微生物基因工程2.pptx

第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达（二）（二）6.6 酵母基因表达系统 6.6.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 6.6.2 酵母菌的宿主系统 6.6.3 酵母菌的载体系统 6.6.4 酵母菌的转化系统 6.6.5 酵母菌的表达系统 6.6.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。6.6.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉能将外源基因表达产物分泌至培养基中不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物6.6.2 酵母菌的宿主系统w提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌w抑制超糖基化作用的突变宿主菌w减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌w广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：w酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）w克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）w毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）w裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）w汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）w其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团,它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白质 的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：wUBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达、稳定期关闭wUBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达、稳定期关闭wUBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达、稳定期关闭wUBI 4 编码泛素五聚体对数生长期关闭、稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：wUBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI 4缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。UBA 1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。Ubc4-ubc5 双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。6.6.3 酵母菌的载体系统w酵母菌中的野生型质粒w酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌中的野生型质粒乳酸克鲁维酵母中的线状质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线状质粒pGKL1和pGKL2拷贝数为 50-100个，分别携带K1K2两种能使多种酵母菌致死的毒素蛋白编码基因（），同时含有毒素蛋白抗性基因。酵母菌克隆表达载体的类型wYRp -酵母菌复制型质粒wYEp -酵母菌游离型质粒wYCp -酵母菌着丝粒质粒wYIp -酵母菌整合型质粒wYLp -酵母菌线性型质粒酵母菌克隆表达质粒的构建含有ARS的YRp质粒的构建 ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。以ARS为复制子的质粒称为YRp含有酵母菌固有质粒2环序列的的YRp质粒的构建 以2质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。酵母菌克隆表达质粒的构建含有CEN的YCpp质粒的构建wCEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列。w将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp。wYCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个。酵母菌克隆表达质粒的构建含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为YIp。YIp缺乏支持质粒在酵母菌中自主复制的元件，目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域6.6.4 酵母菌的转化系统w转化质粒在酵母细胞中的命运w酵母菌的转化程序w用于转化子筛选的标记基因转化质粒在酵母细胞中的命运w单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍w含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制w不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体这对于体内定点突变酵母基因组极为有利w克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80%酵母菌的转化程序w酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%酵母菌的转化程序 碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：w吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差 80倍w共转化现象极为罕见酵母菌的转化程序w酵母菌电击转化法 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率可高达105转化体/gDNA。用于转化子筛选的标记基因用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类:营养缺陷型的互补基因w营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：wLEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难 6.6.5 酵母菌的表达系统w酵母菌启动子的可控性w外源基因在酵母菌中表达的限制因素w酵母菌表达系统的选择酵母菌启动子的可控性温度控制型启动子pho4TS-PHO5启动子：酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开。PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子，PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35时失活，因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35时关闭、23诱导表达外源基因在酵母菌中表达的限制因素w外源基因稳态mRNA的浓度w外源基因mRNA的翻译活性w酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25个密码子编码的酵母菌表达系统的选择 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酿酒酵母表达系统酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。酵母菌表达系统的选择 乳酸克鲁维酵母表达系统w乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。w乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。酵母菌表达系统的选择巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。酵母菌表达系统的选择多型汉逊酵母表达系统 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获得成功表达。6.7 哺乳动物基因表达系统A 高等哺乳动物基因工程的基本概念 B 高等哺乳动物的受体系统C 高等哺乳动物的载体系统D 高等哺乳动物的基因转移E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 B 高等哺乳动物的受体系统 w高等哺乳动物细胞的生长特性w高等哺乳动物受体细胞的条件w高等哺乳动物受体细胞的遗传标记w常用的高等哺乳动物受体细胞高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：w锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂w血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长w接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制w形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构 上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。高等哺乳动物受体细胞的条件 以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞 应具备下列条件：w细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养w遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存w合适的标记 便于转化株的筛选和维持w生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制w安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌 大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk-）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞 不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补（hprt-）常用的高等哺乳动物受体细胞 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优势有如下几个方面：w遗传背景清楚，生理代谢稳定w与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确w基因转移和载体表达系统完善w耐受剪切力，便于大规模培养w被美国FFDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）C 高等哺乳动物的载体系统w人腺病毒DNAw猴空泡病毒DNA（SV40）w人乳多瘤病毒DNA（BKV）w人牛痘病毒DNA人腺病毒DNA腺病毒的生物学特性 腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。人腺病毒DNA腺病毒DNA载体的特点w基因重排低：外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期w安全性能好：不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤w宿主范围广：对受体细胞是否处于分裂期要求不严格w使用效果好：外源基因在载体上容易高效表达猴多瘤病毒DNA（猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的生物学特性 SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNASV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，便发生非同源整合而致癌。猴多瘤病毒DNA（猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40 DNA载体的特点w基因表达好 外源基因能高效表达w基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和 缺失现象w宿主范围窄 只能转染猴细胞w装载量较小 人乳多瘤病毒DNA （人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒的生物学特性 人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝人牛痘病毒DNA人牛痘病毒的生物学特性人牛痘病毒是一个大型DNA病毒，基因组长185 kb，能在宿主细胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘病毒基因组较大，体外DNA重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。人牛痘病毒DNA人牛痘病毒DNA表达载体的构建 目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。D 高等哺乳动物的基因转移w哺乳动物细胞的物理转化法w哺乳动物细胞的病毒转染法哺乳动物细胞的物理转化法 利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞，往往以多拷贝的形式随机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。哺乳动物细胞的物理转化法磷酸钙共沉淀法 将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2 2溶液混匀，此时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受体细胞；将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37保温4-16小时弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。如果在外源DNA中掺入少量的受体细胞内源性DNA可以提高转化效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNA，可使正常细胞转化为癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。哺乳动物细胞的物理转化法电击转化法 将待转化的DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。哺乳动物细胞的物理转化法脂质体介导法 将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融合，DNA随即进入胞质和核内。利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa细胞。哺乳动物细胞的物理转化法显微注射法 通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵；借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄性原核内。上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操作，所以不太适用于基因的克隆和表达。哺乳动物细胞的物理转化法血影细胞介导法 血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的同时，外源DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可恢复原来的通透性。因此，可先将外源DNA转入血影细胞，然后再将血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受体细胞。哺乳动物细胞的病毒转染法 以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白w哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理w利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体w利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂w利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因哺乳动物细胞内的基因扩增现象 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因 GS-MSX高效表达系统 谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细胞的毒害作用。先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常的MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-MTX系统优越之处。胞中，哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白 迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：干扰素 干扰素 凝血因子VIII 凝血因子IX 促红细胞生成素（EPO）生长因子（hGH）白介素2（IL-2）乙型肝炎表面抗原 单克隆抗体 CD4受体 组织型纤溶酶原激活剂（tPA）利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII 凝血因子VIII编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子VIII生物制品进行治疗，然而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制品的血友病人惨遭感染，其中10%的病人最终死于爱滋病而非血友病。早在上述情况发生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鉴定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPA相似，人凝血因子VIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子VIII尚不能满足几代血友病人的大量需求。