，如边界控制料培养中改变补料的速率，如边界控制实现。实现。分批补料的优化 在分批培养的前期在分批培养的前期应维持在其最应维持在其最大值，大值，max,下一阶段下一阶段应保持在应保持在c上。这种控制策略可理解为上。这种控制策略可理解为细胞生细胞生长长和和产物合成产物合成的两阶段生产步骤。的两阶段生产步骤。分批补料的优化基因工程重组干扰素高密度高表达中比生基因工程重组干扰素高密度高表达中比生长速率的控制。长速率的控制。对重组大肠杆菌对重组大肠杆菌W3110(pEC901),当当 0.336h 0.336h 0.336h-1-1,生成乙酸而且乙酸浓度随生成乙酸而且乙酸浓度随着比生长速率增大而增大。着比生长速率增大而增大。分批补料的优化 基因工程白蛋白生长相中比生长速率的基因工程白蛋白生长相中比生长速率的控制。控制。重组人血清白蛋白发酵过程生重组人血清白蛋白发酵过程生长期的代谢计算长期的代谢计算生物工程学报，生物工程学报，Vol.16 No.5,2000。结合元素平衡和代谢平衡，。结合元素平衡和代谢平衡，建立了重组人血清白蛋白发酵过程生长建立了重组人血清白蛋白发酵过程生长期的数学模型。期的数学模型。qgly=-0.05785-1.5184 可通过控制甘油补料速率来有效控制可通过控制甘油补料速率来有效控制半连续发酵 在补料在补料-分批发酵的基础上加上间歇分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液放掉部分发酵液(行业中称为带放行业中称为带放)便便可称为半连续发酵。可称为半连续发酵。半连续发酵 带放带放(bleeding)是指放掉的发酵液和是指放掉的发酵液和其它正常放罐的发酵液一起送去提其它正常放罐的发酵液一起送去提炼工段。炼工段。半连续发酵这是考虑到补料这是考虑到补料-分批发酵虽可通过补料补分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足，但由于有害代谢充养分或前体的不足，但由于有害代谢物的不断积累，产物合成最终难免受到物的不断积累，产物合成最终难免受到阻遏。阻遏。放掉部分发酵液，再补入适当料液不仅补放掉部分发酵液，再补入适当料液不仅补充养分和前体而且代谢有害物被稀释，充养分和前体而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。从而有利于产物的继续合成。半连续发酵应用 青霉素常用带放操作，实际上也同青霉素常用带放操作，实际上也同时将比生长速率控制在合适的数值。时将比生长速率控制在合适的数值。=0.012h=0.012h-1-1 使放罐体积往往大于发酵罐体积。使放罐体积往往大于发酵罐体积。半连续发酵的不足之处1)放放掉掉发发酵酵液液的的同同时时也也丢丢失失了了未未利利用用的的养养分和处于生产旺盛期的菌体；分和处于生产旺盛期的菌体；2)定定期期补补充充和和带带放放使使发发酵酵液液稀稀释释，送送去去提提炼的发酵液体积更大；炼的发酵液体积更大；3)发发酵酵液液被被稀稀释释后后可可能能产产生生更更多多的的代代谢谢有有害物，最终限制发酵产物的合成；害物，最终限制发酵产物的合成；半连续发酵的不足之处4)一些经代谢产生的一些经代谢产生的前体前体可能丢失；可能丢失；5)有利于非产生菌突变株的生长。据有利于非产生菌突变株的生长。据此，在采用此工艺时必需考虑上述此，在采用此工艺时必需考虑上述的技术上限制，不同的品种应具体的技术上限制，不同的品种应具体情况具体分析。情况具体分析。连续培养 连连续续培培养养是是发发酵酵过过程程中中一一面面补补入入新新鲜鲜的的料料液液，一一面面以以相相近近的的流流速速放放料，维持发酵液原来的体积。料，维持发酵液原来的体积。连续培养 连续培养系统又称为恒化器连续培养系统又称为恒化器(chemostat)，因培养物的生长速率，因培养物的生长速率受其周围化学环境，即受其周围化学环境，即受培养基的受培养基的一种限制性组分一种限制性组分控制。控制。连续培养 微生物培养的动力学特性，它在恒微生物培养的动力学特性，它在恒化器中的行为可用一些常数，化器中的行为可用一些常数，max，Ks，Y和和Dcrit等描述。可采用的最等描述。可采用的最大稀释速率受大稀释速率受max值的影响；值的影响；Ks值值影响残留的基质浓度，从而影响菌影响残留的基质浓度，从而影响菌浓与可利用的最大稀释速率；浓与可利用的最大稀释速率；Y值也值也影响稳态菌体浓度。影响稳态菌体浓度。连续培养连续培养临临界界稀稀释释速速率率Dcrit值值是是指指x=0，即即细细胞胞被被洗出系统的稀释速率，可用式洗出系统的稀释速率，可用式5-26表示：表示：Dcrit=maxS0/(Ks+S0)(5-26)Dcrit 受受常常数数max，Ks和和变变量量S0 的的影影响响。S0越越大大,Dcrit越越接接近近max。但但在在一一简简单单的的恒恒化化器器中中不不可可能能达达到到max值值，因因总总是是存存在着基质限制条件。在着基质限制条件。连续培养连续培养连续培养应用连续培养的方法筛选耐乙酸的高产连续培养的方法筛选耐乙酸的高产菌株菌株在培养基中增加选择性压力，抗性在培养基中增加选择性压力，抗性菌株在培养中不断被富集菌株在培养中不断被富集多级连续培养 多多级级恒恒化化器器的的优优点点是是在在不不同同级级的的罐罐内内存存在在不不同同的的条条件件。这这将将有有利利于于多多种种碳源的利用和次级代谢物的生产。碳源的利用和次级代谢物的生产。多级连续培养 如采用葡萄糖和麦芽糖混合碳源培如采用葡萄糖和麦芽糖混合碳源培养产气克雷白氏菌，在第一级罐内养产气克雷白氏菌，在第一级罐内只利用只利用葡萄糖葡萄糖，在第二级罐内利用，在第二级罐内利用麦芽糖麦芽糖，菌的生长速率远比第一级，菌的生长速率远比第一级小，同时形成次级代谢产物。小，同时形成次级代谢产物。多级连续培养连续培养中存在的问题 与分批发酵比较，连续发酵过程具有许多优与分批发酵比较，连续发酵过程具有许多优点：在连续发酵达到稳态后，其点：在连续发酵达到稳态后，其非生产占用非生产占用的时间的时间要少许多，故其设备利用率高，操作要少许多，故其设备利用率高，操作简单，产品质量较稳定，对发酵设备以外的简单，产品质量较稳定，对发酵设备以外的外围设备外围设备(如蒸汽锅炉，泵如蒸汽锅炉，泵)的利用率高，可以的利用率高，可以及时排除在发酵过程中产生的对发酵过程有及时排除在发酵过程中产生的对发酵过程有害的物质。但连续发酵技术也存在一些问题，害的物质。但连续发酵技术也存在一些问题，如如杂菌的污染杂菌的污染，菌种的稳定性菌种的稳定性问题。问题。连续培养中存在的问题对基因工程重组菌而言，连续培养对基因工程重组菌而言，连续培养的周期还与的周期还与质粒稳定性质粒稳定性有关。有关。连续培养中存在的问题连续培养中存在的问题 在分批培养中任何能在培养液中生在分批培养中任何能在培养液中生 长的杂菌将存活和增长。但在连续长的杂菌将存活和增长。但在连续培养中杂菌能否积累培养中杂菌能否积累取决于它在培取决于它在培养系统中的竞争能力养系统中的竞争能力。故用连续培。故用连续培养技术可选择性地富集一种能有效养技术可选择性地富集一种能有效使用限制性养分的菌种。使用限制性养分的菌种。连续培养 生产菌种突变问题 微微生生物物细细胞胞的的遗遗传传物物质质DNA在在复复制制过过程程中中出出现现差差错错的的频频率率为为百百万万分分之之一一。尽尽管管自自然然突突变变频频率率很很低低，一一旦旦在在连连续续培培养养系系统统中中的的生生产产菌菌中中出出现现某某一一个个细细胞胞的的突突变变，且且突突变变的的结结果果使使这这一一细细胞胞获获得得高高速速生生长长能能力力，但但失失去去生生产产能能力力的的话话，它它会会象象图图5.30b中中的的杂杂菌菌Z那那样样，最最终终取取代代系系统统中中原来的生产菌株，而使连续发酵过程失败。原来的生产菌株，而使连续发酵过程失败。生产菌种突变问题 连续培养的时间愈长，连续培养的时间愈长，所形成的突所形成的突变株数目愈多，变株数目愈多，发酵过程失败的可发酵过程失败的可能性便愈大。能性便愈大。与产物回收结合的培养与产物回收结合的培养 解决产物反馈阻遏的问题，理想办解决产物反馈阻遏的问题，理想办法是在发酵过程中产物积累时将产法是在发酵过程中产物积累时将产物及时从发酵液中分离与回收。物及时从发酵液中分离与回收。与产物回收结合的培养 按产物的理化性质，如分子大小、按产物的理化性质，如分子大小、溶解度、挥发性等，运用传统的分溶解度、挥发性等，运用传统的分离办法与发酵过程耦合，在克服产离办法与发酵过程耦合，在克服产物抑制，提高产率上取得前所未有物抑制，提高产率上取得前所未有的成就，显示出巨大的生产潜力。的成就，显示出巨大的生产潜力。膜分离与发酵的耦合 膜分离技术与发酵耦合可避免菌体丢失膜分离技术与发酵耦合可避免菌体丢失这一缺点，可排除有害代谢物，避免或这一缺点，可排除有害代谢物，避免或减轻产物的反馈阻遏，从而使得细胞高减轻产物的反馈阻遏，从而使得细胞高密度培养成为可能，更合理的利用微生密度培养成为可能，更合理的利用微生物的生产性能，以提高产率。物的生产性能，以提高产率。膜分离与发酵的耦合 对产物不是细胞本身的发酵来说，对产物不是细胞本身的发酵来说，高密度细胞培养不一定就能获得高高密度细胞培养不一定就能获得高 产率，因终产物浓度对其自身的合产率，因终产物浓度对其自身的合成是限制因素。与膜分离过程结合成是限制因素。与膜分离过程结合的生物反应器在这方面最能发挥它的生物反应器在这方面最能发挥它的特长。的特长。膜生物反应器 根根据据发发酵酵液液的的溶溶质质扩扩散散或或渗渗透透离离开开反反应应器器的的原原理理又又可可将将第第一一类类膜膜生生物物反反应应器器再再分分为为膜膜透透析析发发酵酵和和膜膜过过滤滤发酵发酵。膜生物反应器 膜透析发酵膜透析发酵是发酵液在透析膜的一侧打是发酵液在透析膜的一侧打循环，而透析液则在膜的另一侧循环，循环，而透析液则在膜的另一侧循环，发酵液中的代谢产物藉浓差扩散到透析发酵液中的代谢产物藉浓差扩散到透析液中，如图液中，如图5-13a所示。所示。膜过滤发酵膜过滤发酵是以膜作为一种过滤介质，是以膜作为一种过滤介质，发酵液边循环，边过滤，反应器中的体发酵液边循环，边过滤，反应器中的体积通过补料维持积通过补料维持,见图见图5-13b。膜分离与发酵的耦合膜分离与发酵的耦合关于膜淤塞（fouling）问题循环膜反应器的问题在于膜的淤塞和随后通循环膜反应器的问题在于膜的淤塞和随后通量的降低。量的降低。对膜过滤系统和流体流动方式作适当改进可对膜过滤系统和流体流动方式作适当改进可以缓解这一问题。以缓解这一问题。在错流过滤作业中在膜上形成的微生物滤饼在错流过滤作业中在膜上形成的微生物滤饼是过滤阻力的根源。是过滤阻力的根源。因此，分析滤饼的结构对于阐明错流过滤的因此，分析滤饼的结构对于阐明错流过滤的机制至关重要。机制至关重要。关于膜淤塞问题通常，在操作过程中培养液沿切线方向被通常，在操作过程中培养液沿切线方向被泵入膜过滤器循环，以免通量的减少。泵入膜过滤器循环，以免通量的减少。一些操作参数，如横跨膜的压力，料液一些操作参数，如横跨膜的压力，料液循环速率对过滤通量均有影响。循环速率对过滤通量均有影响。此外，流体特性，如细胞浓度和粘度，以此外，流体特性，如细胞浓度和粘度，以及膜的特性，如孔径，表面电荷，可湿及膜的特性，如孔径，表面电荷，可湿性和膜的阻力对过滤通量也有影响。性和膜的阻力对过滤通量也有影响。克服膜淤塞的措施 Back flushCross flowOperating pressureFlowing rate膜技术在提高发酵产率方面的应用膜技术在提高发酵产率方面的应用膜技术在提高发酵产率方面的应用膜技术在提高发酵产率方面的应用 Kamoshita等等(1998)设计了一种罐内设计了一种罐内安装有陶瓷膜的生物反应器，见图安装有陶瓷膜的生物反应器，见图5-16,并用于乳酸的快速发酵。这一过并用于乳酸的快速发酵。这一过滤装置可以在培养过程中进行抽滤，滤装置可以在培养过程中进行抽滤，有可以用它来有可以用它来反冲清洗反冲清洗，补充蒸馏补充蒸馏水水。膜技术在提高发酵产率方面的应用膜技术在提高发酵产率方面的应用 此过滤性能的改进提高了乳酸杆菌此过滤性能的改进提高了乳酸杆菌的生长速率与存活率，使培养液的的生长速率与存活率，使培养液的上清液的稀释速率增加，乳酸杆菌上清液的稀释速率增加，乳酸杆菌细胞浓度达到细胞浓度达到178 g/L,经经178 h培养，培养，其存活率达其存活率达98。膜技术在提高发酵产率方面的应用膜技术在提高发酵产率方面的应用 用于乳酸快速发酵，细胞浓度达到用于乳酸快速发酵，细胞浓度达到80 g/L时开始抽出上清液，并换新鲜时开始抽出上清液，并换新鲜培养基。用保留的细胞进行分批发培养基。用保留的细胞进行分批发酵，可重复酵，可重复6次。在每次发酵次。在每次发酵2个小个小时内可形成时内可形成30 g/L的乳酸。的乳酸。膜技术在提高发酵产率方面的应用膜技术在提高发酵产率方面的应用(1)有机酸有机酸(2)乙醇，丙酮，丁醇发酵方面的应用乙醇，丙酮，丁醇发酵方面的应用(3)在工程菌培养方面的应用在工程菌培养方面的应用(4)超氧岐化酶生产方面的应用超氧岐化酶生产方面的应用 膜技术在提高发酵产率方面的应用膜技术在提高发酵产率方面的应用(5)在活性污泥处理废水方面的应用在活性污泥处理废水方面的应用(6)在单克隆抗体生产在单克隆抗体生产(7)抗生素等次级代谢产物抗生素等次级代谢产物(8)维生素维生素B12发酵发酵细胞高密度培养 代谢产物的合成是靠菌代谢产物的合成是靠菌(生产者生产者)来完成的。来完成的。菌量越多，自然产量也越大，条件是菌菌量越多，自然产量也越大，条件是菌的生产力能保持在最佳状态和具备适当的生产力能保持在最佳状态和具备适当的生产条件，包括足够的产物合成所需的生产条件，包括足够的产物合成所需的基质，前体，诱导物等和没有有害代的基质，前体，诱导物等和没有有害代谢物的积累。谢物的积累。细胞高密度培养 要满足这些条件不是件轻而易举的要满足这些条件不是件轻而易举的事情。细胞高密度培养曾成功地应事情。细胞高密度培养曾成功地应用于各种代谢产物的生产，这也是用于各种代谢产物的生产，这也是它为什么一直受到重视的原因。它为什么一直受到重视的原因。研究应用概况 细胞高密度培养一般是指微生物沉没培细胞高密度培养一般是指微生物沉没培养时其细胞密度达到养时其细胞密度达到100 g/L以上的水平。以上的水平。最早应用于生产单细胞蛋白，乙醇。最早应用于生产单细胞蛋白，乙醇。采用多基质补料分批高密度发酵恒采用多基质补料分批高密度发酵恒pH下下保证硫链丝菌素获高产。保证硫链丝菌素获高产。Lee等采用高密等采用高密度细胞培养生产羟基链烷酸的效果很好。度细胞培养生产羟基链烷酸的效果很好。达到细胞高密度的手段 可用于细胞高密度培养的生物反应可用于细胞高密度培养的生物反应器类型有常用的搅拌罐，和带有外器类型有常用的搅拌罐，和带有外置式或内置式细胞持留装置的反应置式或内置式细胞持留装置的反应器，如透析膜反应器、气升式反应器，如透析膜反应器、气升式反应器、气旋式反应器与振动陶瓷瓶等。器、气旋式反应器与振动陶瓷瓶等。达到高细胞密度的手段 以上介绍的一些反应器系统用于研究是以上介绍的一些反应器系统用于研究是很有效的。很有效的。但在工业生产上，还是采用一般的搅拌但在工业生产上，还是采用一般的搅拌罐与补料工艺来进行细胞高密度培养。罐与补料工艺来进行细胞高密度培养。因它简单，且生产潜力高，适合于进行因它简单，且生产潜力高，适合于进行多参数的相关控制。多参数的相关控制。存在问题 高密度细胞培养的主要问题是：高密度细胞培养的主要问题是：在水溶液中的固体与气体物质的溶在水溶液中的固体与气体物质的溶解度解度基质对生长的限制或抑制作用基质对生长的限制或抑制作用 基质与产物的不稳定性和挥发性基质与产物的不稳定性和挥发性存在问题产物或副产物的积累达到抑制生长产物或副产物的积累达到抑制生长的的 水平水平 高的高的CO2与热的释放速率与热的释放速率 高的氧需求高的氧需求 培养基的粘度不断增加培养基的粘度不断增加达到细胞高密度的手段 为了达到高密度，需要大量的基质，为了达到高密度，需要大量的基质，在基础料耗竭后必需添加这些基质。在基础料耗竭后必需添加这些基质。常用氨常用氨(作为氮源作为氮源)来控制来控制pH。氨浓度必需保持低水平，因浓度高氨浓度必需保持低水平，因浓度高会抑制生长。会抑制生长。达到细胞高密度的手段 近年来，大肠杆菌不仅是重组蛋白的产近年来，大肠杆菌不仅是重组蛋白的产生菌，通过代谢工程也越来越多成为其生菌，通过代谢工程也越来越多成为其它类型产物，如聚羟基丁酸、质粒它类型产物，如聚羟基丁酸、质粒DNA、芳香化合物等的产生菌。芳香化合物等的产生菌。要达到细胞高密度，除了改造菌种，对要达到细胞高密度，除了改造菌种，对过程的优化也还有很大的潜力。过程的优化也还有很大的潜力。达到细胞高密度的手段 在好气培养中如碳源过量，不同的菌在好气培养中如碳源过量，不同的菌会形成的主要代谢副产物，大肠杆菌、会形成的主要代谢副产物，大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸杆菌与酿酒酵母的副枯草杆菌、乳酸杆菌与酿酒酵母的副产物分别为产物分别为乙酸、丙酸、乳酸和乙醇乙酸、丙酸、乳酸和乙醇。通常限制碳源的供给可以阻止这些副通常限制碳源的供给可以阻止这些副产物的积累。产物的积累。达到高细胞密度的手段 现代监测技术，象固有的荧光光谱，现代监测技术，象固有的荧光光谱，荧光活化细胞的检测与流通细胞测荧光活化细胞的检测与流通细胞测定仪定仪(flow cytometer)以及就地成象以及就地成象分析等的应用将会给细胞高密度培分析等的应用将会给细胞高密度培养提供更多的信息。养提供更多的信息。挥发性产物的回收与发酵耦合 膜蒸发膜蒸发(又称全蒸发又称全蒸发pervaperation，简称简称PV)Kaseno曾将此法成功地应曾将此法成功地应用于乙醇发酵。用于乙醇发酵。乙醇发酵受反应产物的抑制，其产乙醇发酵受反应产物的抑制，其产率随产物浓度的增加而减少。率随产物浓度的增加而减少。挥发性产物的回收与发酵耦合 在发酵过程中除去产物可以维持高在发酵过程中除去产物可以维持高的产率。的产率。采用一种用聚丙烯做的采用一种用聚丙烯做的疏水疏水多孔中多孔中空纤维膜组件作为乙醇选择性膜。空纤维膜组件作为乙醇选择性膜。挥发性产物的回收与发酵耦合挥发性产物的回收与发酵耦合 微孔膜过滤器微孔膜过滤器MF是在进行膜蒸发前是在进行膜蒸发前用来除去悬浮杂质包括细胞碎片的。用来除去悬浮杂质包括细胞碎片的。PV用于连续除去乙醇。用于连续除去乙醇。罐底的过滤器是用来阻止固定化颗罐底的过滤器是用来阻止固定化颗粒随发酵液流出。粒随发酵液流出。发酵罐的装量为发酵罐的装量为3L。混合或共培养系统 混混合合或或共共培培养养系系统统可可应应用用于于某某些些发发酵酵。Kondo等等(1996)采采用用运运动动发发酵酵单单孢孢菌菌与与醋醋酸酸杆杆菌菌混混合合培培养养由由葡葡萄萄糖糖生生产产乙乙酸酸，前前者者负负责责把把葡葡萄萄糖糖转转化化为为乙乙醇，后者再将乙醇转化为乙酸。醇，后者再将乙醇转化为乙酸。吸附发酵 此过程的原理是在发酵适当时机添此过程的原理是在发酵适当时机添加一种能选择性吸附产物而又对产加一种能选择性吸附产物而又对产生菌无害的吸附剂。生菌无害的吸附剂。发酵结束后，再从吸附剂洗脱回收发酵结束后，再从吸附剂洗脱回收产物。产物。吸附发酵 Stentelaire等等(2000)在香兰酸转化为在香兰酸转化为香兰素的培养中采用一种聚苯乙烯香兰素的培养中采用一种聚苯乙烯树脂，树脂，Amberlite树脂树脂XAD-2（法国（法国Rohm et Hass公司）来吸附香兰素公司）来吸附香兰素(又称香草醛又称香草醛)。吸附发酵 在在Pycnoporus cinnabarinus培养培养4天天后将树脂颗粒直接加入到发酵罐中后将树脂颗粒直接加入到发酵罐中(100 g/L)。加树脂后的第加树脂后的第3天将树脂包括菌体一天将树脂包括菌体一起过滤分离出来，用水洗涤，乙醇起过滤分离出来，用水洗涤，乙醇洗脱，可以从树脂回收总产量达洗脱，可以从树脂回收总产量达80以上的香兰素。以上的香兰素。吸附发酵 在在通通气气速速率率为为30与与90 L/h的的条条件件下下添添加加树树脂脂的的批批号号，香香兰兰素素的的生生产产明明显显提提高高，分分别别达达到到1398和和1575 mg/L，为为对对照照(不不加加树树脂脂)的的1.4和和1.3倍倍，其其分分子子转转化化率率为为69.6和和82.1，其其回回收收率为率为69.7和和90。混合或共培养系统 Tohyama等等(2000)采用一种混合培养采用一种混合培养系统，由德氏乳杆菌把葡萄糖转化系统，由德氏乳杆菌把葡萄糖转化为乳酸，再由为乳酸，再由Ralstonia eutropha将将乳酸转化为聚乳酸转化为聚-羟基丁酸羟基丁酸(PHB)。混合或共培养系统 鉴于乳酸浓度对两种菌的生长都有鉴于乳酸浓度对两种菌的生长都有影响，他们使用一种在线酶催化的影响，他们使用一种在线酶催化的乳酸和葡萄糖传感器及流动注射分乳酸和葡萄糖传感器及流动注射分析析(FIA)系统，调节葡萄糖的添加速系统，调节葡萄糖的添加速率来控制乳酸浓度在低于率来控制乳酸浓度在低于5 g/L的水的水平。平。发酵条件的影响及其控制 要想控制发酵，使其按人的意志转要想控制发酵，使其按人的意志转移，目前还不能完全办到。移，目前还不能完全办到。因影响发酵的因素实在太多。因影响发酵的因素实在太多。有些因素还是未知的，且其主要影有些因素还是未知的，且其主要影响因素也会变化。响因素也会变化。发酵条件的影响及其控制 因此了解发酵工艺条件对过程的影因此了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握菌的生理代谢和过程变化响和掌握菌的生理代谢和过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制的规律，可以帮助人们有效地控制微生物的生长和生产。微生物的生长和生产。发酵条件的影响及其控制 微生物发酵的生产水平取决于生产菌种微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件的特性和发酵条件(包括培养基包括培养基)。为此，。为此，了解生产菌种与环境条件，如培养基、了解生产菌种与环境条件，如培养基、罐温、罐温、pH、氧的供需等的相互作用，菌、氧的供需等的相