工业微生物原生质体育种和原生质体融合.pptx

第七章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合育种第一节 原生质体育种一、原生质体再生育种出发菌株的选择菌种活化和与培养原生质体制备原生质体再生高产菌株分离复筛遗传性状鉴定菌种特性和发酵特性研究二、原生质体诱变育种菌种活化和与培养原生质体制备原生质体悬浮液稀释至一定浓度，取一定放入无菌平皿中 紫外灯下诱变处理 置暗处后处理 再生培养高产菌株分离复筛遗传性状鉴定菌种特性和发酵特性研究三、原生质体转化育种菌种活化和与培养 原生质体制备离心洗涤，取原生质体悬浮液1ml，2倍SMM浓缩液和质粒DNA各0.1ml，然后加入40%聚乙二醇4000ml，混匀后静置2min,离心，悬浮于1mlHCP培养几种，适当稀释后分离在选择培养基上，双层平板培养，筛选转化子。第二节第二节 微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合育种一、定义与意义一、定义与意义 细胞融合（Cell fusion）也叫细胞杂交是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术在创造新细胞、培育新品种方面意义重大，也被广泛应用于细胞生物学和医学研究的相关领域。基因型相同的细胞融合成的融合细胞称为同核体，来自不同基因型的融合细胞则称为异核体。从融合效果上，细胞融合包括：对称融合：即两个完整的细胞间的融合。不对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整的细胞进行融合。二、发展历史细胞融合现象最初是在动物细胞中表现的。1858年发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。1875年观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生的合并现象。1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。20世纪七十年代初，华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了植物细胞融合的研究。细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞伴随者细胞融合技术的成熟。20世纪80年代，真正意义上的细胞工程诞生了，细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。三、原生质体融合育种的特点、原生质体融合育种的特点1)1)杂杂交交频频率率较较高高：细细胞胞壁壁去去除除后后在在高高渗渗条条件件下形成类似于球形的原生质体。下形成类似于球形的原生质体。2)2)受受接接合合型型或或致致育育型型的的限限制制较较小小：二二亲亲株株中中任任何何一一株株都都可可能能起起受受体体或或供供体体的的作作用用，因因此此有利于不同种属间微生物的杂交。有利于不同种属间微生物的杂交。3)3)遗遗传传物物质质传传递递更更为为完完整整：原原生生质质体体融融合合是是二二亲亲株株的的细细胞胞质质和和细细胞胞核核进进行行类类似似的的合合二二为为一的过程。一的过程。4)4)存存在在着着两两株株以以上上亲亲株株同同时时参参与与融融合合形形成成融融合子的可能性。合子的可能性。5)5)有有可可能能采采用用产产量量性性状状较较高高的的菌菌株株作作融融合合亲亲株。株。6)6)提高菌株产量的潜力较大。提高菌株产量的潜力较大。7)7)有助于建立工业微生物转化体系。有助于建立工业微生物转化体系。四、细胞融合过程显微镜下的原生质体融合显微镜下的原生质体融合融合过程中细胞膜变化类脂质分子发生扰动和重排导致细胞桥的形成细胞质、核相互融合五、原生质体融合技术原生质体制备原生质体纯化原生质体融合融合子检出融合子鉴定（一）微生物原生质体制备1、定义及特点 定义：去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体。特点：无细胞壁，可以方便地进行遗传操作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操作。具有全能性，能再生细胞壁。2、微生物细胞壁组成微生物种类不同其细胞壁结构和化学组成不同，酶解处理的有效酶也不一样，因此要求根据微生物种类特性选择合适的酶。G+:糖肽、低聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛酸磷壁酸G-：糖肽、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂蛋白、二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳糖真核细胞壁组成种类 纤维素 几丁质 其他多糖疫霉属 25 0 65毛霉属 0 9 44酵母属 0 1 60镰刀霉属 0 39 29裂褶菌数 0 5 81鬼伞属 0 33 503、制备原生质体的酶类自然界中多种生物都能合成破坏降解菌体细胞壁的酶，如蛋清中的溶菌酶，蜗牛消化酶，寄生性微生物合成酶。包括：纤维素酶酵母裂解酶几丁质酶商品酶：Novozyme234来自Trichoderma harzianumLywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶Gglucuronidase葡聚糖甘酸酶 4、影响原生质体制备的因素影响原生质体制备的因素1)1)菌体的前处理菌体的前处理 为为了了将将菌菌作作一一些些前前处处理理使使酶酶作作用用的的效效果果好好一一些，些，如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。2)2)菌体的培养时间菌体的培养时间 选择增殖期的菌体，使细胞易于原生质体化。选择增殖期的菌体，使细胞易于原生质体化。3)3)酶浓度酶浓度 对对于于不不同同种种属属的的微微生生物物，不不仅仅对对酶酶的的种种类类要要求求不不同同，对对酶酶的的浓浓度度也也有有差差异异。最最佳佳酶酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。浓度还随不同的生长期的菌体而变化。酶浓度合适，浓度太高对原生质体有破坏作用，影响原生质体的再生4)4)酶处理温度酶处理温度 :根据具体情况根据具体情况,细菌高细菌高,酵母酵母及霉菌稍低。及霉菌稍低。过高的温度使酶失活，原生质体失活；过低的温度酶活性不高，影响原生质体细胞膜稳定性5)5)破壁时的破壁时的pHpH值值:对离子强度影响较大对离子强度影响较大6)6)渗透压稳定剂渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中起到保护原生等渗透压在原生质体制备中起到保护原生质体免于膨裂，有助于酶和底物的结合，质体免于膨裂，有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和糖等有机物和KClKCl和和NaClNaCl等无机物。等无机物。5、原生质体制备程序菌体培养：液体培养 固体培养收集菌体：过滤收集、离心收集无菌水冲洗洗涤菌体：等渗液冲洗等渗液与酶液相同酶解处理：保温酶解 稀释终止酶解，离心去酶过滤分离：过滤去掉为分界菌丝体查速离心：收集大小密度均一的原生质体，低速离心其沉淀物，高速离心弃上清液，的纯化原生质体。原生质体的保存较低的温度可以有效保持原生质体的活性；细菌：48小时放线菌：24小时真菌0-4保存2天影响原生质体存活的遗传因素细菌易再生可达90%以上，有些种类也很低；小单孢菌只有10%；放线菌可达50%；丝状真菌“产黄青霉”40-60%。（二）原生质体融合1、融合亲本选育选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株 原生质体融合是一随机过程，原生质体间无亲和选择性，当两种原生质体A和B混合到一起时，发生融合的可能性有A-A/A-B/BB其中只有A-B的融合是有效的融合，概率为33.33%，当然还有多个原生质体融合到一起的可能。为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等2 2、原生质体融合的方法、原生质体融合的方法物理法、化学法及生物法。原理 增加细胞间的粘附、改变膜的通透性随机结合、融合(1)物理法电融合诱导法电融合诱导法在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子，彼此靠近，定向排列成串球状。在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄，触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融合。具体步骤DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，它们与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。染色标记细胞核的位置。特点融合率高、重复性与可控制性强。装置精巧、方便简单。可在显微镜下观察或录像融合过程。可能会造成不可恢复的细胞损伤。(2)生物法各种病毒都具有凝集细胞的能力，它一边粘接在一个细胞表面，另外一边粘接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。仙台病毒仙台病毒有若干附着点，可以同时吸附在两个细胞表面。由于病毒病毒体积很小，由一个病毒病毒吸附的两个细胞靠得极近，使细胞膜融合在一起，成为一个杂种细胞。原理与过程灭活后的病毒颗粒结合到原生质体表面。两受体细胞开始凝聚。两细胞的膜紧密结合。病毒被膜与受体细胞的浆膜融合。病毒颗粒周围的膜脱离整个膜，产生破口，在两细胞间形成细胞质通道（37下1-2min），通道继续扩大，病毒颗粒流入细胞质内，细胞质互相融合。融合细胞变圆，融合结束。特点研究最早的促融剂。毒性大而使应用受到限制。(3)化学法包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH)。PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后引起原生质体凝聚、扭曲变形、细胞膜连接处发生融合，形成很小的细胞桥，之后扩大，最终彻底融合。高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导高Ca2+机制：带负电荷间的原生质体在钙离子的连接下形成静电键钙桥，促使异源的原生质体间粘着和结合。高pH：增加Ca2+在细胞表面的黏附，从而促进两原生质体的接触。进一步提高了PEG法的效率。(4)方法选择具体应用时要根据不同对象选择不同的细胞融合方法和条件。诱导动物细胞融合，仙台病毒HVJ诱导、PEG法、电融合法都适用；植物细胞融合常用PEG法和电融合法；微生物细胞融合多采用PEG法。（三）融合体的再生1、再生培养基：应具备维系、保护、支持和营养的 功能1）用硫酸镁、甘露醇、山梨糖、蔗糖为渗透剂，不 同的微生物种类应选择不同的再生培养基；2）营养因子：酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖类；3）原生质体保护剂扩张剂的作用 牛血清白蛋白、人血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷 酮、明胶等对原生质体具有保护作用，同时起到 原生质体扩张剂作用，次级原生质体再生作用；4）加入再生细胞壁诱导物及前体物质 在培养基中加入明胶、细胞壁残片甚至席位苏滤膜都有刺激原生质体再生的功能。2、再生培养温度 过高温度对原生质体再生有一只作用，当再生温度略低于菌株培养温度时，有利于原生质体的再生3、操作方式涂布培养法对原生质体有损坏4、固体培养 一般认为固体培养优于液体培养。液体培养时细胞壁可溶性物质很容易扩散（如酵母在液体再生液中很难再生）；固体培养基限制有效分子的扩散，但先在液体培养基中预培养2-3小时有利于提高再生率。（四）融合细胞筛选1、筛选的原因与必要性细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后细胞将以多种形式出现，需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。问题：A与B融合过程中，你能预见有哪些形式的细胞吗？A-B，A-A，B-B。A-A-A，B-B-B等多聚体。未融合的A，B。2、杂种细胞筛选方法（1）选择性培养基筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞的方法。例如：利用抗性标记、酶缺陷型、激素需求差异等。亲本原生质体生长要求外源激素，而有的杂种细胞由于双亲互补作用会产生内激素，从而使杂种细胞能在无激素的培养基上生长例子：利用抗性标记进行的融合细胞筛选2）原生质体灭活：诱变形成的遗传标记往往也会使一些优良性状被丧失，对以选育生产性状为目标的育种不能实现，可采用灭活原生质体法作为检出标记，如采用碘代乙酰胺灭活处理真菌原生质体，使处理后的原生质体失去再生能力，而对真菌遗传特性无损伤，当两种采取不同灭活剂处理的原生质体融合后，可以完成代谢互补，是融合子回复再生能力。3）荧光染色：在获得原生质体后，分别用不同的英冠素染色亲本原生质体，随后融合，融合子于紫外光显微镜下挑取融合子（融合子发出两种亲本的颜色）。4）再生后杂种与亲本形态、性质差异 重组子的检出方法有两种重组子的检出方法有两种：直接法直接法 将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子 间接法间接法 把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落使亲株和重组子都再生成菌落 ，然后用影印，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子法将它们复制到选择培养基上检出重组子。融合重组的频率融合重组的频率 =融合重组子融合重组子 两亲株原生质体再生菌落的总数两亲株原生质体再生菌落的总数 远缘亲本原生质体融合远缘亲本原生质体融合构成的杂合体在遗传体系上存在差异，两套基因组能否协同作用，会导致基因组稳定性的问题，两套基因组的共同飙到，选择表达也是有待继续研究的问题。