微生物工程-发酵过程的控制.pptx

第二节第二节 发酵过程的发酵过程的pHpH控制控制 pH是微生物代谢的综合反映，又影响代是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。谢的进行，所以是十分重要的参数。发酵过程中发酵过程中pH是不断变化的，通过观察是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否变化规律可以了解发酵的正常与否一、发酵过程一、发酵过程pHpH变化的原因变化的原因 1 1、基质代谢、基质代谢（1）糖代谢）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一上升，是补料的标志之一（2）氮代谢）氮代谢 当氨基酸中的当氨基酸中的-NH2被利用后被利用后pH会下降；尿素被分解成会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，上升，NH3利用后利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳下降，当碳源不足时氮源当碳源利用源利用pH上升。上升。（3）生理酸碱性物质利用后）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下会上升或下降降2 2、产物形成产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使变化。如有机酸类产生使pH下降，下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使碱性，使pH上升。上升。3 3、菌体自溶菌体自溶，pH上升，发酵后期，上升，发酵后期，pH上升。上升。二、二、pH对发酵的影响对发酵的影响 例例pH对林可霉素发酵的影响对林可霉素发酵的影响 林林可可霉霉素素发发酵酵开开始始，葡葡萄萄糖糖转转化化为为有有机机酸酸类类中中间间产产物物，发发酵酵液液pH下下降降，待待有有机机酸酸被被生生产产菌菌利利用用，pH上上升升。若若不不及及时时补补糖糖、(NH4)2SO4或或酸酸，发发酵酵液液pH可可迅迅速速升升到到8.0以以上上，阻阻碍碍或或抑抑制制某某些些酶酶系系，使使林林可可霉霉素素增增长长缓缓慢慢，甚甚至至停停止止。对对照照罐罐发发酵酵66小小时时pH达达7.93，以以后后维维持持在在8.0以以上上至至115小小时，菌丝浓度降低，时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。升高，发酵不再继续。发发酵酵15小小时时左左右右，pH值值可可以以从从消消后后的的6.5左左右右下下降降到到5.3，调调节节这这一一段段的的pH值值至至7.0左左右右，以以后后自自控控pH，可可提提高高发发酵酵单位。单位。1、实例、实例pH7.0t不调不调pH调调pH效价效价pH例：培养基初始例：培养基初始pHpH值对漆酶分泌的影响值对漆酶分泌的影响pH在在47范围内产酶最高范围内产酶最高2 2、pHpH对发酵的影响对发酵的影响（1）pH影影响响酶酶的的活活性性。当当pH值值抑抑制制菌菌体体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行代谢的进行（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用的解离，从而影响微生物对这些物质的利用（4）pH影响代谢方向影响代谢方向pH不不同同，往往往往引引起起菌菌体体代代谢谢过过程程不不同同，使使代代谢谢产产物物的的质质量量和和比比例例发发生生改改变变。例例如如黑黑曲曲霉霉在在pH23时时发发酵酵产产生生柠柠檬檬酸酸，在在pH近中性时，则产生草酸。近中性时，则产生草酸。谷谷氨氨酸酸发发酵酵，在在中中性性和和微微碱碱性性条条件件下下积积累累谷谷氨氨酸酸，在在酸酸性性条条件件下下则则容容易易形形成成谷谷氨酰胺和氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺乙酰谷氨酰胺3 3、pHpH在微生物培养的不同阶段有不同的在微生物培养的不同阶段有不同的影响影响 生长合成pH对菌体生长影响比产物合成影响小对菌体生长影响比产物合成影响小例例青青霉霉素素：菌菌体体生生长长最最适适pH3.56.0,产产物物合合成成最最适适pH7.27.4四四环环素素：菌菌体体生生长长最最适适pH6.06.8，产产物物合合成成最最适适pH5.86.0XpH四四环环素素4 4、最佳最佳pHpH的确定的确定配制不同初始配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情的培养基，摇瓶考察发酵情况况pH对产海藻酸裂解酶的影响对产海藻酸裂解酶的影响pH对海藻糖水解酶产生的影响对海藻糖水解酶产生的影响pH菌浓菌浓 pH酶活酶活pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响对谷氨酰胺转氨酶活力的影响热凝胶产生不同阶段热凝胶产生不同阶段pH的考察的考察pHDObiomass从图中可见，热凝胶发酵菌体生长和热凝胶从图中可见，热凝胶发酵菌体生长和热凝胶合成是非偶联的，整个发酵过程可以分成两合成是非偶联的，整个发酵过程可以分成两个阶段：前个阶段：前10 h是菌体生长期，之后热凝胶是菌体生长期，之后热凝胶开始合成，至发酵结束是热凝胶合成期。开始合成，至发酵结束是热凝胶合成期。在菌体生长期，在菌体生长期，DO 直线下降，培养液中的直线下降，培养液中的pH也迅速下降。也迅速下降。10 h左右，菌体质量浓度达左右，菌体质量浓度达到最大值，到最大值，DO 和和pH降至最低点（降至最低点（5.45.6），），菌体生长结束。此后进入热凝胶合成期。菌体生长结束。此后进入热凝胶合成期。试验两阶段的最适试验两阶段的最适pH，见表，见表稳定期随着稳定期随着pH降低，糖耗速率增加，降低，糖耗速率增加，生物量增加，但产物合成速率在生物量增加，但产物合成速率在pH5.6时达到最高。说明当时达到最高。说明当pH小于小于5.6以后微生物消耗的糖并非用于合成热以后微生物消耗的糖并非用于合成热凝胶，而是合成菌体。凝胶，而是合成菌体。三、三、pHpH的控制的控制 1 1、调调节节好好基基础础料料的的pHpH。基基础础料料中中若若含含有有玉玉米米浆浆，pH呈呈酸酸性性，必必须须调调节节pH。若若要要控控制制消消后后pH在在6.0，消消前前pH往往往往要要调到调到6.56.82 2、在基础料中加入维持、在基础料中加入维持pHpH的物质的物质，如，如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等缓冲液等3 3、通过补料调节、通过补料调节pHpH 在在发发酵酵过过程程中中根根据据糖糖氮氮消消耗耗需需要要进进行行补补料料。在在补补料料与与调调pH没没有有矛矛盾盾时时采采用用补补料调料调pH如如（1）调调节节补补糖糖速速率率，调调节节空空气气流流量量来调节来调节pH(2)当当NH2-N低，低，pH低时补氨水；低时补氨水；当当NH2-N低，低，pH高时补高时补(NH4)2SO44 4、当补料与调、当补料与调pHpH发生矛盾时，加酸碱发生矛盾时，加酸碱调调pHpH 分别在分别在4 4种缓冲介质中，种缓冲介质中，于于pH 6pH 65050一一9 95050测定天测定天冬酰胺酶酶活力冬酰胺酶酶活力1 1 甘氨酸介质甘氨酸介质pH 8.00pH 8.00时酶时酶活力最高；活力最高；2 2 硼酸在硼酸在pH 8pH 85050，酶反，酶反应最快应最快3 3 磷酸磷酸在在pH 850，酶反，酶反应最快应最快4 Tris4 Tris在在pH 850，酶反应，酶反应最快最快酶活酶活1 12 24 43 35 5、不同调、不同调pHpH方法的影响方法的影响天冬酰胺酶天冬酰胺酶不同不同pHpH控制方式对目的突变株控制方式对目的突变株ISw330ISw330异亮异亮氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。“1 1”表示只加表示只加CaC0CaC03 3控制控制pHpH值，值，“2 2”表表示只加尿素控制，示只加尿素控制，“3 3”表示表示CaC0CaC03 3和尿素和尿素联合控制联合控制pHpH值值。异亮氨酸发酵异亮氨酸发酵例：例：pH对对L-异亮氨酸发酵的影响异亮氨酸发酵的影响（天津科技大学）（天津科技大学）菌株最适生长菌株最适生长pHpH控制在控制在6.86.87.07.06 6、发酵的不同阶段采取不同的、发酵的不同阶段采取不同的pHpH值值不同不同pHpH值对菌体的形态影响很大，当值对菌体的形态影响很大，当pHpH值高于值高于7 75 5时，菌体易于老化，呈现球状；当时，菌体易于老化，呈现球状；当pHpH值低于值低于6 65 5时时菌体同样受抑制，易于老化。而在菌体同样受抑制，易于老化。而在7 72 2左右时，菌左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在6 69 9左右时，左右时，菌体处于生长期，呈菌体处于生长期，呈“八八”字形状并占有绝对的优字形状并占有绝对的优势。势。pH6pH69 9时，菌体生长旺盛，时，菌体生长旺盛，pH7pH71515时，对菌体的时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段阶段pHpH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9pH6.9，到，到48h48h后后pHpH值为值为7 71515，到，到80h80h后后pHpH值为值为7 72525。产率。产率222227g27g/L/L，产酸率提高，产酸率提高12122323。例：克拉维酸发酵中例：克拉维酸发酵中pH变换控制变换控制问题的提出：问题的提出：在在pH低时菌体生长受低时菌体生长受抑制，在高抑制，在高pH时克拉维酸要分解时克拉维酸要分解用用2.52.5升罐进行的不控制升罐进行的不控制pHpH的发酵发现，的发酵发现，前期由于微生物产生的酸性副产物和前期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸使有机酸使pHpH降至降至6.56.5。在达到最高细胞。在达到最高细胞浓度后，浓度后，pHpH开始从开始从6.56.5升至升至8.38.3。CACA产产量达最高水平时，量达最高水平时，pHpH不再升高。在发不再升高。在发酵终止时，酵终止时，pHpH再次升至再次升至8.58.5。随着。随着pHpH升升高，高，CACA迅速分解。迅速分解。研究不同研究不同pH对发酵的影响对发酵的影响分别配置分别配置pH为为6.0，7.0，8.0的培养基测的培养基测定菌的生长和产物合成定菌的生长和产物合成pH6.0时，生长受时，生长受抑制，产物降解抑制，产物降解少少pH8.0时生长良好时生长良好产量低，产物降产量低，产物降解解pH7.0时的状况时的状况控制控制pH7.0pH7.0和和8.08.0时，最高细胞浓度接近相同时，最高细胞浓度接近相同(约约1616PMV)PMV)，但控制，但控制pH6pH60 0时细胞生长受抑制。时细胞生长受抑制。在在2 25 5升生物反应器内，升生物反应器内，不控制不控制pHpH时时2 247g47g(m1(m1h)h)控制控制pH7.0pH7.0时的产率时的产率3 337g37g(m1(m1h)h)最高最高控制控制pH8.0pH8.0时，产率时，产率2 202g02g(m1(m1h)h)在控制在控制pH6pH60 0时，时，CACA产生被抑制产生被抑制,但降解少但降解少因此对细胞生长和因此对细胞生长和CACA产生最好将产生最好将pHpH控制于控制于7.07.0，但在控制但在控制pH7.0pH7.0时，仍出现时，仍出现CACA的迅速分解。的迅速分解。由于由于CACA生产的最适生产的最适pHpH和减少和减少CACA分解的分解的pHpH各各不相同，因此在分批发酵中应用了不相同，因此在分批发酵中应用了pHpH变换变换策略，使发酵策略，使发酵pHpH由中性由中性pH7pH70 0变换为酸性变换为酸性pH6.0pH6.0。在发酵前期，在细胞生长和产生在发酵前期，在细胞生长和产生CACA期间控期间控制制pH7.0pH7.0，4d4d后，当后，当CACA产量达最高值时，产量达最高值时，变换变换pHpH为为6.06.0，以减少，以减少CACA分解。最高分解。最高CACA浓浓度可保持度可保持24h24h。由于改变。由于改变pHpH，使，使CACA分解速分解速率明显降低。率明显降低。pH控制是一项非常细致的工作，不仅控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳考虑最佳pH值，而且要根据生长阶段值，而且要根据生长阶段考察对考察对pH的要求。在的要求。在pH控制中还要采控制中还要采用合适的调节方法。用合适的调节方法。总结总结小小 结结发酵过程发酵过程pH会发生变化会发生变化变变化化原原因因基质代谢基质代谢产物形成产物形成菌体自溶菌体自溶对对发发酵酵的的影影响响pHpH影响酶的活性影响酶的活性pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改值影响微生物细胞膜所带电荷的改变变pH值影响培养基某些成分和中间代谢值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离物的解离pH影响代谢方向影响代谢方向 pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响在微生物培养的不同阶段有不同的影响 pHpH的的控控制制方方式式基础培养基调节基础培养基调节pH在基础料中加入维持在基础料中加入维持pH的的物质物质通过补料调节通过补料调节pH 当补料与调当补料与调pH发生矛盾时，发生矛盾时，加酸碱调加酸碱调pH 发酵的不同阶段采取不同的发酵的不同阶段采取不同的pH值值选择合适的选择合适的pH调节剂调节剂思考题思考题7.12 发酵过程中发酵过程中pH会不会发生变化为什么？会不会发生变化为什么？7.13 pH对发酵的影响表现在哪些方面？对发酵的影响表现在哪些方面？7.14 为了确定发酵的最佳为了确定发酵的最佳pH,我们该如何实验我们该如何实验？7.15 发酵过程的发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？控制可以采取哪些措施？