微生物代谢控制发酵.pptx

微生物代谢控制发酵微生物代谢控制发酵王王 腾腾 飞飞13869144397第五章第五章 代谢控制发酵的应用代谢控制发酵的应用u第一节第一节 糖代谢与控制糖代谢与控制 糖代谢的途径；糖代谢的调节机制u第二节第二节 柠檬酸发酵机制与代谢调控柠檬酸发酵机制与代谢调控 柠檬酸的生物合成途径；柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制；柠檬酸发酵的产率；柠檬酸产生菌的育种u第三节第三节 脂类代谢与控制脂类代谢与控制 脂类代谢与调节；谷氨酸的生物合成途径；谷氨酸代谢调节机制；谷氨酸生产菌的育种思路第五章第五章 代谢控制发酵的应用代谢控制发酵的应用u第四节第四节 氨基酸代谢控制与发酵氨基酸代谢控制与发酵 赖氨酸的生物合成途径；赖氨酸代谢调节机制；赖氨酸生产菌的育种思路u第五节第五节 核苷酸类物质的代谢控制与发酵核苷酸类物质的代谢控制与发酵 核苷酸生物合成的调节机制；肌苷发酵的代谢控制育种u第六节第六节 抗生素发酵的代谢与控制抗生素发酵的代谢与控制 抗生素的基本合成途径、关键酶、调控措施。淀粉淀粉葡萄糖葡萄糖第一节 糖代谢与控制-淀粉酶及-淀粉酶水解支链淀粉的示意图-淀粉酶淀粉酶-淀粉酶淀粉酶 淀粉降解 1.到分枝前4 4个G时，淀粉磷酸化酶停止降解2.由转移酶切下前3 3个G，转移到另一个链上3.脱支酶水解-1，6糖苷键形成直链淀粉。脱下的Z是一个游离葡萄糖4.最后由磷酸化酶降解形成G-1-PG G1 1P P脱支酶磷酸化酶海藻糖海藻糖乳糖乳糖蔗糖蔗糖半乳糖半乳糖甘露糖甘露糖单磷酸己糖途径（HMP）磷酸戊糖循环（PP环）糖酵解途径（EMP）双磷酸己糖途径（HDP）三羧酸循环（TCA）柠檬酸循环克雷布斯循环乙醛酸循环ED途径2-酮-3脱氧-6-磷酸葡萄糖酸裂解途径CO2固定作用伍德-沃克曼反应丙酮酸葡萄糖“糖酵解”不需氧“磷酸戊糖途径”需氧有氧情况缺氧情况好氧生物厌氧生物“三羧酸循环”“乙醛酸循环”CO2+H2O“乳酸发酵”乳酸“乳酸发酵”、“乙醇发酵”乳酸或乙醇 CO2+H2O各种代谢途径的利用比例o多种代谢途径可以同时存在于一个细胞内，不同代谢途径在细胞中存在的比例因微生物不同而异o只有少数细菌以HMP途径作为有氧分解的唯一途径，如醋酸杆菌等；而有些微生物中只有EMP或ED途径P3PPOOHOHCH2CH2OO12546P磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮123+P异构6-磷酸果糖磷酸果糖P564磷酸甘油醛磷酸甘油醛PP1，3-二磷酸二磷酸甘油酸甘油酸PCOHCOHH2COOH3-磷酸甘油酸磷酸甘油酸P2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸P磷酸烯醇磷酸烯醇式丙酮酸式丙酮酸丙酮酸丙酮酸6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖PG葡萄糖葡萄糖活化裂解脱氢异构PP1，6-二磷二磷酸果糖酸果糖活化产能脱水异构产能HHOHE1:己糖激酶己糖激酶E2:6-磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶E3:丙酮酸激酶丙酮酸激酶NAD+乳乳酸酸糖酵解的代谢途径GluG-6-PF-6-PF-1,6-2PATP ADPATPADP1,3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸丙丙酮酮酸酸磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛NAD+NADH+H+ADPATPADPATP磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸E2E1E3NADH+H+TCAo三三羧羧酸酸循循环环（Tricarboxylic acid cycle；TCA cycle）又柠柠檬檬酸酸循循环环（Citric Acid Cycle），是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，因为在这个循环中几个主要的中间代谢物是含有三个羧基的柠檬酸，因此得名；或者以发现者汉斯阿道夫克雷伯命名为克雷伯氏循环，简称克氏循环克氏循环（Krebs cycle）。o三羧酸循环是三大营养素（糖类、脂类、氨基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。分子分子酶酶反应类型反应类型反应物反应物/辅酶辅酶产物产物/辅酶辅酶I.柠檬酸1.乌头酸酶脱水脱水H2OII.顺-乌头酸2.乌头酸酶复水合复水合H2OIII.异柠檬酸3.异柠檬酸脱氢酶氧化氧化NAD+NADH+H+IV.草酰琥珀酸4.异柠檬酸脱氢酶脱脱羧V.-酮戊二酸5.-酮戊二酸脱氢酶复合体氧化脱氧化脱羧NAD+CoA-SHNADH+H+CO2VI.琥珀酰辅酶A6.琥珀酰辅酶A合成酶底物水平磷酸化底物水平磷酸化GDPPiGTPCoA-SHVII.琥珀酸7.琥珀酸脱氢酶氧化氧化FAD+FADH2VIII.延胡索酸8.延胡索酸酶水合水合IX.L-苹果酸9.苹果酸脱氢酶氧化氧化NAD+NADH+H+X.草酰乙酸10.柠檬酸合成酶加成加成XI.乙酰辅酶AATP+0.5ADP 能 荷(Energy charge)ATP+ADP+AMP=需能需能 ATPATP分解分解 能荷降低能荷降低 激活催化糖类分解的酶激活催化糖类分解的酶 解除解除ATPATP对酶的抑制对酶的抑制加速糖酵解、加速糖酵解、TCATCA循环循环多产生能量多产生能量多能多能 ATPATP增加增加 能荷升高能荷升高 激活糖元合成的酶激活糖元合成的酶 抑制糖分解途径关键酶抑制糖分解途径关键酶减慢糖酵解、减慢糖酵解、TCATCA循环循环少产生能量少产生能量糖代谢的能荷调节糖代谢的能荷调节糖代谢的生物素调节糖代谢的生物素调节（2）生物素的调节o生物素是羧化生物素是羧化酶的辅酶，它酶的辅酶，它本身就是一种本身就是一种B族维生素族维生素B7。生物素，又称为生物素，又称为生物素，又称为生物素，又称为VHVH或或或或VB7VB7。是附有一个噻吩环的尿素。是附有一个噻吩环的尿素。是附有一个噻吩环的尿素。是附有一个噻吩环的尿素衍生物。衍生物。衍生物。衍生物。o生物素主要是影响糖代谢的速度o生物素充足时，糖分解速度提高，造成乳酸积累o生物素缺乏时，丙酮酸氧化能力下降，乙醛酸途径基本是封闭的生物素充足时：生物素充足时：苹苹果果酸酸、草草酰酰乙乙酸酸脱脱羧羧反反应应活活跃跃，琥琥珀珀酸酸氧氧化化能能力力增增强强，倾倾向向于于完完全全氧氧化化，ATP增增加加，蛋蛋白白质质合合成成加加剧剧，谷氨酸剧减。，谷氨酸剧减。生物素缺乏时：生物素缺乏时：苹苹果果酸酸、草草酰酰乙乙酸酸脱脱羧羧反反应应停停滞滞，琥琥珀珀酸酸氧氧化化能能力力弱弱，异异柠柠檬檬裂裂解解酶酶很很少少，乙乙醛醛酸酸循循环环微微弱弱，完完全全氧氧化化能能力力降降低低，ATP减减少少，蛋蛋白白质质合合成成降降低低，大大量量积积累累谷谷氨氨酸。酸。第二节 柠檬酸发酵机制与代谢调控柠檬酸柠檬酸citric acid取代羧酸取代羧酸羟基酸羟基酸醇酸醇酸乳酸乳酸苹果酸苹果酸酒石酸酒石酸 柠檬酸柠檬酸（枸椽酸）（枸椽酸）-羟基丙酸羟基丙酸2-羟基丙酸羟基丙酸 3 2 1羟基丁二酸羟基丁二酸2,3-二羟基丁二酸二羟基丁二酸2-羟基羟基-1,2,3-丙烷三羧酸丙烷三羧酸*柠檬酸又名枸橼酸。存在于柠檬、菠萝、葡萄等水果中，柠檬酸又名枸橼酸。存在于柠檬、菠萝、葡萄等水果中，此外，天麻、覆盆子、五味子等中药中也有存在。此外，天麻、覆盆子、五味子等中药中也有存在。柠檬酸为无色晶体，常一分子结晶水。易溶于水和乙醇。柠檬酸为无色晶体，常一分子结晶水。易溶于水和乙醇。具有多元羧酸的性质，易与金属离子形成络合物。具有多元羧酸的性质，易与金属离子形成络合物。柠柠檬檬酸酸与与酒酒石石酸酸、苹苹果果酸酸一一样样，广广泛泛用用作作食食品品的的酸酸味味剂剂。在在食食品品和和医医学学上上用用作作多多价价螯螯合合剂剂，也也是是化化学学中中间间体体，临临床床上上，用用柠柠檬檬酸酸作作矫矫味味剂剂。许许多多柠柠檬檬酸酸盐盐具具有有特特定定的的生生理理活活性性，如如：枸枸橼橼酸酸铁铁铵铵（抗抗贫贫血血药药），枸枸橼橼酸酸铋铋钾钾（抗抗溃溃疡疡药药）等等。柠柠檬檬也也可可用用于于与与碱碱性性药药物物成成盐盐，成成为为溶溶于于水水的的制制剂剂，如如枸枸橼橼酸酸哌嗪（抗蠕虫药）。哌嗪（抗蠕虫药）。1、柠檬酸的发酵机制2C6H12O6+3O22C6H8O7+4H2O理论产率：106.6%116.6%2、柠檬酸的代谢控制o能够生产柠檬酸的微生物很多o工业上以淀粉糖为原料直接发酵生产柠檬酸的主要是曲霉属（Aspergillus）菌株o黑曲霉（Aspergillus niger）诱变育种（breeding by induced mutation）指通过人工方法处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的突变株的过程。在此过程中，诱变和筛选是两个主要环节。诱发突变（induced mutation）物理因素紫外线（ultraviolet light）X射线和射线 化学因素碱基结构类似物与核酸上碱基起化学反应的诱变剂移码诱变剂投产率多数不宜投产少数适宜投产多数幅度小少数幅度大高产率大多死亡少数存活存活率多数未变少数突变突变率多数负变少数正变正变率诱变育种的基本环节诱变育种的基本环节出发菌株计算出诱变 诱变育种的基本原则选择简便有效的诱变剂挑选优良的出发菌株处理单细胞或单孢子悬液选用最适的诱变剂量充分利用复合处理的协同效应利用和创造形态、生理与产量间的相关指标设计高效筛选方案创造新型筛选方法柠檬酸发酵优良突变株的筛选1、形态学观察法 黑曲霉的形态突变与柠檬酸产量之间有一定的关系，通过选育形态突变株，有助于柠檬酸高产菌株的获得。例如，选育在葡萄糖培养基上孢子不生长、迟长或者少长的突变株。？柠檬酸发酵优良突变株的筛选2、透明圈法甘薯粉 10%琼脂 2%碳酸钙 0.5%？柠檬酸发酵优良突变株的筛选3、显色圈法麦芽汁培养基pH指示剂（溴酚蓝 0.01%）？柠檬酸发酵优良突变株的筛选4、高渗透压法 高产柠檬酸的菌株必须在高糖和高柠檬酸浓度的培养基上能够生长，即具备耐受高糖和高柠檬酸的能力。甘薯粉 15%.柠檬酸 20%.柠檬酸发酵优良突变株的筛选5、选育不分解柠檬酸的突变株 用以柠檬酸为唯一碳源的培养基，选择菌体不生长或生长微弱的突变株。柠檬酸发酵优良突变株的筛选6、选育某些氨基酸缺陷的突变株 如：谷氨酸缺陷型、精氨酸缺陷型等7、选育抗药性突变株 如：寡霉素抗性、萘啶酮酸抗性等8、选育强化CO2固定反应的突变株 如：将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因克隆到高拷贝载体上，使之扩增第三节脂类代谢与控制脂类物质脂肪磷脂固醇蜡脂类的代谢与调节多不饱和脂肪酸o含两个或两个以上双键且碳原子数为16-22的直链脂肪酸。如亚麻酸，花生四烯酸，二十二碳六烯酸等。o多不饱和脂肪酸可广泛用于医药、食品、化装品、饲料等领域。-亚麻酸o是人体不能缺少、自身又不能合成或替代的必需脂肪酸。o人体一旦缺乏，首先至关重要的前列腺素PGE1、PGE2、PGE3、就不能合成，免疫、心脑血管 生殖内分泌等系统就会出现异常，发生紊乱，从而引起高血脂、高血压、血栓症、动脉粥样硬化、风湿病、糖尿病、皮肤粗糙、加速衰老化等一系列疾病。o特别是对脑组织的生长发育相当重要，因为脑重量的20%是由必需脂肪酸组成的。产生菌：多用被孢霉、毛霉、红教母、小克银汉霉o-亚麻酸Gamma linolenic Acid（十八碳三烯酸，维生素F，Octadecatrienoic Acid，GLA）育种措施育种措施1：切断或减弱支路代谢切断或减弱支路代谢育种措施育种措施2：解除反馈调节解除反馈调节耐高浓度-亚麻酸突变株-亚麻酸结构类似物抗性突变株如LTBr育种措施育种措施3：增加前体物质的合成增加前体物质的合成育种措施育种措施4：选育选育6脱氢酶脱氢酶活力强的突变株活力强的突变株TTC酶活测定法酶活测定法TTC是一种无色的氧化还原剂，能被6脱氢酶还原成红色的物质，红色越深，酶活越强。育种措施育种措施5：强化能量代谢：强化能量代谢提高菌体细胞内提高菌体细胞内ATP的水平，的水平，有利于脂肪酸的合成。有利于脂肪酸的合成。选育呼吸抑制剂抗性突变株选育呼吸抑制剂抗性突变株（如抗丙二酸、氰化钾、亚砷酸）（如抗丙二酸、氰化钾、亚砷酸）选育选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株磷酸化抑制剂抗性突变株（如抗羟胺（如抗羟胺2，4二硝基酚）二硝基酚）选育选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株磷酸化抑制剂抗性突变株（如抗羟胺（如抗羟胺2，4二硝基酚）二硝基酚）选育抑制能量代谢的抗生素抗性突变株选育抑制能量代谢的抗生素抗性突变株（如抗寡霉素、缬氨霉素）（如抗寡霉素、缬氨霉素）育种措施育种措施6：选育低温生长突变株：选育低温生长突变株细胞膜由脂质和蛋白质组成，脂质分子中不饱细胞膜由脂质和蛋白质组成，脂质分子中不饱和脂肪酸的含量越高，细胞膜的流动性越大，适宜和脂肪酸的含量越高，细胞膜的流动性越大，适宜在低温下生长。在低温下生长。育种措施育种措施7：选育耐高糖的突变株：选育耐高糖的突变株谷氨酸的生物合成机制与代谢调节谷氨酸的生物合成机制与代谢调节 o谷氨酸发酵作为重点：谷氨酸发酵作为重点：o（1）是代谢控制发酵的重点）是代谢控制发酵的重点 o（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的践上最成熟的 o一、谷氨酸的生物合成途径一、谷氨酸的生物合成途径o主要有：主要有：oGlucose的酵解，的酵解，EMP oGlucose的有氧氧化，的有氧氧化，HMP o丙酮酸的有氧氧化，丙酮酸的有氧氧化，TCA循环循环 o乙醛酸循环途径，乙醛酸循环途径，DCA循环循环 oCO2固定反应固定反应 o-KGA（-酮戊二酸）的还原氨基化酮戊二酸）的还原氨基化o这这6条途径之间是相互联系和相互制约的。条途径之间是相互联系和相互制约的。o二、谷氨酸代谢调节机制二、谷氨酸代谢调节机制o谷氨酸发酵是控制磷脂合成代谢的典型例子。谷氨酸发酵是控制磷脂合成代谢的典型例子。o正常情况下，谷氨酸产生菌的细胞膜不允许正常情况下，谷氨酸产生菌的细胞膜不允许谷氨酸从细胞内渗透到细胞外。在谷氨酸发谷氨酸从细胞内渗透到细胞外。在谷氨酸发酵过程中，一般是通过控制生物素亚适量、酵过程中，一般是通过控制生物素亚适量、添加吐温添加吐温60或青霉素等手段来调节细胞膜的或青霉素等手段来调节细胞膜的渗透性，使细胞允许谷氨酸从细胞内渗透到渗透性，使细胞允许谷氨酸从细胞内渗透到细胞外。细胞外。o（1）优先合成）优先合成o谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢量后，抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢流转向天冬氨酸。流转向天冬氨酸。o（2）谷氨酸脱氢酶（）谷氨酸脱氢酶（GD）的调节）的调节o谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏。馈阻遏。o（3）柠檬酸合成酶的调节）柠檬酸合成酶的调节 o柠檬酸合成酶受能荷调节、谷氨酸的反馈抑柠檬酸合成酶受能荷调节、谷氨酸的反馈抑制和顺乌头酸的反馈抑制。制和顺乌头酸的反馈抑制。o（4）异柠檬酸脱氢酶的调节）异柠檬酸脱氢酶的调节o细胞内细胞内-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡。当持平衡。当-酮戊二酸过量时，对异柠檬酸酮戊二酸过量时，对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成-酮戊酮戊二酸。二酸。o（5）-酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸生产菌中先酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸生产菌中先天性丧失或微弱。天性丧失或微弱。o（6）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。遏。o（7）谷氨酸的合成还与糖代谢、氮代谢的）谷氨酸的合成还与糖代谢、氮代谢的调节有关。调节有关。o三、谷氨酸生产菌的育种思路三、谷氨酸生产菌的育种思路 第四节第四节 氨基酸合成的代谢调节氨基酸合成的代谢调节o本节以赖氨酸为例，说明氨基酸合成的调节本节以赖氨酸为例，说明氨基酸合成的调节方法方法o谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌Lys合成途径合成途径 葡萄糖葡萄糖o o 协同反馈抑制协同反馈抑制 天冬氨酸天冬氨酸 AKAKo 天冬氨酰磷酸天冬氨酰磷酸o o 天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛o PSPS HD HDo 二氨基庚二酸二氨基庚二酸(DAP)(DAP)高丝氨酸（高丝氨酸（Hom)Hom)o HK HK o 赖氨酸赖氨酸(Lys)(Lys)苏氨酸苏氨酸(Thr)(Thr)蛋氨酸蛋氨酸(Met)(Met)o o 异亮氨酸异亮氨酸o AK 天冬氨酸激酶；天冬氨酸激酶；PS 二氢吡啶二羧酸合成酶；二氢吡啶二羧酸合成酶；o HD 高丝氨酸合成酶；高丝氨酸合成酶；HK 高丝氨酸激酶高丝氨酸激酶o各种氨基酸代谢控制育种各种氨基酸代谢控制育种 核苷酸合成的代谢调节核苷酸合成的代谢调节o肌苷（肌苷（inosine）又名次黄嘌呤核苷，）又名次黄嘌呤核苷，o可以直接透过细胞膜进入细胞内参与人体代可以直接透过细胞膜进入细胞内参与人体代谢，促进体内能量代谢和蛋白质合成，还能谢，促进体内能量代谢和蛋白质合成，还能提高丙酮酸氧化酶活力，使低能、缺氧状态提高丙酮酸氧化酶活力，使低能、缺氧状态细胞的细胞的ATP水平提高。水平提高。o1枯草芽胞杆菌嘌呤核苷酸生物合成的调枯草芽胞杆菌嘌呤核苷酸生物合成的调节机制：节机制：o2枯草芽胞杆菌嘌呤核苷酸生物合成的调枯草芽胞杆菌嘌呤核苷酸生物合成的调节控制节控制