分子克隆.docx

分子克隆技术实验报告应用生物技术0801实验是由小组成员集体完成，实验报告以及结果分析由个人完成。小组成员：余功臣、晏星、何一鸣、伍良伟。试验时间由2011年5月8日至5月14日，共完成分子克隆、分子杂交和基因表达检测三大部分的实验。下列实验报告中的实验试剂具体成分以及配置方式均未列出，详见分子克隆技术实验手册附录。一将M812载体上的水稻DNA片段亚克隆于pUC19载体上摘要运用碱裂解法抽提质粒载体pUC19和带有水稻目的DNA片段M812的质粒pU1301，用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒DNA的质量，用限制性内切酶BamI和KpnI处理pU1301和pUC19，将纯化的载体pUC19与回收的水稻DNA片段M812连接后，将重组的DNA分子导入感受态细胞大肠杆菌菌株DH5a并在培养皿上培养。关键词碱裂法  琼脂糖凝胶电泳检测  亚克隆  感受态细胞  重组子的转化1 前言亚克隆，即是将已经获得的目的片段进行进一步分析，或者进行重组改造等过程。其基本过程包括：（1）目的片段和载体的制备；（2）目的片段和载体的连接；（3）连接产物的转化；（4）重组子筛选。本实验中的目的片段和载体均来自细菌质粒，因此细菌质粒的抽提是目的片段和载体制备的核心步骤。本实验中以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。碱裂解法，是1979年由Birnboim和Doly设计并发表的经典质粒DNA提取方法。其核心原理是在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体会沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。在pH值为时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。所抽提的质粒即用电琼脂糖凝胶电泳来检测。一般所抽提的质粒在琼脂糖胶上能够呈现三条带，因为质粒有三种构型，即线状、环状、开环状。将所获得的载体质粒与带有目标片段的质粒进行重组，其包括载体及外源DNA片段的双酶切消化、目的片段的回收和载体的纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。将重组DNA导入大肠杆菌细胞一般有两种方法CaCl2法和电转化法，本实验中采用CaCl2法。本实验采用CaCl2法制备感受态细胞：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 107转化子/mg DNA。2 材料和方法携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌菌液。携带pUC19质粒载体的大肠杆菌和携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌的培养先采用含相应抗生素的LA培养基，后采用LB培养基。大肠杆菌菌株DH5a采用LB培养基。大肠杆菌在37培养。抗生素的使用浓度：氨苄青霉素，100g/ml；卡那霉素，50g/ml。Solution I; SolutionII; SolutionIII;苯酚/氯仿;异丙醇;ddH2O21. 取含有所需载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落，37过夜培养；2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，37摇床250 r/min过夜培养；3. 吸取菌液，12000r/min离心1分钟，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次12000r/min离心1分钟收集菌体，尽量将菌液倒干净；4. 加入300ml 溶液 I，振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；5. 加入300ml 溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）；6. 加入300ml 溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；7. 12000 g离心10分钟；8. 吸取800ml 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；9. 12000 g 常温离心15分钟；10. 倒尽上清，加500 ml 75乙醇浸洗除盐，（放置片刻后倒去上清；或离心5分钟）11. 加40ml 灭菌超纯水溶解；12. 质粒的质量检测，-20保存。2.1.3 DNA的琼脂糖凝胶电泳步骤 1.将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上，调整好梳子的高度；0.24 g琼脂糖于TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；3.凝胶凝固后，小心拔去梳子；DNA样品与上样缓冲液混合后将样品依次加入点样孔中（上样缓冲液含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中；含有电泳指示剂，以指示电泳的进程）；5.将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；6.电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 g/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡1015 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录；（上样缓冲液含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中；含有电泳指示剂，以指示电泳的进程。）DNA片段在质粒载体中的克隆所抽提的载体质粒pUC19和携带外源片段M812的载体pU1301；限制性内切酶：BamH I和Kpn I;2.2.2 载体pUC19和外源DNA的限制性酶切及酶切效应检测（50 ml反应体系，用1.5ml tube，冰上操作） DNA    30mlBamH I (10u/l) 1   mlKpn I (10u/l) 1   ml 10buffer5   mlddH2O      13ml分别取5 ml 酶切产物用1.2%凝胶检测酶切效果;2.2.3 酶切产物pUC19的纯化步骤     1. 加入ddH2O 150 ml （扩大体积），加入200l氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀后离心10 min；2. 吸出上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积乙醇，-20放置15分钟以上；3. 12000 rpm 4冷冻离心15分钟；4. 倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，风干后BAC DNA溶于10 ml ddH2O，pUC18 DNA溶于20 ml ddH2O（1.5ml tube中）；2.2.4外源DNA片段M812挖胶回收步骤（上海生工公司生产的柱式DNA胶回收试剂盒）  1. 通过琼脂糖凝胶将目的DNA 带与载体带分开；2. 紫外灯下用干净的刀片切下含目的DNA 带的胶块放入离心管中；（注意：不含DNA 的胶尽可能切除，在长波长的紫外灯下切胶，并尽量缩短DNA 暴露在紫外光下的时间）3. 按400l/100mg 胶的比例加入Binding Buffer II , 50-60C  水浴中10分钟，使胶融化，每2-3分钟混匀一次；（注意若胶的浓度较大需增加Binding Buffer II 的比例、增加融胶的时间，若胶块体积较大也需增加融胶的时间）4. 将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10 柱中，放置2分钟，8000rpm离心1分钟；5. 取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10 柱放入同一个收集管内，加入500l Wash Solution ,8000rpm 室温离心1分钟；6. 重复5步一次；7. 取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10 柱放入同一个收集管内，12000rpm 室温离心15秒；8. 将UNIQ-10 柱放入一个新的1.5ml 离心管内，在柱子膜中央加40l Elution Buffer 或水（），室温或37C 放置2分钟；（提高洗脱温度到55C-80C有利于提高DNA 的洗脱效率）；9. 12000rpm室温离心1分钟，离心管中的溶液即为回收的DNA 片段。2.2.5 连接反应（10l体系）：外源DNA         4  ml目的载体DNA         4  ml10 buffer     1  mlT4 ligase (1U/ml)  1  ml   16 C  水浴保温过夜2.2.6.1 CaCl2感受态细胞的制备步骤1. 前夜接种受体菌（DH5a），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜（约16小时）；2. 取1ml过夜培养物于100ml添加有20mM MgCl2的LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约小时（300rpm）；3. 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4. 吸取培养好的菌液至离心管中，在冰上冷却10分钟；5. 4下4000rpm冷冻离心10分钟；6. 再吸取菌液，重复操作4、5；7. 弃去上清，加入100ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；8. 4下4000 rpm冷冻离心10分钟；9. 弃去上清，加入100ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；10. 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70）。3结果和讨论DNA质量检测图1.质粒DNA质量检测图图1是质粒DNA提取后的凝胶电泳检测的图片，图中的各条带均可见表示所需质粒抽提成功，质粒DNA提取的质量一般。图片中1号为Puc19载体，图中可看到4条带，最靠近胶孔的为杂带，下边的3条带由胶孔至胶底依次为开环状质粒、线状质粒和超螺旋状质粒。图中2号为携带目标片段M812的载体pU1301，靠近胶孔有拖带现象，出现这种情况可能的原因是部分DNA被降解。抽提质粒过程中，吸取上清时可能混入杂质，导致了1号泳道的情况，而2号泳道的降解可能是因为溶水后放置了太长时间导致，以后需要注意。1   2             3    4   图2.质粒酶切后凝胶电泳图（1为puc19,3为pu1301）图2是质粒经BamH I和Kpn I酶切后凝胶电泳的照片，可以看出质粒的酶切都比较理想。本组在双酶切实验中质粒切割较完全，可能原因是注入酶时较谨慎，未带入多余的酶，因此酶用量事宜，未引起星星活性。此外，当底物和酶等成分均加入完全后，本组在实验中将其弹均，并进行短暂离心使其充分混匀，因此酶切结果较为理想。图3大肠杆菌感受态细胞转化结果转化结果，全被杂菌污染，出现蓝色自连菌落，成功转化菌落无法识别。本此实验中，培养皿的培养时间接近30小时，导致卫星菌落的产生。据资料显示，大肠杆菌在氨苄青霉素上的经验培养时间为12-16小时，若到达预期培养时间时依然未形成可见菌落，则可适当延长培养实验，直至长出饱满菌落。实验中，培养时间过长，导致细胞分泌的-内酰胺酶破坏了氨苄青霉素的活性，以致长出杂菌。并且由于最后涂皿时，无菌操作出现问题，导致材料污染杂菌。因此，我们在日后实验中，一定此次分子克隆实验结果较为理想，主要原因在于实验操作较为谨慎，各环节的实验均进行得比较仔细。在质粒抽提阶段，本组特别加入了氯仿异丙醇抽提环节，提高了所提取质粒的纯度；在回收阶段，本组将所切的胶带再度进行切割，使其成为小块凝胶，便于其溶解，缩短的溶解时间；在感受态制备阶段，本组注重冰上操作和无菌操作，进入超净工作台前将手洗净，并用酒精棉球仔细擦拭，防止污染。因此，在今后进行相关操作时，应更加注重实验细节，从而能增加实验成功率。二，转基因水稻外源基因拷贝数检测摘要通过CTAB法提取水稻总DNA，经Hind III酶切处理后进行琼脂糖凝胶电泳并将其结果转移至硝酸纤维素尼龙膜上。用已制变性探针在膜上进行杂交后显色，则根据显色后的条带情况则测定转基因水稻外源基因拷贝数。关键词CTAB法，总DNA，Southern印迹，地高辛；1 前言分子杂交技术，可以用于检测转基因水稻外源基因拷贝数。本实验中主要采用Southern杂交技术进行检测。Southern杂交是由Southern等人于1977年发明的一种检测DNA分子的一种方法，通过Southern印迹转移将琼脂糖胶上的DNA分子转移到硝酸纤维素滤膜上，然后用经过地高辛标记的探针进行分子杂交，在滤膜上找到与核酸探针也有同源序列的DNA分子。用于杂交的水稻总DNA由CTAB法抽提而来，CTAB(十六烷基三甲基溴化铵）是一种非离子去污剂，CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用7075%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。由此可以得到纯度较高的转基因水稻总DNA。HindIII的酶切位点是AAGCTT，用HindIII处理后的总DNA在0.8%的琼脂糖凝胶电泳后呈现连续的条带，便于进行杂交。杂交所用探针为地高辛所标记。地高辛（DIG）是灵敏度高、非放射性核酸标记检测体系。DIG检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之苦，很适合用于核酸非放标记检测。2 材料和方法新鲜幼嫩转基因水稻叶片；CTAB，氯仿/异戊醇（24:1），95%乙醇，70%乙醇，3M NaAc，ddH2O;步骤1.采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，研磨成细粉；2.取约左右细粉于离心管，加入1ml预热至95C以上的CTAB，混匀；3. 65C水浴中放置30分钟，每隔5分钟上下颠倒混合数次  (DNase变性，促进内溶物释放)；4.12000rpm离心2分钟； 600ml上清于新的离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒混匀至下层有机相呈深绿色（约15-20分钟）；6.12000rpm离心5分钟；450ml上清于新的离心管，加入两倍体积95乙醇和1/10体积3M NaAc，轻轻的颠倒混匀至絮状沉淀形成；8.12000rpm离心10分钟；9.弃去上清。用500ml 70乙醇浸洗沉淀5分钟，除去离子及CTAB残余，弃上清,自然干燥；2O溶解。11.待总DNA充分溶解后取5ul,并加入2ul 6Loading Buffer在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳。根据染色后的条带检测总DNA抽提效果。2.1.4植物总DNA的酶切检测（20ml体系）DNA10 ml        Hind3(10U/l)1  ml             10buffer2  ml           ddH2O         7 ml           37C 酶切过夜;电泳检测酶切效率：每样品1/10量上样，电泳检测(2ml 总DNA 酶切产物+1ml 10loading buffer+7 ml H2O)。加入终浓度为12.5m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应(加上样缓冲液终止酶切)22探针的地高辛标记模板DNA，去离子水，DiG-high Primer ；2.1.2地高辛标记步骤（10l）1将300ng 模板DNA用无菌去离子水补足至8 l。2沸水浴或干浴98 C 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。3充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取2 l至变性DNA管，混匀并离心。437 C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。5停止反应，65 C加热10分钟。l;   2.将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/l (原始浓度是5ng /l);3.将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1l点膜;C固定30分钟或紫外交链3-5分钟;5.将膜放入装有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室温2分钟;6.将膜放入10ml Blocking solution中室温温育30分钟;7.将膜放入10ml Antibody solution 中室温温育30分钟;8.用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分钟;9.在10ml Detection buffer 平衡2-5分钟;10.将膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动。;11.当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相;2.3 Southern 印迹2.3.11材料以及用具固相支持物:硝酸纤维素膜；脱嘌呤试剂（0.125M HCl）;试剂：变性缓冲液 (1.5M NaCl, 0.5M NaOH);中和缓冲液（1.5M NaCl, 0.5M Tris）;转膜缓冲液：20SSC;用具：2个合适大小的水盘；1根玻璃棒，1块铲胶板，1个切胶刀；2张搭盐桥的滤纸；1张合适大小的尼龙膜；2张比尼龙膜稍大的滤纸；一叠5cm左右厚的吸水纸；1大1小2块玻璃板；（1）电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切去右上角（最后一个样品的最前端）作为电泳方向记号；（2）把凝胶翻面，放入加有足量的0.125M的 HCl玻璃盘中，轻轻摇动约10min，使电泳指示剂溴酚蓝变为黄色为止（脱嘌呤）。倒去HCl溶液，加蒸馏水漂洗凝胶；（3）倒去蒸馏水，加入足量变性缓冲液（NaOH/NaCl）淹没凝胶，轻轻摇动变性30min。倒去变性缓冲液，加蒸馏水漂洗；（4）倒去蒸馏水，加入足量的中和缓冲液（Tris/NaCl）淹没凝胶，轻轻摇动30min中和。倒去中和液，蒸馏水漂洗；（5）20SSC 中平衡10 min以上；(20SSC)，放上洗净的玻璃板，用2-3张滤纸放在玻璃板上，两端浸入转膜液中搭制盐桥（注意滤纸之间不能有气泡）3在盐桥滤纸上洒些转膜液，立即将胶放在盐桥上（注意凝胶与盐桥之间不要有气泡），胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路（即放置吸水纸与盐桥相接）4.小心将膜覆盖在凝胶上（膜可以先用H2O浸湿，再放到20SSC中平衡，膜与凝胶之间不要有气泡，要求一次成功，膜一旦贴到凝胶不能移动）5.膜上放2张滤纸，滤纸上放不少于5cm厚的吸水纸，放上玻板，其上压约350g的重物，转膜过夜；1.转膜完毕，将膜小心取下，2SSC 短暂漂洗，用两张滤纸包住膜，置于真空干燥箱中， 80固定2 h或120 30min；2.用EB染胶以检测转移效果；杂交液：5SSC (NaCl，柠檬酸钠)；50mM PB (NaH2PO4，Na2HPO4)；5Denhardt (多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA)；2.5mmEDTA （有/无）；100ug/ml SS DNA (鲑精DNA)；0.1%SDS；10%硫酸葡聚糖（dextran sulfate）；将尼龙膜在2SSC中浸湿，放入杂交管中，加入适量杂交液（杂交液浸没膜），赶气泡，封口，放入65C的杂交箱中，预杂交过夜。DiG Easy Hyb（将64ml 无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶（DiG Easy Hyb   Granules)，37 C摇动溶解5分钟）1.预热一定体积的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度37-42 C 。2.预杂交30分钟。在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42 C下充分润湿。（此过程可以延长至数小时）3.变性：Dig标记的探针（约25ng/ml）加50l H2O置沸水浴或98 C干浴锅中5分钟后迅速放在冰上冷却。（不能用碱变性！）4.将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，避免泡沫。5.倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液。继续在42 C下杂交6h 至过夜（单拷贝探针）。2SSC；SSC，0.1%SDS室温下洗涤5分钟，洗2次。SSC，0.1%SDS 65-68温和振荡15分钟，洗2次。Washing buffer；Maleic acid buffer；Detection buffer；Detection buffer；TE buffer；Blocking solution；Antibody solution(Ab) solution；Color-substrate solution；2.3.6.2操作步骤（室温下进行）1杂交和洗膜后，用马来酸缓冲液（Washing Buffer， Buffer1）浸泡1-5分钟2在100ml  1Block solution（Buffer2）中温育30分钟3用1Block solution（Buffer2）稀释抗体DIG-抗原偶联物至150mU/ml（1:5000）4用20ml antibody solution处理膜30分钟5用100ml Washing Buffer( Buffer1)洗膜15分钟，洗2次6在20ml detection buffer（Buffer3）中平衡2-5分钟7在10ml 新鲜配制的color substrate solution中处理膜5分钟，放在塑料袋或盒中，保持黑暗中。注意不要在显色过程中摇动(颜色沉淀在几分钟内开始出现，在16小时内完成显色反应，在显色过程中膜可在光亮处短暂暴露几次)9当预期的斑点出现时，可在50ml水中洗膜5分钟中止反应。10结果照像。3 实验结果和讨论  1      2       3     4图4.总DNA抽提凝胶电泳结果图4是本组所抽提的总DNA电泳检测结果。图中最左边为DNA Marker，1-4为抽提总DNA的条带。2号总DNA为本人抽提。可以看出，总DNA抽提过程中出现重大失误，总DNA条带并没有显现出来。并且由胶孔端有一团较亮的团带，可能是样品中的RNA未完全去除导致。2号总DNA在提取过程中受到了剧烈摇动，更可能是抽提过程中萃取后洗取上清时出现了问题，导致总DNA条带缺失。另外实验环境是一个开放环境，若实验操作不谨慎可能导致外源或内源DNA酶将所提取的DNA降解 ，若不慎引入杂菌或内源RNA未完全去除，则易在所提取的总DNA中混入RNA。    1          2        3         4总DNA经HindIII酶切检测结果如图5所示，其中2号为本人酶切，条带呈现均匀连续分布的一片，因此本组总DNA的酶切比较完全。本次酶切时间约为17个小时，本组1至4中条带都很均匀连续，酶切较完全，为之后的实验奠定了良好的基础。如图所示，转膜后的琼脂糖凝胶表面无条带显示，说明原本呈现其上的电泳带已完全转入硝酸纤维素膜上，图中所示胶块形状不规则是由于进行处理时胶块边缘部分与胶盘边缘碰撞所致。本组在进行凝胶处理时与上一组一起进行相关操作，导致两块胶之间碰撞频繁，而使边缘呈现较多缺口。因此在进行凝胶处理时最好单独操作，以减少不必要的损失。此外，盐桥搭建完毕后，将凝胶和膜依次放置其上时，应尽量减少其中的气泡，减小转膜时的阻碍。同时，塑料隔离板应适当插入胶底，并且塑料隔离板原理胶边缘段应防止吸水纸与下端滤纸接触，以防短路。图7所示为所制地高辛标记的DNA探针检测图，左端（近纸边缘端）为Control DNA,右端（远离纸边缘端）为所制的DNS探针。由左右对比可知，所致探针与Control DNA浓度接近，探针标记理想，可近似为200ng/ul。3.5 Southern印迹结果1  2  3  4  marker ern印迹结果图图8.所示即显色后的硝酸纤维素膜，其中1-4为总DNA与探针杂交后的结果，与4右端的DNA Marker相比，其上条带并不明显。而膜背景较“干净”说明用Washing Solution清晰较为透彻，但在取膜时玻璃棒损伤膜表面造成背景有深色划痕，影响观测结果。而条带不明显可能原因在于对硝酸纤维素膜进行相关操作时不够仔细，而其原始DNA浓度较低，从而导致条带不明显，只有隐约的两条。本次Southern杂交实验结果不理想，总结原因所列如下，在进行凝胶的预处理时，进行变性或复性等处理时，操作过于随意，导致凝胶形状不规则，背景杂乱，不利于后期转膜以及观察，因此，在今后进行相关操作时应注意保持凝胶的完整性。此外，虽然探针检测时近似标准浓度，但是由结果推测，杂交时探针可能也出现了问题，诸多问题，在以后的Southern杂交实验中需要注意与解决。 三、基因表达检测摘要本实验中选择在转录水平上对基因表达量进行检测，采用RT-PCR的常见方法；即将用Trizol 试剂抽提出的转基因水稻幼嫩叶片的RNA进行反转录，然后将得到的cDNA进行PCR扩增，通过检测扩增后的DNA的浓度差异来对RNA的量进行估计。关键词Trizol 试剂；反转录；RT-PCR;表达量检测；1 前言基因表达分析的转录水平常用方法有Realtime PCR、Northern Blotting和RT-PCR等。RNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增，称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。本实验中采用Trizol 试剂进行转基因水稻mRNA的抽提，Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern,RT-PCR,分离RNA，体外翻译和分子克隆等。由于所提取的mRNA不能直接进行PCR，所以其必须反转录为cDNA才能进行下一步的PCR操作。反转录是指进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶（M-MLV RT）能以单链RNA或DNA为模板，在引物的引发下合成与模板互补的DNA链。本实验中使用invitrogen公司提供的MMLV反转录酶，将所抽提的RNA反转录为cDNA，以便进行PCR扩增。本实验以水稻叶片RNA为材料，检测转基因水稻gus基因的表达。实验中设置一个看家基因作为阳性对照，判断RNA 的定量及反转录、PCR等过程是否有问题；设置一个不加模板RNA的阴性对照，主要是消除DNA及PCR试剂方面引起的假阳性；同时设置一个以叶片DNA为阳性对照，检验扩增带型是否来源于反转录的cDNA,2 材料和方法2.1植物总RNA的抽提（Trizol试剂法）和电泳检测转gus基因水稻的幼嫩叶片；Trizol试剂；氯仿；异丙醇；75%乙醇；DEPC水；RNA的抽提及检测步骤1.液氮研磨植物叶片，每1.5ml tube分装克样品；1毫升Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积的10），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置510分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；200 l的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右；，12000rpm冷冻离心10-15分钟；5.将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室温下沉淀10分钟；，12000rpm离心15分钟；7.弃上清，加1ml 75乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500rpm离心5分钟，小心弃上清；515分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 l DEPC水溶解保存于-70 。2 l进行琼脂糖电泳检测RNA质量。RT-PCR(反转录PCR) 用Trizol试剂抽提的植物总RNA；反转录试剂：RNase-free DNase I;10DNase I buffer;DEPC-treated ddH2O;PCR试剂：TaKaRa Ex Taq(5u/ml)；dNTP mixture(2mM);10Ex Taq buffer;mg/ml;2.用处理过的RNA专用0.5ml管按下列反应体系配置反应（冰上操作）； Total RNA 3ml(2-5mg) RNase-free DNase I    ml (u / ml) 10 DNase I buffer1 ml DEPC-treated ddH2O         5 ml3.37保温15 min,然后放于70水浴锅中10 min进行失活. 4.反转录反应（冰上操作）（1）加入1 ml oligo (dT)（500 mg / ml）15 primer, 轻柔搅拌并短暂离心以混匀。（2）在70下将混合物干浴10min，然后立刻在冰上放置5min;（3）配置下列反应5 first strand buffer4 ml0.1 M DTT2 ml10 mM dNTP 1 mlM-MLV (200 U / ml)    1 mlml在37水浴保温1小时；处理15min终止反应，然后加入20mlddH2O稀释；3.2.4 PCR反应以及检测步骤体系1 First strand cDNA 1 mlTaKaRa Ex Taq (5 u / 1 ml)0.5 ml10 Ex Taq buffer2 mldNTP mixture (2 mM)2 mlGUS F (10 mM)0.5 mlGUS R (10 mM)0.5 ml ddH2O13.5 ml 体系2First strand cDNA 1 mlTaKaRa Ex Taq (5 u / 1 ml)0.5 ml10 Ex Taq buffer2 mldNTP mixture (2 mM)2 mlGAPDH F1 (10 mM)0.5 mlGAPDH R1 (10 mM)0.5 ml ddH2O13.5 ml 2.混匀后，短暂离心，每管加一滴矿物油。3.PCR反应循环条件设置：94        55       72      4      CyclesStep1    3min                                      1Step2     45s         45s        1min               30-40Step3                            5min               1Step4                                      foreverTBE配置0.8%的琼脂糖凝胶；加5mlPCR产物按照1、2、4、6号（具体号码所对应的DNA来源见图（9）的体系1、植物总DNA阳性对照、阴性对照、DNA Marker2000；的顺序点样；在下排孔内按照1、2、4、6号（具体号码所对应的DNA来源见图（9）的体系2、植物总DNA阳性对照、阴性对照、DNA Marker2000；的顺序点样.下图为所用引物对3 实验结果和讨论3.1 RNA的琼脂糖凝胶电泳  1   2  3   4   5  ;6RNA电泳检测如图9所示而2泳道RNA为本人抽提时，相比之下浓度较高一些，但是由靠近胶孔的亮带可知有DNA杂质的污染。有溴化乙锭存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊的迁移较快的带。如果RNA没有降解， 28S rRNA的亮度应当是18S rRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。在本实验结果中， 2号泳道的条带较亮，抽提的RNA质量较高，但其上部靠近胶孔的地方均可看到一条带，说明所提取的RNA有DNA的污染；操作时所加试剂相对太少或者用来分离RNA的样品中含有机溶剂（乙醇，DMSO等）或碱溶液并且实验过程中不注意的动作导致污染，可用DNase再次处理以纯化RNA。在今后的试验中应注意DNA的清除。3.2 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图图10所示为PCR凝胶电泳结果，由胶图可知出现重大失误。PCR产物电泳跑出凝胶。上边一排的带形在下边一排的凝胶点样孔隐约可见。PCR结果还是比较成功的，但是下排所点样品已经跑出凝胶，无法确认最后的PCR结果。对于非常易降解的RNA，它的反转录是一个需要严谨耐心的实验操作，实验过程中应尽量避免外源和内源RNase对所提RNA进行降解，因此在进行实验时应注意戴手套，并尽量避免面对实验材料进行说话或呼吸或直接接触实验材料以及用具。从本PCR实验中可知，在设计PCR反应时，反应的对照应该严谨而巧妙地设计，使其能够达到相互对照而显示试验中的问题所出现的步骤的效果。在以后的试验中，一定要杜绝这样低级的错误，避免给实验带来巨大的打击。