线粒体提取步骤.doc

线粒体的提取步骤制备程序：a. 组织匀浆：称取50-200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS冲洗，用剪刀剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块总体积。加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution。上下研磨组织20次。b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 g 510 min离心收集细胞。计数。每次提取需要2-5 107个细胞。加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内。用间隙严密的研杵研磨细胞30-40次。1. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管。800 g 离心5 min 4 C。细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底,弃去。2. 收集上清液并转移到新的离心管。800 g 离心5 min at 4 C。弃沉淀3. 将上清液转移到新的离心管。10,000 g 离心10 min 4 C。离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管，可收集用于对照实验。线粒体沉淀在管底。4. 洗涤线粒体：清除管内壁粘连的液体和碎片，加入0.2 ml Mito Sdution轻弹管底重悬线粒体沉淀，12,000 g 离心10 min 4 C。弃上清，线粒体沉淀在管底。5. 用Mito Sdution或合适后续实验的自备缓冲液重悬线粒体沉淀50 l/每100 mg组织或100 l/5 107个细胞。测定蛋白浓度。立即使用或70 C保存。注意：1. 为保证获得完整的线粒体，第一是全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。第二是快速。微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的线粒体。第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。在相差显微镜下检查未裂解细胞应在50%左右即可。过度研磨将破坏线粒体，研磨不足将降低得率。2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入样品缓冲液裂解线粒体。4. 细胞色素c氧化酶可用作线粒体的标志酶。威斯腾生物 400-675-6758