液相色谱柱子使用及保养.pptx

液相色谱实用技术 色谱柱的使用和保养色谱柱的选择色谱柱的选择非极性或极性较小的样品可用一般的非极性或极性较小的样品可用一般的非极性或极性较小的样品可用一般的非极性或极性较小的样品可用一般的C18C18C18C18柱柱柱柱酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的C18C18C18C18柱，柱，柱，柱，PHPHPHPH范围范围范围范围2-92-92-92-9（12121212）糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPCGPCGPCGPC有专用柱有专用柱有专用柱有专用柱键合相色谱柱键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的柱填料的60-70%60-70%优点优点 固定相稳定，不易流失固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响消除硅羟基的不良影响缺点缺点 pHpH值不能小于值不能小于2 2或大于或大于8 8同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同反相反相HPLC柱（柱（C18）的性能）的性能常规常规C18C18填料的稳定性填料的稳定性硅胶基质填料硅胶基质填料pHpH范围：范围：2-8 2-8 pHpH值大于值大于7 7时时键合相粉碎或溶解键合相粉碎或溶解pHpH值小于值小于2 2时时键合相的化学键断裂键合相的化学键断裂经常用缓冲液经常用缓冲液 固定相降解固定相降解填料新的键合技术填料新的键合技术 -PHPH范围范围 2-122-12 -稳定性好，使用寿命长稳定性好，使用寿命长良好的色谱实验习惯良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先测柱效拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件定期检测柱效定期检测柱效色谱柱的使用及操作色谱柱的使用及操作流动相的转换流动相的转换特别是特别是GPCGPC柱柱流速流速(压力压力)的变化幅度的变化幅度温度的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱专用色谱柱 样品及溶剂的要求样品及溶剂的要求色谱柱的保养（一）色谱柱的保养（一）样品方面样品方面除去微粒及杂质除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用填料是否相互作用样品准备样品准备为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。作用，消除由于污染对分析结果的影响。作用，消除由于污染对分析结果的影响。作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。样品过滤头的类型：样品过滤头的类型：30mm 30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由内径：适用于大进样量的过滤，由内径：适用于大进样量的过滤，由内径：适用于大进样量的过滤，由0.20.2 m m 和和和和0.450.45 m m 两种规格两种规格两种规格两种规格,材料有纤维素材料有纤维素材料有纤维素材料有纤维素,醋酸纤维醋酸纤维醋酸纤维醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品聚四氟乙烯。处理样品聚四氟乙烯。处理样品聚四氟乙烯。处理样品体积少于体积少于体积少于体积少于5050 l l。13mm 13mm 内径：适用于范围广的过滤，由内径：适用于范围广的过滤，由内径：适用于范围广的过滤，由内径：适用于范围广的过滤，由0.20.2 m m 和和和和0.450.45 m m 两两两两种规格种规格种规格种规格,材料为纤维素。材料为纤维素。材料为纤维素。材料为纤维素。3mm 3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由内径：适用于小进样量的过滤，由内径：适用于小进样量的过滤，由内径：适用于小进样量的过滤，由0.20.2 m m 和和和和0.450.45 m m 两种规格。处理样品体积为两种规格。处理样品体积为两种规格。处理样品体积为两种规格。处理样品体积为7 7 l l。色谱柱的保养（二）色谱柱的保养（二）流动相方面流动相方面除去微粒除去微粒纯度的要求纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验）缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂 流动相对样品的溶解度流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例溶剂过滤溶剂过滤-除去微粒除去微粒不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器以及色谱柱。剂过滤器以及色谱柱。遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和色谱柱的寿命色谱柱的寿命：使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。用滤膜过滤溶剂去除微生物。用滤膜过滤溶剂去除微生物。每两天更换或过滤溶剂。每两天更换或过滤溶剂。避免溶剂瓶直接日照。避免溶剂瓶直接日照。向溶剂中加入向溶剂中加入0.0001-0.001M0.0001-0.001M的叠氮化钠。的叠氮化钠。溶剂准备：过滤溶剂准备：过滤选择合适的滤膜选择合适的滤膜聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。溶物。醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推荐用于蛋白质和其相关的样品。荐用于蛋白质和其相关的样品。尼龙尼龙6666滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸、强酸、70%70%乙醇、二氯甲烷、不适用于乙醇、二氯甲烷、不适用于DMFDMF二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。样品和有机溶剂。注意：注意：1 1）每张滤膜只能用一次。）每张滤膜只能用一次。2 2）水相和有机相不要搞混。）水相和有机相不要搞混。溶剂的相溶性溶剂的相溶性溶剂信息溶剂信息避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。在有机溶剂中的有机酸溶液。在有机溶剂中的有机酸溶液。含有强络合剂的溶液。含有强络合剂的溶液。四氯化碳和异丙醇或四氯化碳和异丙醇或THFTHF混合液。混合液。溶剂截止波长溶剂截止波长溶剂准备：脱气溶剂准备：脱气流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前必须进行脱气处理流动相使用前必须进行脱气处理流动相使用前必须进行脱气处理流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶，以除去其中溶，以除去其中溶，以除去其中溶解的气体（如解的气体（如解的气体（如解的气体（如O2O2），以防止在洗脱过程中当流动），以防止在洗脱过程中当流动），以防止在洗脱过程中当流动），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用离性能。若用离性能。若用离性能。若用FLDFLD，可能会造成荧光猝灭。，可能会造成荧光猝灭。，可能会造成荧光猝灭。，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法比较：氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。氦脱气，效果较好，但成本高。氦脱气，效果较好，但成本高。氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染抽真空脱气法：易抽走有机相。抽真空脱气法：易抽走有机相。抽真空脱气法：易抽走有机相。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min10-15min，此法效果最差。，此法效果最差。，此法效果最差。，此法效果最差。在线真空脱气法：在线真空脱气法：在线真空脱气法：在线真空脱气法：LC LC 真空脱机利用膜渗透技术，真空脱机利用膜渗透技术，真空脱机利用膜渗透技术，真空脱机利用膜渗透技术，在线脱在线脱在线脱在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。典型的流速典型的流速流动相的保存流动相的保存有机溶剂流动相有机溶剂流动相:室温下密封室温下密封,避光保存避光保存缓冲盐流动相缓冲盐流动相:当日现配现用当日现配现用低温下密封保存低温下密封保存,一般不超过一般不超过3 3天天防止长菌防止长菌有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:低温密封保存低温密封保存防止有机相的挥发防止有机相的挥发选用适宜的容器选用适宜的容器2 星期1 天1 星期1 小时新鲜配制5101520250分保存于聚乙烯瓶中的超纯水保存于聚乙烯瓶中的超纯水测试条件测试条件水样水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱色谱柱:C18:C18 反相柱反相柱 (Waters)(Waters)梯度梯度:线性线性 100%100%水水 100%100%乙腈乙腈波长波长:254 nm:254 nm1 天1星期新鲜配制5101520250分保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水测试条件测试条件水样水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱色谱柱:C18:C18 反相柱反相柱 (Waters)(Waters)梯度梯度:线性线性 100%100%水水 100%100%乙腈乙腈波长波长:254 nm:254 nm色谱柱日常使用色谱柱日常使用过滤所有的溶剂和样品过滤所有的溶剂和样品过滤所有的溶剂和样品过滤所有的溶剂和样品使用保护柱使用保护柱使用保护柱使用保护柱不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液开机时，流速和柱压要逐渐增加开机时，流速和柱压要逐渐增加开机时，流速和柱压要逐渐增加开机时，流速和柱压要逐渐增加进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液注意色谱柱的注意色谱柱的注意色谱柱的注意色谱柱的pHpHpHpH值使用范围值使用范围值使用范围值使用范围不要高温下过长时间使用硅胶键合相柱子不要高温下过长时间使用硅胶键合相柱子不要高温下过长时间使用硅胶键合相柱子不要高温下过长时间使用硅胶键合相柱子关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗不要高压冲洗柱子不要高压冲洗柱子不要高压冲洗柱子不要高压冲洗柱子色谱柱保护色谱柱保护在线的保护装置在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染防止分析柱被化学污染装置装置在线过滤器在线过滤器自装填料保护柱自装填料保护柱预装保护柱预装保护柱新型的保护柱新型的保护柱特点特点高质量高质量,高效填料高效填料 -不损失柱效不损失柱效增加分析柱效增加分析柱效 -增加适应范围增加适应范围20mm20mm柱长柱长 -脏样品载荷能力大，能延长保护柱脏样品载荷能力大，能延长保护柱寿命寿命手可拧紧接头，安装时不需要工具手可拧紧接头，安装时不需要工具通用柱套-适用于所有的HPLC柱(3.9及4.6内径)整体式-使用方便，容易各种不同填料配合色谱柱各种不同填料配合色谱柱色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病柱压过高柱压过高多少才算高多少才算高?不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异柱效低柱效低重复性差重复性差不出峰，回收率低不出峰，回收率低柱压过高柱压过高 为什么柱压会过高为什么柱压会过高微粒堵塞微粒堵塞样品流动相密封垫柱床膨胀柱床膨胀不可逆吸附不可逆吸附细菌生长细菌生长柱效低柱效低为什么柱效低为什么柱效低色谱柱被污染色谱柱被污染过滤片部分堵塞过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积色谱柱内的死体积流动相pH值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成固定相产生裂缝柱床收缩或干枯重复性差、回收率低重复性差、回收率低实验的重复性差实验的重复性差色谱柱被污染色谱柱被污染流动相流动相pHpH值及组成不合适造成键合相流失值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低，不出峰回收率低，不出峰“不可逆不可逆”吸附吸附固定相过强或流动相过弱固定相过强或流动相过弱非特异性吸附非特异性吸附色谱柱的日常清洗色谱柱的日常清洗对所做的样品要有充分的了解对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗（如反相C18柱用100%甲醇或乙腈）硅胶柱的一般方法硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质，再用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化键合相柱键合相柱(烷基烷基)的一般方法的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 柱子尺寸 柱子体积 冲洗体积 150 x4.6mm 2.5ml 50ml 200 x4.6mm 3.3ml 65ml 250 x4.6mm 4.2ml 80ml*再有杂质严格清洗：20倍柱体积的水-相同体积的0.05mol/L硫酸，最后用流 动相清洗色谱柱的清洗色谱柱的清洗-物理阻塞物理阻塞l l在安装柱前后测试压力差在安装柱前后测试压力差l l如果柱压力太高，反装色谱柱，并用如果柱压力太高，反装色谱柱，并用10-2010-20倍柱体积的倍柱体积的 流动相冲洗色谱柱，监测压力变化流动相冲洗色谱柱，监测压力变化l l若出现沉淀若出现沉淀 (如：蛋白凝聚、细胞物、聚合物如：蛋白凝聚、细胞物、聚合物)设法设法用相应的可溶性溶剂，如用相应的可溶性溶剂，如 0.1%TFA/80%0.1%TFA/80%乙腈乙腈,6M,6M 盐盐酸胍酸胍,THF,HFIP,THF,HFIPl l若仍无效，应考虑更换过滤片若仍无效，应考虑更换过滤片色谱柱头塌陷的修补色谱柱头塌陷的修补 柱头有塌陷可用填料修补：1 1）松开柱入口接头，拆下不锈钢烧结过滤器，常见柱头）松开柱入口接头，拆下不锈钢烧结过滤器，常见柱头塌陷，剔掉无规则床层和带色填料，使柱床呈白色水平面，塌陷，剔掉无规则床层和带色填料，使柱床呈白色水平面，滴一滴甲醇，加少许填料使沉降，如此反复多次后，用刮滴一滴甲醇，加少许填料使沉降，如此反复多次后，用刮刀将填料刮平，放上清洗过的不锈钢烧结过滤器，装上柱刀将填料刮平，放上清洗过的不锈钢烧结过滤器，装上柱入口接头，把柱重新接到入口接头，把柱重新接到LCLC仪器上慢慢地增加流速，直到仪器上慢慢地增加流速，直到操作上限为止。操作上限为止。2 2）如果柱头塌陷较深（小于）如果柱头塌陷较深（小于1cm1cm）可逐渐减低流速至零，）可逐渐减低流速至零，再次拆下柱子，用填料修补直到塌陷填满为止。再次拆下柱子，用填料修补直到塌陷填满为止。色谱柱的存放色谱柱的存放存放前的处理存放前的处理存放前的处理存放前的处理除去杂质、盐等，防止细菌生长除去杂质、盐等，防止细菌生长除去杂质、盐等，防止细菌生长除去杂质、盐等，防止细菌生长合适的存放溶剂合适的存放溶剂合适的存放溶剂合适的存放溶剂两端密封保存，两端密封保存，两端密封保存，两端密封保存，避免色谱柱床干枯避免色谱柱床干枯避免色谱柱床干枯避免色谱柱床干枯避免机械震动避免机械震动避免机械震动避免机械震动注意存放的温度注意存放的温度注意存放的温度注意存放的温度色谱柱以外的因素（一）色谱柱以外的因素（一）“柱效柱效”问题，不一定是色谱柱问题！问题，不一定是色谱柱问题！仪器问题：连接不好造成死体积仪器问题：连接不好造成死体积进样器检测器管路，连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题：色谱柱未平衡好流动相问题：色谱柱未平衡好进样量太大进样量太大色谱柱与仪器的联接色谱柱与仪器的联接不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造成：成：色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏解决办法：解决办法：使用使用“通用通用”型接头（锥箍及螺母）型接头（锥箍及螺母）这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱柱上的。色谱柱以外的因素（二）色谱柱以外的因素（二）柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！系统反压问题系统反压问题阻尼器堵塞进样器堵塞管路或连接口堵塞在线过滤器不干净保护柱压力传感器不准确压力传感器不准确流速是否错误流速是否错误?色谱柱以外的因素（三）色谱柱以外的因素（三）实验的重复性差实验的重复性差梯度实验时平衡时间不足梯度实验时平衡时间不足温度波动温度波动流动相组成改变流动相组成改变样品溶剂不同样品溶剂不同样品稳定性不好样品稳定性不好方法的开发不好方法的开发不好缓冲液的pH值不合适缓冲液的缓冲能力不足手动进样器手动进样器-六通阀的结构六通阀的结构手动进样器清洗手动进样器清洗为避免出现怪峰，冲洗注射针时最好用流动相（不含盐）冲洗为避免出现怪峰，冲洗注射针时最好用流动相（不含盐）冲洗