酶工程酶的结构和功能.pptx

第六章 酶的结构和功能一、酶的活性中心一、酶的活性中心二、酶活性中心化学基团的鉴定二、酶活性中心化学基团的鉴定三、组成酶活性中心的重要化学基团三、组成酶活性中心的重要化学基团四、酶促化学修饰和酶活性调节四、酶促化学修饰和酶活性调节五、酶的空间结构与功能的关系五、酶的空间结构与功能的关系六、酶催化作用的机制六、酶催化作用的机制七、羧肽酶七、羧肽酶A催化作用的机制催化作用的机制一、酶的活性中心1酶的活性中心和必需基团的概念酶的活性中心和必需基团的概念 在在酶酶蛋蛋白白中中，只只有有少少数数特特异异的的氨氨基基酸酸残残基基与与催催化化活活性性直直接接相相关关。这这些些特特异异的的氨氨基基酸酸残残基基可可以以在在肽肽链链的的一一级级结结构构上上相相距距较较远远，但但通通过过肽肽链链的的折折叠叠、盘盘旋旋，使使它它们们在在空空间间上上接接近近，形形成成活活性性中中心心（或或称称活活性性部部位位）。组组成成活活性性中中心心的的氨氨基基酸酸残残基基有有些些执执行行结结合合底底物物的的任任务务，有有些些执执行行催催化化反反应应的的任任务务。我我们们把把组组成成活活性性中中心心的的氨氨基基酸酸残残基基的的侧侧链链基基团团及及一一些些维维持持整个酶分子构象所必需的侧链基团称为必需基团。整个酶分子构象所必需的侧链基团称为必需基团。酶的活性中心示意图A、B、C为活性中心的必需基团为活性中心的必需基团酶分子中氨基酸残基的分类 1960年年，Koshland将将酶酶分分子子中中的的氨氨基基酸酸残残基基或或其其侧侧链链基基团团分分成成4类类：接接触触残残基基（直直接接与与底底物物接接触触，参参与与结结合合或或催催化化的的残残基基），辅辅助助残残基基（对对接接触触残残基基的的功功能能起起辅辅助助作作用用的的残残基基，也也位位于于活活性性中中心心），结结构构残残基基（维维持持构构象象的的残残基基，此此为为活活性性中中心心以以外外的的必必需需基基团团），非非贡贡献献残残基基（或或称称非非必必需需残残基基，非非必必需需只只是是对对酶酶发发挥挥活活性性而而言言，它它们们可可能能有有其其他他作作用用，如如识别自身物质、运输、防止降解等）。识别自身物质、运输、防止降解等）。接接触触残残基基：R1、R2、R6、R8、R9、R163、R164、R165辅助残基：辅助残基：R4结构残基结构残基：R10、R162、R169非贡献残基：非贡献残基：R3、R5、R7 各种类型残基举例2 2酶活性中心的拓扑学 酶的活性中心可以酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条设想为一个口袋或是一条沟槽，形状与底物相近沟槽，形状与底物相近。不同的酶的口袋适合不。不同的酶的口袋适合不同的底物。口袋中有相应的结合残基与底物上的同的底物。口袋中有相应的结合残基与底物上的某些基团结合，发生反应的底物上的键与催化基某些基团结合，发生反应的底物上的键与催化基团靠近。团靠近。亲水基团与亲水残基亲合，疏水基团与亲水基团与亲水残基亲合，疏水基团与疏水残基亲合，带电荷的基团与带相反电荷的残疏水残基亲合，带电荷的基团与带相反电荷的残基亲合基亲合。羧肽酶A活性中心的结构 羧羧肽肽酶酶A催催化化多多肽肽链链上上羧羧基基端端氨氨基基酸酸的的水水解解。当当末末端端氨氨基基酸酸是是含含有有较较大大疏疏水水基基团团的的氨氨基基酸酸时时（苯苯丙丙氨氨酸酸、缬缬氨氨酸酸、亮亮氨氨酸酸、异异亮亮氨氨酸酸），反反应应速速度度很很快快。但但是是当当有有这这些些较较大大疏疏水水基基团团的的氨氨基基酸酸残残基基进进入入亚亚位位点点36时时，就就会会减减低低酶酶对对这这些些底底物物的的亲亲和和力力。说说明明羧羧肽肽酶酶A对对底底物物的的识识别别和和结结合合有有多多个个位位点点。同同时时，苯苯丙丙氨氨酸酸是是羧羧肽肽酶酶A的的竞竞争争性抑制剂。性抑制剂。羧肽酶A活性中心的结构示意图return二、酶活性中心化学基团的鉴定常用的方法有常用的方法有:化学修饰法化学修饰法反应动力学法反应动力学法x-光晶体衍射法光晶体衍射法1.化学修饰法 酶酶分分子子中中有有许许多多氨氨基基酸酸残残基基的的侧侧链链基基团团可可以以被被化化学学修修饰饰，如如羟羟基基、巯巯基基、咪咪唑唑基基、氨氨基基、羧羧基基等等。如如果果一一个个基基团团是是必必需需的的，则则被被修修饰饰后后酶活性会大大下降，甚至完全失活酶活性会大大下降，甚至完全失活。（1）使用非特异性试剂对特殊基团的标记 非非特特异异性性试试剂剂可可以以修修饰饰特特定定的的某某种种基基团团，但但不不能能区区分分活活性性中中心心内内部部和和外外部部的的基基团团。如如果果某某种种基基团团只只存存在在于于活活性性中中心心，而而其其他他部部位位没没有有，就可以用就可以用非特异性试剂修饰非特异性试剂修饰。木瓜蛋白酶的非特异性试剂修饰 木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶（papain）分分子子中中有有7个个半半胱胱氨氨酸酸残残基基，其其中中的的6个个形形成成3对对二二硫硫键键，只只有有一一个个以以自自由由巯巯基基的的形形式式存存在在于于活活性性中中心心（Cys22-63，Cys56-95，Cys153-200，自自由由Cys25；编编号号从从N端端开开始始往往C端端进进行行）。在在这这种种情情况况下下就就可可以以用用任任何何一一种种硫硫氢氢基基试试剂剂来来修修饰饰，如如用用碘碘乙乙酸酸修修饰饰。碘碘乙乙酸酸对对木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶的的活活性性中中心心无无任任何何特特殊殊亲亲和和力力，但但由由于于这这种种特特殊殊情情况况，仍仍然然得得到到了了巯基的修饰与酶活性的丧失相平行的结果。巯基的修饰与酶活性的丧失相平行的结果。木瓜蛋白酶的非特异性试剂修饰 通通过过动动力力学学实实验验证证实实，还还有有一一个个组组氨氨酸酸残残基基的的咪咪唑唑基基位位于于木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶活活性性中中心心的的催催化化部部位位（木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶共共有有212个个氨氨基基酸酸，有有His81和和His159两两个个His）。Husain和和Lowe用用1,3-二二溴溴丙丙酮酮修修饰饰木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶，在在pH5.6，1克克当当量量的的试试剂剂完完全全抑抑制制了了木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶的的活活性性。对对修修饰饰后后的的酶酶进进行行氨氨基基酸酸分分析析，发发现现少少一一个个组组氨氨酸酸。在在用用1,3-二二溴溴丙丙酮酮（2-14C）的的修修饰饰实实验验中中，发发现现修修饰饰剂剂连连接接了了Cys-25和和His-159两两个个残残基基，因因此此知知道道了了这这两两个个基基团团之之间间的的距距离离在在 5以以内内。这这个个结结论论通通过过x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。光衍射分析法又进一步得到了肯定。酶活性部位微环境的影响 由由于于酶酶活活性性部部位位微微环环境境的的影影响响，活活性性中中心心的的基基团团对对某某一一非非特特异异性性试试剂剂的的反反应应性性可可能能会会比比活活性性中中心心以以外外的的基基团团的的反反应应性性高高或或低低。如如3-磷磷酸酸甘甘油油醛醛脱脱氢氢酶酶的的活活性性中中心心的的Ser能能优优先先地地被被14C-碘碘乙乙酸酸标标记记；牛牛胰胰核核糖糖核核酸酸酶酶活活性性中中心心的的His能能优优先先地地被被碘碘乙乙酸酸标标记记，其其Lys-41的的NH2可可优优先先地地被被氟氟二二硝硝基基苯苯标标记记。也也有有些些酶酶活活性性中中心心的的基基团团对对某某种种非非特特异异性性试试剂剂的的反反应性很低。应性很低。要充分利用要充分利用高反应性高反应性的情况。的情况。（2 2）差示标记法 这这种种方方法法是是非非特特异异性性试试剂剂标标记记法法的的一一个个发发展展。它它利利用用竞竞争争性性抑抑制制剂剂或或底底物物预预先先占占据据活活性性中中心心，使使非非特特异异性性试试剂剂只只修修饰饰活活性性中中心心以以外外的的基基团团，然然后后透透析析除除去去保保护护剂剂（即即竞竞争争性性抑抑制制剂剂或或底底物物），再再用用同同位位素素标标记记的的非非特特异异性性试试剂剂修修饰饰活活性性中中心心的的基基团团。经经氨氨基基酸酸分分析析可可知知哪哪些些基基团位于活性中心。团位于活性中心。差示标记法胰蛋白酶的差示标记 胰胰蛋蛋白白酶酶催催化化碱碱性性氨氨基基酸酸的的羧羧基基形形成成的的肽肽键键水水解解。人人们们认认为为在在胰胰蛋蛋白白酶酶的的活活性性中中心心必必有有酸酸性性基基团团存存在在。胰胰蛋蛋白白酶酶（Lys6-Ile7之之间间断断裂裂成成为为胰胰蛋蛋白白酶酶；Lys6-Ile7和和Lys131-Ser132两两处处断断裂裂成成为为胰胰 蛋蛋 白白 酶酶；Lys6-Ile7、Lys131-Ser132和和 Lys176-Asp177三三处处断断裂裂成成为为胰胰蛋蛋白白酶酶）失失去去了了水水解解碱碱性性氨氨基基酸酸的的羧羧基基形形成成的的肽肽键键的的能能力力，而而保保留留了了一一般般的的酯酯酶酶活活性性，估估计计Asp177的的COOH可可能能与与结结合合底物有关（与底物中的碱性氨基酸结合）。底物有关（与底物中的碱性氨基酸结合）。胰蛋白酶的差示标记 Eyl和和Inagami的的实实验验证证明明了了上上述述推推测测。他他们们用用苯苯甲甲脒脒（benzamidine，C6H5C(=NH)NH2）作作为为胰胰蛋蛋白白酶酶的的竞竞争争性性抑抑制制剂剂，以以1-乙乙基基-3-二二甲甲氨氨丙丙基基碳碳二二亚亚 胺胺 为为 缩缩 合合 剂剂（1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide，C2H5-N=C=N-(CH2)3-N(CH3)2），以以甘甘氨氨酰酰胺胺（glycineamide）为为修修饰饰剂剂，以以差差示示标标记记法法证证明明了了Asp177是是结结合合底底物物的的一一个个基基团团。酶酶的的羧羧基基与与甘甘氨氨酰酰胺胺以以酰酰胺胺键键结结合合后后几几乎乎完完全全抑抑制制了了酶酶水水解解N-苯苯甲甲酰酰基基-L-精精氨氨酸酸乙乙酯酯（N-benzoyl-L-arginineethylester）的能力。）的能力。胰蛋白酶的差示标记差示标记法的缺点 有时加了保护剂后使有些有时加了保护剂后使有些活性中心外的活性中心外的可修饰基团不能被修饰可修饰基团不能被修饰，也有时不能完全阻，也有时不能完全阻止对活性中心基团的修饰，这是差示标记法止对活性中心基团的修饰，这是差示标记法的缺点。的缺点。（3 3）亲和标记AKs型亲和标记型亲和标记 亲亲和和标标记记是是以以带带有有高高反反应应性性基基团团的的底底物物类类似似物物与与酶酶的的活活性性中中心心结结合合，然然后后高高反反应应性性基基团团与与酶酶活活性性中中心心的的基基团团反反应应，形形成成共共价价结结合合，这这称称为为Ks型型亲亲和和标标记记。如如胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶用用TPCK亲和标记，胰蛋白酶用亲和标记，胰蛋白酶用TLCK亲和标记。亲和标记。Ks型亲和标记物举例胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶Ks型型亲和标记物亲和标记物胰胰蛋蛋白白酶酶Ks型型亲和标记物亲和标记物Ks型亲和标记物举例磷酸丙糖异构酶的底物磷酸丙糖异构酶的底物 Ks型亲和标记物型亲和标记物 （二羟丙酮磷酸）（二羟丙酮磷酸）BKcat 型亲和标记 Kcat型型修修饰饰剂剂的的专专一一性性不不仅仅取取决决于于修修饰饰剂剂与与酶酶结结合合的的亲亲和和力力，而而且且取取决决于于它它作作为为酶酶的的底底物物的的有有效效性性。这这种种修修饰饰剂剂具具有有潜潜在在的的化化学学反反应应基基团团，当当它它被被酶酶作作用用后后转转变变成成有有高高度度化化学学反反应应性性能能的的基基团团，与与酶酶的的活活性性中中心心共共价价结结合合，因因此此这这类类化化合合物物又称为又称为“自杀底物自杀底物（suicidesubstrate）”。Kcat 型亲和标记举例 3,5/4,6-环己烯四醇环己烯四醇B环氧化物具有与葡萄糖环氧化物具有与葡萄糖吡喃环相似的结构，它对糖苷酶有很高的亲和力，吡喃环相似的结构，它对糖苷酶有很高的亲和力，分子内潜在的化学活性基团分子内潜在的化学活性基团环氧环在酶的催环氧环在酶的催化作用下，发生类似底物质子化的变化而受到活化作用下，发生类似底物质子化的变化而受到活化，变成对酶有高度反应活性的基团，能专一地化，变成对酶有高度反应活性的基团，能专一地不可逆地作用不同来源的不可逆地作用不同来源的葡萄糖苷酶。葡萄糖苷酶。一一个个在在无无光光时时稳稳定定的的化化合合物物可可逆逆地地结结合合到到酶酶的的活活性性中中心心，照照光光后后受受光光解解激激活活，产产生生高高反反应应性性基基团团，与与酶酶的的活活性性中中心心共共价价结结合合。常常见见的的试试剂剂是是光光解解时时给给出出高高度度易易反反应应的的碳碳烯烯的的重重氮氮化化合合物物或或硝硝烯的叠氮化合物烯的叠氮化合物。在在植植物物生生理理学学研研究究中中，用用氚氚偶偶氮氮IAA作作光光亲亲和和标标记记试试剂剂，经经紫紫外外光光照照射射后后，从从番番茄茄茎茎细细胞胞质膜上分离出了质膜上分离出了IAA受体蛋白。受体蛋白。C光亲和标记某些常用的修饰剂氨基酸残基氨基酸残基修修饰饰剂剂Cys汞汞制制剂剂，如如对对氯氯汞汞苯苯甲甲酸酸；二二硫硫化化物物，如如5,5二硫二（二硫二（2-硝基苯甲酸）硝基苯甲酸）；碘乙酰胺；碘乙酰胺Lys2,4,6-三三硝硝基基苯苯磺磺酸酸；磷磷酸酸吡吡哆哆醛醛（还还原原试试剂剂如如NaBH4）His二乙基焦碳酸盐；光氧化二乙基焦碳酸盐；光氧化Arg苯乙二醛；苯乙二醛；2,3-丁二酮丁二酮Tyr四硝基甲烷；四硝基甲烷；N-乙酰咪唑乙酰咪唑Trp碘；碘；N-溴代丁二酰亚胺溴代丁二酰亚胺Asp,Glu水溶性碳二亚胺亲核试剂如水溶性碳二亚胺亲核试剂如Gly甲酯甲酯鉴别化学修饰剂是否已经引入酶活性中心的标准a酶活性的丧失程度与修饰的程度成正比。酶活性的丧失程度与修饰的程度成正比。b底物或可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用。底物或可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用。分析化学修饰结果时应注意的问题 对对化化学学修修饰饰实实验验得得出出的的结结论论应应非非常常慎慎重重，因因为为可可能能被被修修饰饰的的基基团团位位于于活活性性中中心心以以外外的的附附近近，由由于于空空间间位位阻阻使使得得底底物物无无法法进进入入活活性性中中心心，从从而而表表现现出出酶酶失失去去活活性性。活活性性中中心心往往往往有有多多个个与与底底物物结结合合的的基基团团，修修饰饰其其中中的的一一个个往往往往不不能能使使酶酶失失去去活活性性，可可能能导致结合力减弱，也可能改变被结合底物的专一性。导致结合力减弱，也可能改变被结合底物的专一性。2 2动力学分析法 动动力力学学分分析析法法是是利利用用改改变变酶酶反反应应介介质质的的pH，观观察察其其对对酶酶催催化化能能力力的的影影响响。酶酶蛋蛋白白分分子子中中含含有有许许多多可可解解离离的的基基团团，pH改改变变必必然然会会影影响响这这些些基基团团的的解解离离状状态态。当当活活性性中中心心的的必必需需基基团团的的解解离离状状态态发发生生变变化化时时，会会直直接接影影响响到到酶酶的的催催化化能能力力。因因此此，通通过过pH酶酶催催化化活活性性关关系系的的研研究究，可可能能得得到到与与催催化化直直接接相相关关的的某某些些基基团团的的pK值值，进进而而推推断断这这些些基基团的种类。团的种类。动力学分析法 各各基基团团的的pK值值有有一一理理论论值值，但但由由于于微微环环境境的的影影响响，实实测测的的pK值值往往往往与与理理论论值值有有偏偏差差，导导致致分分析析基基团团种种类类的的困困难难，这这时时需需要要用用其其他他方方法法辅辅助助分分析析，如如测测该该基基团团的的解解离离热热函函H，或或加加有有机机溶溶剂剂，改改变变溶溶液液的的电电导导率率，作作pH依依存存关关系系实实验验，从从pK的变化来协助推断基团种类。的变化来协助推断基团种类。各种氨基酸残基的pK值与解离热函H氨基酸残基氨基酸残基pK值值H（J/mol）羧基羧基3.03.26,276羧基（天冬氨酸）羧基（天冬氨酸）3.04.26,276羧基（谷氨酸）羧基（谷氨酸）4.46,276酚羟基（酪氨酸）酚羟基（酪氨酸）9.810.425,104SH基（半胱氨酸）基（半胱氨酸）8.38.6咪唑基（组氨酸）咪唑基（组氨酸）5.67.028,87031,380氨基氨基7.68.441,84054,392氨基（胱氨酸）氨基（胱氨酸）6.58.5氨基（赖氨酸）氨基（赖氨酸）9.410.641,84050,208胍基（精氨酸）胍基（精氨酸）11.612.650,20854,3923 3X-光衍射分析法通过多种方法相互印证，可得出正确的结论。通过多种方法相互印证，可得出正确的结论。用用X射射线线衍衍射射研研究究蛋蛋白白质质的的构构象象时时，蛋蛋白白质质必必须须结结晶晶。用用波波长长很很短短的的X射射线线（=0.154nm）照照射射蛋蛋白白质质晶晶体体，发发生生散散射射，底底片片曝曝光光后后，得得到到衍衍射射图图，再再经经计计算算机机处处理理，绘绘出出电电子子密密度度图图，从从中中构建出三维分子图像。构建出三维分子图像。肌红蛋白的X射线衍射图肌红蛋白分子中部分肽链的电子密度图三、组成酶活性中心的重要化学基团 酶酶活活性性中中心心有有7种种氨氨基基酸酸残残基基参参加加的的频频率率最最高高，它们是它们是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。同同一一类类酶酶往往往往含含有有相相同同的的活活性性中中心心基基团团。如如胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶和和胰胰蛋蛋白白酶酶活活性性中中心心含含有有丝丝氨氨酸酸残残基基，称称为为丝丝氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶；胃胃蛋蛋白白酶酶和和木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶活活性性中中心心含含有有半半胱胱氨氨酸酸残残基基，称称为为半半胱胱氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶。在在脱脱氢氢酶酶活活性性中中心心往往往往含含有有酪酪氨氨酸酸残残基基。这这些些知知识识可可以以为未知活性中心基团的酶的研究提供线索。为未知活性中心基团的酶的研究提供线索。酶活性中心基团的确定 同同位位素素标标记记活活性性中中心心基基团团后后，用用蛋蛋白白酶酶部部分分水水解解，得得到到同同位位素素标标记记的的肽肽段段，分分析析其其氨氨基基酸酸顺顺序，可以了解活性中心附近的氨基酸顺序。序，可以了解活性中心附近的氨基酸顺序。实实验验表表明明，同同类类酶酶不不仅仅有有相相同同的的活活性性中中心心基基团，而且附近的氨基酸顺序也很相似团，而且附近的氨基酸顺序也很相似。一些丝氨酸蛋白酶活性中心丝氨酸附近的肽链组成酶酶活性中心附近的氨基酸顺序活性中心附近的氨基酸顺序胰蛋白酶（牛）胰蛋白酶（牛）Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys胰凝乳蛋白酶（牛）胰凝乳蛋白酶（牛）Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys-Lys-Asn弹性蛋白酶（猪）弹性蛋白酶（猪）Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn凝血酶（牛）凝血酶（牛）Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro蛋白酶（蛋白酶（S.griseus）Thr-Cys-Glu-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Met-Phe*表示有催化活性的丝氨酸残基表示有催化活性的丝氨酸残基一些半胱氨酸蛋白酶活性中心的半胱氨酸残基附近的氨基酸顺序酶酶活性中心附近的氨基酸顺序活性中心附近的氨基酸顺序木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶Pro-Val-Lys-Asn-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-*Cys-Trp无花果蛋白酶无花果蛋白酶Pro-Ile-Arg-Gln-Glu-Gly-Gln-Cys-Gly-Ser-*Cys-Trp菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶Asn-Gln-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala-*Cys-Trp*表示有催化活性的半胱氨酸残基表示有催化活性的半胱氨酸残基四、酶促化学修饰和酶活性调节 前述化学修饰是人工所为，本节介绍的前述化学修饰是人工所为，本节介绍的是天然过程。是天然过程。1 1酶原的激活(1)(1)酶原酶原 生生物物体体内内大大多多数数酶酶当当它它们们自自发发地地（有有些些在在分分子子伴伴侣侣的的指指导导协协助助下下）折折叠叠成成特特定定的的三三维维结结构构时时，即即获获得得了了全全部部酶酶活活力力。也也有有一一些些酶酶刚刚合合成成出出来来是是没没有有活活性性的的前前体体，称称为为酶酶原原。当当酶酶原原在在特特定定的的（体体内内）位位置置被被水水解解断断裂裂一一个个和和一一些些肽肽键键，就就成成为了有活性的酶。为了有活性的酶。酶原的激活 人的胃肠道中有许多蛋白酶，包括人的胃肠道中有许多蛋白酶，包括胃蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和弹性蛋白酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和弹性蛋白酶等，它们在细胞内刚合成时，是酶原形式，当分等，它们在细胞内刚合成时，是酶原形式，当分泌到胃肠道中后，受到胃肠道中蛋白酶的作用，泌到胃肠道中后，受到胃肠道中蛋白酶的作用，肽键断裂，转变成活性酶。这样可以避免这些酶肽键断裂，转变成活性酶。这样可以避免这些酶对分泌器官的破坏。对分泌器官的破坏。（2 2）酶原激活的机制来源来源 酶酶酶原名称酶原名称激激活活因因素素结结果果胃胃胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶原胃蛋白酶原H或胃蛋白酶或胃蛋白酶胃胃蛋蛋白白酶酶6个多肽碎片个多肽碎片胰胰胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶原胰蛋白酶原肠激酶或胰蛋白酶肠激酶或胰蛋白酶胰胰蛋蛋白白酶酶1个六肽个六肽胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶2个二肽个二肽羧肽酶羧肽酶羧肽酶原羧肽酶原胰蛋白酶胰蛋白酶羧羧肽肽酶酶几几种种碎片碎片弹性蛋白酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶弹弹性性蛋蛋白白酶酶几种碎片几种碎片血液血液 凝血酶凝血酶凝血酶原凝血酶原凝血因子和凝血因子和Ca2凝血酶肽段凝血酶肽段纤维蛋白溶酶纤维蛋白溶酶纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶原致活剂致活剂纤维蛋白溶酶纤维蛋白溶酶胰凝乳蛋白酶原的活化2 2共价修饰调节 共共价价修修饰饰调调节节中中最最重重要要的的也也是是最最主主要要的的是是磷酸化磷酸化/脱磷酸化脱磷酸化。一些可被磷酸化/脱磷酸调节的酶以磷酸化形式为活性型的酶以磷酸化形式为活性型的酶以脱磷酸形式为活性型的酶以脱磷酸形式为活性型的酶糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶糖原合成酶糖原合成酶糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶b激酶激酶丙酮酸激酶（丙酮酸激酶（L型）型）果糖果糖-1,6-二磷酸酯酶（肝）二磷酸酯酶（肝）磷酸果糖激酶（磷酸果糖激酶（2型）型）胆固醇酯酶胆固醇酯酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶HMGCoA还原酶激酶还原酶激酶HMGCoA还原酶还原酶激素敏感性脂肪酶激素敏感性脂肪酶乙乙酰酰CoA羧羧化化酶酶（不不同同磷磷酸酸化化位位点点作作用不同）用不同）乙酰乙酰CoA羧化酶羧化酶*脂肪酸合成酶（不肯定）脂肪酸合成酶（不肯定）苯丙氨酸羟化酶苯丙氨酸羟化酶支链支链酮酸脱氢酶酮酸脱氢酶cAMP磷酸二酯酶（受胰岛素激活）磷酸二酯酶（受胰岛素激活）（2 2）蛋白激酶 使使蛋蛋白白质质磷磷酸酸化化的的酶酶称称为为蛋蛋白白激激酶酶（proteinkinase，PK），PK已已发发现现了了很很多多种种，一一般般分分为为三三大类：大类：底底物物专专一一的的蛋蛋白白激激酶酶，如如磷磷酸酸化化酶酶激激酶酶、丙丙酮酮酸酸脱氢酶激酶等；脱氢酶激酶等；依依赖赖于于环环核核苷苷酸酸的的蛋蛋白白激激酶酶，如如cAMP依依赖赖性性蛋蛋白白激激酶酶（A激激酶酶）、cGMP依依赖赖性性蛋蛋白白激激酶酶（G激激酶）；酶）；其他蛋白激酶，如组蛋白激酶等。其他蛋白激酶，如组蛋白激酶等。AA激酶 A激激酶酶由由两两个个催催化化亚亚基基（C）和和两两个个调调节节亚亚基基（R）组组成成，调调节节亚亚基基实实际际上上是是催催化化亚亚基基的的抑抑制制剂剂，当当有有cAMP存存在在时时，cAMP与与R亚亚基基结结合合，使两个使两个C亚基游离出来而激活亚基游离出来而激活。A激激酶酶是是体体内内最最重重要要的的蛋蛋白白激激酶酶，它它催催化化很很多酶以及非酶蛋白的磷酸化反应。多酶以及非酶蛋白的磷酸化反应。A激酶活性的调节A激酶R亚基的假底物作用 C亚亚 基基 的的 活活 性性 中中 心心 识识 别别 靶靶 蛋蛋 白白 质质 的的R（R/K）X（S/T）序序列列，磷磷酸酸化化其其中中S/T残残基基上上的的羟羟基基。R亚亚基基上上有有一一个个RRGA序序列列，与与C亚亚基基识识别别的的靶靶序序列列相相似似，起起着着假假底底物物的的作作用用，与与C亚亚基基的的活活性性中中心心结结合合，从从而而抑抑制制C亚亚基基的的活活性性。假假底底物物上上的的A与与靶靶序序列列上上的的S结结构构相相似似，但但缺缺少少可可被被磷磷酸酸化化的的羟羟基。基。G激激酶酶由由两两个个亚亚基基组组成成，其其激激活活方方式式与与A激激酶酶不同，不同，2分子分子cGMP与酶结合后就形成活性形式与酶结合后就形成活性形式。G激激酶酶的的反反应应速速度度仅仅为为A激激酶酶的的百百分分之之几几，故故在在体体内内可可能能不不起起重重要要作作用用。但但这这两两种种蛋蛋白白激激酶酶在在体体内内的的分分布布不不同同，A激激酶酶在在胞胞浆浆多多，G激激酶酶在在细细胞胞核核及质膜较多。及质膜较多。E22cGMPE22cGMPBG激酶（3）磷酸化部位 一一般般一一个个亚亚基基上上只只有有一一个个磷磷酸酸化化部部位位，磷磷酸酸化化部部位位大大多多是是Ser的的羟羟基基，少少数数是是Thr或或Tyr的羟基。的羟基。酶共价修饰的意义 共共价价修修饰饰在在酶酶活活性性的的调调节节上上（同同时时也也在在代代谢谢途途径径的的调调节节上上）有有重重要要的的意意义义，如如糖糖原原降降解解（受受肾肾上上腺腺素素和和胰胰高高血血糖糖素素激激活活）和和糖糖原原合合成成（受受胰胰岛岛素素激激活活）。共共价价修修饰饰调调节节酶酶活活性性有有3个特点：个特点：快速；快速；耗能少；耗能少；有级联放大作用。有级联放大作用。五、酶的空间结构与功能的关系1酶的二、三级结构与功能的关系酶的二、三级结构与功能的关系 酶酶的的二二、三三级级结结构构靠靠二二硫硫键键（disulfidebonds,orbridge）、氢氢键键（hydrogenbonds）、盐盐键键（salt bonds）、疏疏水水力力（hydrophobicbonds）、范范德德华华力力（VanderWaalsforces，取取向向力力，诱诱导导力力，色色散散力力）等等维维持持。蛋蛋白白质质的的一一级级结结构构决决定定其其高高级级结结构构，即即一一级级结结构构包包含含了了构构成其高级结构的全部信息。成其高级结构的全部信息。酶的结构与功能 酶酶活活性性中中心心的的各各基基团团在在空空间间构构象象上上的的相相对对位位置置对对酶酶表表现现活活力力是是至至关关重重要要的的，而而这这个个相相对对位位置置是是由由二二、三三级级结结构构决决定定的的，若若二二、三三级级结结构构受受到到破坏，这个相对位置也会发生变化，使酶失活。破坏，这个相对位置也会发生变化，使酶失活。有有实实验验表表明明，只只要要酶酶活活性性中中心心各各基基团团维维持持正正确确的的相相对对位位置置，即即使使一一级级结结构构有有轻轻微微变变化化，也也不不影响酶活性。影响酶活性。RNase的重组实验 有有人人用用枯枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶（subtilisin）处处理理RNA酶酶，使使Ala20和和Ser21之之间间的的肽肽键键水水解解，成成为为N端端20肽肽的的S肽肽和和C端端104肽肽的的S蛋蛋白白，S肽肽中中含含有有原原活活性性中中心心的的His12，S蛋蛋白白中中含含有有原原活活性性中中心心的的His119。这这两两者者单单独独存存在在时时均均无无活活性性，当当在在pH7.0的的介介质质中中S肽肽和和S蛋蛋白白1：1混混合合时时，酶酶活活性性可以恢复。可以恢复。12位和位和119位位为两个为两个HisRNase的重组实验RNase的重组实验 用用8M尿尿素素和和过过量量的的巯巯基基乙乙醇醇处处理理RNase，可可使使RNase的的4个个二二硫硫键键打打开开，并并破破坏坏氢氢键键，使使RNase成成为为杂杂乱乱无无章章的的变变性性多多肽肽链链，完完全全失失去去活活性性。当当用用透透析析法法除除去去巯巯基基乙乙醇醇和和尿尿素素后后，酶酶会会缓缓慢慢地地重重新新折折叠叠成成具具有有催催化化活活性性的的天天然然构构象象，SH基基也也会会受受空空气气中中的的氧氧所所氧氧化化，恢恢复复正正确确的的二二硫硫键键，从从而而恢复酶活性。恢复酶活性。RNase的重组实验 如如果果保保留留尿尿素素而而除除去去巯巯基基乙乙醇醇，再再使使巯巯基基氧氧化化，然然后后除除去去尿尿素素，则则酶酶活活性性只只有有原原天天然然酶酶的的1%。这这是是因因为为有有尿尿素素时时，酶酶的的变变性性肽肽链链形形成成二二硫硫键键是是随随机机的的，8个个 巯巯 基基 形形 成成 4个个 二二 硫硫 键键 共共 有有 105种种 组组 合合 方方 式式（），其其中中只只有有1种种是是正正确确的的（天天然然的的），其其他他104种种都都是是错错误误的的，所所以以酶酶活活性性只只能能恢恢复复到到1%。将将这这种种酶酶加加上上微微量量的的巯巯基基乙乙醇醇，可可使使SH基基重重新新组组合合而而缓缓慢慢地地（约需（约需10小时）恢复成天然活性的酶蛋白。小时）恢复成天然活性的酶蛋白。酶蛋白自动折叠 实实验验表表明明，只只要要蛋蛋白白质质的的一一级级结结构构不不变变，当当变变性性条条件件除除去去后后，酶酶蛋蛋白白能能自自动动地地恢恢复复到到其其热力学上最稳定的构象热力学上最稳定的构象。2 2酶的四级结构与功能的关系 酶酶的的四四级级结结构构是是指指若若干干个个亚亚基基组组成成全全酶酶，也也叫叫寡寡聚聚酶酶。亚亚基基之之间间有有疏疏水水力力、氢氢键键、盐盐键键等等非非共共价价键键结结合合。组组成成全全酶酶的的亚亚基基有有同同种种亚亚基基，也也有有异异种种亚亚基基。具具有有四四级级结结构构的的酶酶受受到到聚聚合合和和解聚对活性的调节。解聚对活性的调节。原体 对对于于含含异异种种亚亚基基的的寡寡聚聚酶酶来来说说，具具有有一一套套不不同同结结构构和和功功能能的的亚亚基基的的最最小小单单位位，称称为为原原体体（protomer）或或单单聚聚体体（monomer）。有有些些由由异异种种亚亚基基组组成成的的寡寡聚聚酶酶只只含含一一个个原原体体，该该原原体体即即为为活活性性形形式式；有有些些由由异异种种亚亚基基组组成成的的寡寡聚聚酶酶含含有有多多个个原原体体。当当它它解解聚聚成成原原体体时时，酶酶失失去去活活性性。如如小小鸡鸡肝肝乙乙酰酰CoA羧羧化化酶酶由由812个个原原体体组组成成，解解聚聚后后失去活性。失去活性。别构酶的催化亚基和调节亚基 有有些些受受别别构构调调节节的的酶酶由由催催化化亚亚基基和和调调节节亚亚基基组组成成，当当催催化化亚亚基基和和调调节节亚亚基基解解聚聚时时，催催化化亚亚基基仍仍有有活活性性，只只是是不不受受调调节节，如如大大肠肠杆杆菌菌天天冬氨酸转氨甲酰酶和冬氨酸转氨甲酰酶和A激酶。激酶。Y型六聚体型六聚体X型六聚体型六聚体纤维状多聚体纤维状多聚体谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶丙氨酸脱氢酶丙氨酸脱氢酶无活性无活性 由由同同种种亚亚基基组组成成的的寡寡聚聚酶酶，每每个个亚亚基基上上就就包包括括催催化化部部位位和和调调节节部部位位。大大部部分分此此种种酶酶聚聚合合时时有有活活性性，解解聚聚时时失失活活。谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶例例外外，当当它它成成为为Y型型时时（六六聚聚体体）有有催催化化谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢的的活活性性；而而转转变变成成X型型时时（六六聚聚体体）有有催催化化丙丙氨氨酸酸脱脱氢氢的的活性，且活性，且X型能聚合成无活性的棒状多聚体。型能聚合成无活性的棒状多聚体。同种亚基寡聚酶GTPGDPNADHADPLeu六、酶催化作用的机制酶催化机制的研究方法酶催化机制的研究方法A研究与酶促反应有关的非酶催化反应；研究与酶促反应有关的非酶催化反应；B推理或建立一种理论，或一种假说；推理或建立一种理论，或一种假说；C研究酶活性中心的结构，酶研究酶活性中心的结构，酶底物复合底物复合 物，以及酶反应的性质和动力学。物，以及酶反应的性质和动力学。催化机制类型 根根据据目目前前的的研研究究结结果果，已已提提出出了了多多种种催催化机制类型化机制类型:反应物的接近效应和定向效应；反应物的接近效应和定向效应；共价催化作用；共价催化作用；酸碱催化作用；酸碱催化作用；由诱导契合和底物应变引起的催化作用。由诱导契合和底物应变引起的催化作用。1.反应物的接近效应（proximity）和定向效应（orientation）酶的底物结合部位对底物有亲和力。两种反酶的底物结合部位对底物有亲和力。两种反应物在溶液中自由反应时要依赖随机碰撞，在酶应物在溶液中自由反应时要依赖随机碰撞，在酶促反应中，促反应中，两种反应物与酶活性中心的结合起到两种反应物与酶活性中心的结合起到了增大碰撞几率的作用，这就是接近效应了增大碰撞几率的作用，这就是接近效应。反应物不仅与酶活性中心结合，而且反应物不仅与酶活性中心结合，而且结合的结合的方式是特异方式是特异的，使得两个反应物的反应基团或反的，使得两个反应物的反应基团或反应涉及的键在空间位置上接近，这是应涉及的键在空间位置上接近，这是定向效应定向效应。由于接近效应和定向效应，使得酶催化反应与分由于接近效应和定向效应，使得酶催化反应与分子内催化作用相似。子内催化作用相似。分子间反应和分子内反应设有两种反应物设有两种反应物A和和B，其分子内反应为其分子内反应为其分子间反应为其分子间反应为 假假设设在在上上述述两两种种情情况况下下，A对对B的的固固有有反反应应性性是是一一样样的的，则则一一级级反反应应速速度度常常数数K1比比二二级级反反应应速速度度常常数数K2要要大大，K1/K2通通常常约约为为550。其其原原因因是是分分子子内内反反应应已已有有接接近近效效应应和和定定向向效效应应，分分子子间间反反应应只只能能靠靠随随机机碰碰撞撞，碰碰撞撞的的几几率率随随反反应应物物浓浓度度的的增加而增大。增加而增大。分子间催化和分子内催化 含有咪唑和对硝基苯酯两种基团的化合物分子内含有咪唑和对硝基苯酯两种基团的化合物分子内催化水解反应与咪唑和对硝基苯酯的分子间催化水解催化水解反应与咪唑和对硝基苯酯的分子间催化水解反应相比时，其反应相比时，其K1/K2为为23.9。分子内催化分子内催化分子间催化分子间催化2共价催化作用（covalent catalysis）共共价价催催化化指指的的是是在在酶酶催催化化反反应应的的过过程程中中，有有共共价价键键连连接接的的酶酶底底物物中中间间复复合合体体形形成成。某某些些中中间间复复合合体体已已经经分分离离出出来来并并进进行行了了鉴鉴定定。中中间间复复合合体体形形成成后后可可进进一一步步变变化化而而形形成成产产物物，并并且且这这种种经经过过中中间间复复合合体体的的反反应应速速度度与与观观察察到到的的酶酶反反应应总总速度相符合。速度相符合。（1）亲核催化作用（nucleophilic catalysis）共价催化作用可分为共价催化作用可分为亲核催化作用和亲电催亲核催化作用和亲电催化化作用两大类。作用两大类。有些化合物，其原子团具有给出电子的强烈有些化合物，其原子团具有给出电子的强烈趋势，称为亲核物质。凡是一个被催化的反应趋势，称为亲核物质。凡是一个被催化的反应需需要从催化剂取得一个电子才能进行要从催化剂取得一个电子才能进行时，称为亲核时，称为亲核催化作用。催化作用。参与亲核催化的基团 在在酶酶活活性性中中心心的的基基团团中中