微生物的培养基.pptx

定义定义：指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的谢产物用的的营养基质，（混合养料）。（混合养料）。特点：特点：任何培养基都应具备微生物所需要的六大营任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素（养要素（碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水水），且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。），且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。第二节第二节 微生物的培养基微生物的培养基用途：用途：促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品。因此，它是进行科学研究，保藏；制备微生物制品。因此，它是进行科学研究，发酵生产微生物制品等的基础发酵生产微生物制品等的基础 一、培养基的配制原则一、培养基的配制原则（一）培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）（一）培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）（二）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）（二）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）（三）物理化学条件适宜（条件适宜）（三）物理化学条件适宜（条件适宜）（四）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）（四）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）培养基的配制培养基的配制4 4个原则个原则1 1、目的明确、目的明确 培养何菌？培养何菌？自养菌？异养菌？；自养菌？异养菌？；种子菌？发酵菌？；种子菌？发酵菌？；实验用？生产用？实验用？生产用？收获何物？收获何物？收获菌体？收获产物？产物成分含氮如何？收获菌体？收获产物？产物成分含氮如何？例如枯草芽孢杆菌：例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或一般培养：肉汤培养基或LB培养基；培养基；自然转化：基础培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；根据不同的工作目的，微生物不同的营养需根据不同的工作目的，微生物不同的营养需要，运用自己丰富的生物化学和微生物学知识来要，运用自己丰富的生物化学和微生物学知识来配制最佳的培养基。配制最佳的培养基。2 2、营养协调、营养协调 基本遵循基本遵循1010倍递减关系倍递减关系 注重注重C/NC/N比比 H H2 20 0（1010-1-1）C C（1010-2-2）N N （1010-3-3）（P P、S S）（1010-4-4）K K、Mg Mg（1010-5-5）生长因子生长因子（1010-6-6）培养基的配制培养基的配制4 4个原则个原则实验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏放线菌：高氏1号合成培养基培养；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：霉菌：查氏合成培养基；查氏合成培养基；实验室一般培养：普通常用培养基；实验室一般培养：普通常用培养基；遗传研究：成分清楚的合成培养基；遗传研究：成分清楚的合成培养基；（1 1）选择适宜的营养物质）选择适宜的营养物质营养物质的浓度适宜；营养物质的浓度适宜；营养物质之间的配比适宜；营养物质之间的配比适宜；高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。菌作用。（2 2）营养物质浓度及配比合适）营养物质浓度及配比合适培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中累，其中碳氮比（碳氮比（C CN N）的影响较大。的影响较大。发酵生产谷氨酸时：发酵生产谷氨酸时：碳氮比为碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；碳氮比为碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。3 3、理化适宜、理化适宜 （1 1）pH pH（2 2）渗透压与水活度）渗透压与水活度 （3 3）氧化还原电位）氧化还原电位培养基的配制培养基的配制4 4个原则个原则细菌：细菌：pH 7.08.0放线菌：放线菌：pH 7.58.5酵母菌：酵母菌：pH 3.86.0霉菌：霉菌：pH 4.05.8藻类：藻类：pH 6.07.0原生动物：原生动物：pH 6.08.0初始初始pHpH通常培养条件：通常培养条件：（1 1）pHpH生长过程需要及时调节：缓冲液、生长过程需要及时调节：缓冲液、CaCO3CaCO3、NaHCO3NaHCO3及外及外源调节源调节（2 2）渗透压和水活度）渗透压和水活度渗透压渗透压（osmotic pressure）是某水溶液中一是某水溶液中一个可用压力来量度的一个物化指标。个可用压力来量度的一个物化指标。与微生物细胞渗透压相等的与微生物细胞渗透压相等的等渗溶液等渗溶液最适宜微生物最适宜微生物的生长；的生长；高渗溶液高渗溶液会使细胞发生质壁分离；会使细胞发生质壁分离；低渗溶液低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，形成很高的膨压，则会使细胞吸水膨胀，形成很高的膨压，这对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞，例如原生质这对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞，例如原生质体、球状体或支原体来说，则是致命的。体、球状体或支原体来说，则是致命的。表示在天然或人为环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。水活度即水活度即a aw w（wateractivitywateractivity）水活度定量涵义为：在同温同压下，水活度定量涵义为：在同温同压下，某溶液的蒸汽压某溶液的蒸汽压纯水蒸汽压纯水蒸汽压a aw w该溶液的该溶液的百分相对湿度值百分相对湿度值（ERHERH，equilibrium relative humidity）a aw w（3 3）氧化还原电位（）氧化还原电位（EhEh ）好氧性微生物：好氧性微生物：+0.1+0.1伏以上时可正常生长，伏以上时可正常生长，以以+0.3+0.3+0.4+0.4伏为宜；伏为宜；厌氧性微生物：低于厌氧性微生物：低于+0.1+0.1伏条件下生长；伏条件下生长；兼性厌氧微生物：兼性厌氧微生物：+0.1+0.1伏以上时进行好氧呼吸，伏以上时进行好氧呼吸，+0.1 +0.1伏以下时进行发酵。伏以下时进行发酵。还原剂释放电子与氧化剂接受电子的趋势还原剂释放电子与氧化剂接受电子的趋势4 4、经济节约、经济节约 以粗代精、以废代好、以简代繁以粗代精、以废代好、以简代繁 以国代进等等以国代进等等培养基的配制培养基的配制4 4个原则个原则二二 培养基的配制培养基的配制4 4种方法种方法l生态模拟生态模拟 l参阅文献参阅文献 l精心设计精心设计 l实验比较实验比较一一、培养基的类型和用途、培养基的类型和用途根据成分分：根据成分分：根据状态分：根据状态分：根据主要成分或使用目的分根据主要成分或使用目的分：根据生产工业的要求分：根据生产工业的要求分：合成培养基合成培养基（高氏培养基、察氏培养基等高氏培养基、察氏培养基等）半合成培养基半合成培养基（牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖培养基（牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖培养基天然培养基天然培养基（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末等）（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末等）基础培养基基础培养基增殖培养基增殖培养基鉴别培养基鉴别培养基选择培养基选择培养基孢子培养基孢子培养基供制备孢子用；供制备孢子用；种子培养基种子培养基满足菌种生长；满足菌种生长；发酵培养基发酵培养基满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累固体培养基固体培养基半固体培养基半固体培养基液体培养基液体培养基（一）按培养基成分的了解作分类（一）按培养基成分的了解作分类1 1、天然培养基、天然培养基 用天然成分制成的培养基用天然成分制成的培养基 优点：营养丰富、价格低廉优点：营养丰富、价格低廉 缺点：成分不清楚、不稳定缺点：成分不清楚、不稳定 适于：菌种培养、发酵生产适于：菌种培养、发酵生产 例如，培养酵母菌的例如，培养酵母菌的麦芽汁培养基麦芽汁培养基等。等。2 2、组合培养基（合成培养基）、组合培养基（合成培养基）高纯度化学试剂配制的培养基高纯度化学试剂配制的培养基 优点：成分精确、重现性高优点：成分精确、重现性高 缺点：价格较高、微生物生长一般缺点：价格较高、微生物生长一般 适于：生理、生化、代谢、菌种鉴定研究等适于：生理、生化、代谢、菌种鉴定研究等例如，培养细菌的例如，培养细菌的葡萄糖铵盐培养基葡萄糖铵盐培养基，培养放线菌的培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基淀粉硝酸盐培养基（即（即高氏一号培养基高氏一号培养基），），培养真菌的培养真菌的蔗糖硝酸盐培养基蔗糖硝酸盐培养基（即（即察氏培养基察氏培养基）等。等。3 3、半组合培养基、半组合培养基 化学试剂化学试剂 +天然成分天然成分 实际应用过程中大多数为半组合培养基实际应用过程中大多数为半组合培养基例如，培养真菌的例如，培养真菌的马铃薯蔗糖培养基马铃薯蔗糖培养基 等。等。四种菌的实验室常用培养基四种菌的实验室常用培养基（1 1）牛肉膏蛋白胨培养基）牛肉膏蛋白胨培养基-细菌细菌 牛牛肉肉膏膏 3g 3g，蛋蛋白白胨胨 10g10g，氯氯化化纳纳 5g5g，琼琼脂脂1520g1520g，水，水 1000ml1000ml，pH7.0-7.2 pH7.0-7.2（2 2）高氏一号培养基高氏一号培养基-放线菌放线菌 可可溶溶性性淀淀粉粉 20g20g，KNOKNO3 3 1g1g，K K2 2HPOHPO4 4 0.5g 0.5g，NaCL NaCL 0.5g0.5g，MgSOMgSO4 4.7H2O.7H2O 0.5g0.5g，FeSOFeSO4 4 0.01g 0.01g，琼脂琼脂1520g1520g，水，水1000ml pH7.2-7.4 1000ml pH7.2-7.4 4种菌的实验室常用培养基种菌的实验室常用培养基（3 3）马丁氏培养基马丁氏培养基-霉菌霉菌 K K2 2HPO4 HPO4 IgIg，MgSOMgSO4 4.7H2O.7H2O 0.5g0.5g，蛋蛋白白胨胨 5g5g，葡葡萄萄糖糖 10g 10g，H H2 2O O 1000ml 1000ml，各各成成分分溶溶解解后后，加加入入1 1孟加拉红孟加拉红3.3ml,3.3ml,琼脂琼脂1520g1520g 自然自然PHPH （4 4）马铃薯马铃薯葡萄糖葡萄糖培养基培养基-酵母菌酵母菌 马铃薯马铃薯200g,200g,葡萄糖葡萄糖 20g20g,琼脂琼脂1520g1520g,H2O H2O 1000ml,1000ml,自然自然PH.PH.马铃薯去皮马铃薯去皮,切成小块切成小块,煮沸煮沸0.50.5小时小时,用纱布过用纱布过滤滤,再加糖或琼脂再加糖或琼脂,融化后补水至融化后补水至10001000mlml1 1固体培养基：外观呈固态的培养基固体培养基：外观呈固态的培养基 （1 1）天天然然固固体体培培养养基基：天天然然固固体体状状基基质质直直接接制制成成的的培培养养基。如，麸皮、米糠、稻草粉配制的真菌培养基基。如，麸皮、米糠、稻草粉配制的真菌培养基 （2 2）非非可可逆逆性性固固体体培培养养基基：由由血血清清凝凝固固成成或或无无机机硅硅胶胶配配制的培养基。适合于分离自养型微生物。制的培养基。适合于分离自养型微生物。（3 3）凝凝固固培培养养基基：液液体体培培养养基基中中加加入入1-2%1-2%琼琼脂脂或或5-12%5-12%明胶作凝固剂，加热融化，冷却后凝固。明胶作凝固剂，加热融化，冷却后凝固。固体培养基为微生物提供了一个营养表面，可以形固体培养基为微生物提供了一个营养表面，可以形成单个菌落，在微生物的分离、鉴定、计数、保藏成单个菌落，在微生物的分离、鉴定、计数、保藏等方面起重要作用。等方面起重要作用。（二）按培养基外观的物理状态作分类（二）按培养基外观的物理状态作分类2 2半固体培养基：半固体培养基：一般用一般用0.2%-0.7%0.2%-0.7%琼脂作凝固剂琼脂作凝固剂 用用作作观观察察细细菌菌的的运运动动特特征征、噬噬菌菌体体效效价价、各各种种厌氧菌的培养机菌种保藏等。厌氧菌的培养机菌种保藏等。3 3液体培养基：液体培养基：不含任何凝固剂，它常用于大规模的工业不含任何凝固剂，它常用于大规模的工业生产及实验室进行微生物生理代谢等研究。生产及实验室进行微生物生理代谢等研究。凝固剂必须具有的特点：凝固剂必须具有的特点：a.a.不被微生物液化、分解和利用不被微生物液化、分解和利用b.b.在微生物生长的范围内保持固体状在微生物生长的范围内保持固体状态态c.c.凝固点的温度对微生物无害凝固点的温度对微生物无害d.d.不因消毒灭菌的高温处理而破坏不因消毒灭菌的高温处理而破坏e.e.配制方便、价格低廉配制方便、价格低廉f.f.透明度好、粘着力强透明度好、粘着力强常用的常用的凝固剂凝固剂琼脂（琼脂（agar）、明胶（明胶（gelatin）、海藻酸钠（海藻酸钠（alginate）、）、琼脂是最优良的凝固剂，自琼脂是最优良的凝固剂，自18801880年代开始用年代开始用于配制微生物培养基以来，至今经久不衰。于配制微生物培养基以来，至今经久不衰。1.1.基础培养基基础培养基（minimum media）在一定条件下在一定条件下含有某类微生物生长繁殖含有某类微生物生长繁殖所需的基本营养物质所需的基本营养物质的培养基，也称为的培养基，也称为基基本培养基本培养基。（三）按培养基对微生物的功能分类（三）按培养基对微生物的功能分类2.2.加富培养基加富培养基（enriched media）在普通培养基中在普通培养基中加入某些特殊营养物质加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富制成的一类营养丰富的培养基。用来培养的培养基。用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物。营养要求比较苛刻的异养型微生物。Eg.培养百日咳博德氏菌（培养百日咳博德氏菌（Bordetella pertussis）需要需要含有血液的加富培养基。含有血液的加富培养基。这些特殊营养物质包括这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液动植物组织液等。等。3.3.增殖培养基增殖培养基（complete media）在普通培养基中在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，增加这种微生物的繁殖速度，欢的营养物质，增加这种微生物的繁殖速度，逐逐渐淘汰其他微生物，这种培养基称为渐淘汰其他微生物，这种培养基称为增殖培养基增殖培养基。常用于菌种筛选。常用于菌种筛选。Eg.要分离出能利用石蜡油进行发酵的酵母菌，要分离出能利用石蜡油进行发酵的酵母菌，只需在配方里使用石蜡油作碳源。只需在配方里使用石蜡油作碳源。4.4.选择性培养基选择性培养基（selected media）一类根据某微生物的一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。于菌种筛选等领域。例如，在培养基中加入例如，在培养基中加入链霉素、氯霉素链霉素、氯霉素可以抑可以抑制原核微生物的生长，这种培养基用于分离真制原核微生物的生长，这种培养基用于分离真菌。菌。用于鉴别某种或某一类微生物的培养基。用于鉴别某种或某一类微生物的培养基。一一般般通通过过加加入入某某些些试试剂剂，使使某某种种或或某某类类微微生生物物的菌落发生的菌落发生颜色变化颜色变化，便于区别。，便于区别。5.5.鉴别培养基：鉴别培养基：EMBEMB培养基培养基 伊红伊红 美蓝美蓝-苯胺染料，抑制苯胺染料，抑制G+G+菌菌 低酸下低酸下-两种染料结合两种染料结合 大肠杆菌分解乳糖产酸大肠杆菌分解乳糖产酸 -菌落深紫色、菌落表面有绿色金属光泽菌落深紫色、菌落表面有绿色金属光泽 鉴别培养基也具有选择革兰氏阴性菌的作用。鉴别培养基也具有选择革兰氏阴性菌的作用。（四）发酵工厂的培养基（四）发酵工厂的培养基1.1.孢子培养基孢子培养基:供菌种繁殖孢子供菌种繁殖孢子2.2.种子培养基种子培养基:供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮，成为活力强的并使菌丝体长得粗壮，成为活力强的种子种子.3.3.发酵培养基发酵培养基:是供菌体生长、繁殖和合成产物之用。是供菌体生长、繁殖和合成产物之用。三、培养基的配制三、培养基的配制配料配料溶解溶解调调pHpH过滤过滤分装分装灭菌灭菌包扎包扎摆斜面摆斜面贮存贮存1.1.配料配料 在容器中加入少量水在容器中加入少量水按照配方正确称取各种药品（依次加入）按照配方正确称取各种药品（依次加入）自然水自然水蒸馏水蒸馏水加足所需水量加足所需水量2.2.溶解溶解 加热溶解，特别是加有琼脂的培养基，加热溶解，特别是加有琼脂的培养基，一定要煮沸，琼脂的熔解温度一定要煮沸，琼脂的熔解温度9597，且需要边加热边搅拌以防止烧焦且需要边加热边搅拌以防止烧焦(小火煮沸小火煮沸2030分钟分钟,沸腾期间注意补水沸腾期间注意补水)3.3.调调pHpH 用用1N的盐酸或的的盐酸或的1N NaOH把培养基调节到把培养基调节到所要求的值。所要求的值。4.4.过滤过滤滤纸或棉花进行过滤。滤纸或棉花进行过滤。5.5.分装分装一般培养基放在三角瓶或试管中灭菌使用一般培养基放在三角瓶或试管中灭菌使用静置培养静置培养:则则100 ml培养基培养基250 ml的三角瓶，最多不的三角瓶，最多不能超过能超过150 ml培养基培养基250 ml的三角瓶的三角瓶，否则灭菌时否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞，造成染菌；培养基沸腾容易污染棉塞，造成染菌；若作摇瓶培养，则若作摇瓶培养，则1520 ml培养基培养基250 ml的三角瓶，的三角瓶，保证通气良好。保证通气良好。（1）三角瓶）三角瓶液体培养基一般装液体培养基一般装45 ml，约试管的约试管的14高度；高度；固体斜面培养基一般装固体斜面培养基一般装34 ml，约试管的约试管的15高高度。度。（2）试管分装）试管分装6.6.包扎包扎分装好后，塞上棉塞，在用牛皮纸将棉塞包裹好，分装好后，塞上棉塞，在用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。7.7.灭菌灭菌按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽灭菌。如果灭菌的温度太高，营养成分会灭菌。如果灭菌的温度太高，营养成分会被破坏，培养基中的糖、氨基酸会使培养被破坏，培养基中的糖、氨基酸会使培养基的颜色变深。基的颜色变深。8.8.摆斜面摆斜面灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放，使其灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放，使其凝固成为一个斜面，约占试管长度的凝固成为一个斜面，约占试管长度的12。9.9.贮存贮存培养基在培养基在30下放置一天，无污染的即可使用。下放置一天，无污染的即可使用。一般用牛皮纸包裹好存放于一般用牛皮纸包裹好存放于4冰箱中备用。冰箱中备用。高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌 一般培养基一般培养基:1.05 Kg/cm2,121.3,15-30 min 含糖培养基含糖培养基:0.56 Kg/cm2,112.6,15-30 min 过滤灭菌过滤灭菌,分别灭菌分别灭菌,间歇灭菌的应用间歇灭菌的应用附附2：培养基的灭菌：培养基的灭菌附图：过滤灭菌附附3：器皿的灭菌及无菌室的消毒：器皿的灭菌及无菌室的消毒器皿的灭菌：器皿的灭菌：干热空气：干热空气：160，2 小时小时无菌室的消毒：无菌室的消毒：紫外光紫外光 化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）甲醛）