细胞破碎蛋白质复性和固液分离.pptx

第二篇第二篇 目标产品的分离与纯化目标产品的分离与纯化第五章第五章 细胞破碎、蛋白质复性和固液分离细胞破碎、蛋白质复性和固液分离细胞破碎细胞破碎固液分离固液分离初级分离初级分离(粗粗)纯化精制纯化精制下游技术基本过程下游技术基本过程下游加工技术的重要性下游加工技术的重要性 1.1.产品分离纯化是最终获得商业产品分离纯化是最终获得商业产品的环节。产品的环节。2.2.投资费用高（抗生素、乙醇、投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬酸占柠檬酸占60%60%）。）。3.3.分离纯化技术落后会阻碍发酵分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展。工程技术的发展。几种产品在发酵液中的浓度几种产品在发酵液中的浓度 产品产品 典型浓度（典型浓度（g/Lg/L）抗生素抗生素 2525 氨基酸氨基酸 100100 酒精酒精 100100 有机酸有机酸 100100 酶酶 2020 蛋白质蛋白质 1010下游加工技术的特点下游加工技术的特点 1.1.发酵液的复杂性造成分离上的困难性。发酵液的复杂性造成分离上的困难性。2.2.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。3.3.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。要求下游加工有一定弹性。产物提纯过程的不同决定于：产物提纯过程的不同决定于：对象材料、目标产物特性及对对象材料、目标产物特性及对其纯度的要求其纯度的要求第一节第一节 概述概述基因工程生物制品分离纯化基因工程生物制品分离纯化:工程菌经过大规模培养后，工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高杂质含量却很高分离纯化分离纯化极其重要极其重要基因工程药物从转化细基因工程药物从转化细胞、生产，对产品的纯胞、生产，对产品的纯度要求高于传统产品。度要求高于传统产品。发酵液发酵液细胞分离细胞分离胞内产物胞内产物胞外产物胞外产物细胞破碎细胞破碎固液分离固液分离包涵体包涵体细胞碎片分离细胞碎片分离变性变性复性复性浓缩浓缩 初步分离初步分离 高度纯化高度纯化 制剂制剂 产品产品 基因工程制品分离纯化的一般流程基因工程制品分离纯化的一般流程初级分离初级分离：分离细胞和培养液，破碎细分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包含体（包涵体），复胞释放产物，溶解包含体（包涵体），复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等过程。过程。主要决定产物的得率主要决定产物的得率。纯化精制纯化精制：初级分离基础上，用各种高初级分离基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的纯度达到有关要求。纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度主要决定产物的纯度。产物提纯过程包括两个基本阶段：产物提纯过程包括两个基本阶段：第二节第二节 细胞破碎细胞破碎目的：目的：释放细胞内含物释放细胞内含物。分类：分类：按照是否存在外加作用力分按照是否存在外加作用力分为机械法和非机械法。为机械法和非机械法。问题：问题：破碎率是否越高越好？破碎率是否越高越好？以大肠杆菌为以大肠杆菌为宿主药物多为宿主药物多为胞内产物胞内产物破碎方式破碎方式机械法机械法固体剪切作用固体剪切作用珠磨法珠磨法压榨压榨液体剪切作用液体剪切作用高压匀浆高压匀浆超声破碎超声破碎非机械法非机械法干燥处理干燥处理溶胞作用溶胞作用酶溶法酶溶法化学法化学法物理法物理法细胞破碎方法分类图细胞破碎方法分类图1 1、高压匀浆法、高压匀浆法组成组成：高压泵和匀浆阀高压泵和匀浆阀作用机理作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的形，从而达到破碎细胞的目的。高压匀浆阀结构示意图高压匀浆阀结构示意图进液口进液口出液口出液口阀座阀座碰撞环碰撞环阀杆阀杆高压匀浆器高压匀浆器19.6-25.4MPa适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎高压匀浆法动力学方程高压匀浆法动力学方程破碎效率与匀破碎效率与匀浆阀结构、操作压力和破碎次数浆阀结构、操作压力和破碎次数有关：有关：Ln(RLn(Rm m/(R/(Rm m-R)=KNP-R)=KNPa aR R：单位生物量释放出的产物量（：单位生物量释放出的产物量（mg/G)mg/G)R Rm m：R R的最大值；的最大值；K K：破碎速率常数；：破碎速率常数；N N：破碎次数；：破碎次数；P P：操作压力；：操作压力；a:a:与微生物性质有关的指数系数。与微生物性质有关的指数系数。破碎率破碎率-操作压力操作压力-温度控制温度控制-能耗能耗温度对活性物质的失活作用温度对活性物质的失活作用提高压力需增加能耗：提高压力需增加能耗：3.5KW/100MPa3.5KW/100MPa移走热量需付出代价：移走热量需付出代价：23.8/100MPa23.8/100MPa高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却匀浆过程中产生的热匀浆过程中产生的热蛋白质和酶的失活蛋白质和酶的失活温控和能耗温控和能耗堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地坚硬者如包含体易损伤匀浆阀，也不适用坚硬者如包含体易损伤匀浆阀，也不适用温度高易失活，能耗大。温度高易失活，能耗大。存在的问题存在的问题2 2、高速珠磨法、高速珠磨法原理原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨细胞和极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与作用下充分混合，珠子之间及珠子与细胞之间互相细胞之间互相剪切、碰撞剪切、碰撞，促使细胞，促使细胞壁破裂，释放内含物。壁破裂，释放内含物。几种常见珠磨器几种常见珠磨器动力学方程动力学方程间歇操作间歇操作:Ln(RLn(Rm m/(R/(Rm m-R)=Ln(D)=Kt-R)=Ln(D)=Kt 其中，其中，D=(1+KD=(1+K1 1/j)/j)j j连续操作：连续操作：Ln(RLn(Rm m/(R/(Rm m-R)=KV/f=K-R)=KV/f=K上式中，上式中，t t是破碎时间；是破碎时间；K K、K K1 1、KK是破碎速是破碎速度常数；度常数；V V是破碎室内悬浮液的体积；是破碎室内悬浮液的体积；f f是是进料速度；进料速度；是平均停留时间；是平均停留时间；j j是破碎时是破碎时全混釜的数目，反映破碎室内悬浮液的流全混釜的数目，反映破碎室内悬浮液的流动状况。动状况。采用夹套冷却的方式实现温控采用夹套冷却的方式实现温控,效果较好效果较好;能耗与细胞破碎率成正比能耗与细胞破碎率成正比;问题：问题：高压匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？高压匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？温控和能耗温控和能耗高压匀浆法与高速珠磨法的比较高压匀浆法与高速珠磨法的比较项目项目高压匀浆法高压匀浆法高速珠磨法高速珠磨法操作参数操作参数少少多，液体损耗大多，液体损耗大连续操作时连续操作时配备热换器进行级配备热换器进行级间冷却间冷却兼具破碎和冷却，兼具破碎和冷却，减少产物失活减少产物失活达到较高破碎率达到较高破碎率需循环需循环2-42-4次次一次操作一次操作适用范围适用范围团状、丝状真菌、团状、丝状真菌、较小革兰阳性菌不较小革兰阳性菌不宜，包含体不宜宜，包含体不宜几乎所有的微生物几乎所有的微生物细胞，包括含有包细胞，包括含有包含体的基因工程菌含体的基因工程菌的破壁的破壁X-PressX-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却至至-25-25-30-30，形成冰晶，用，形成冰晶，用500MPa500MPa以上以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，冰晶体磨损和包埋在冰中的细胞变形出，冰晶体磨损和包埋在冰中的细胞变形引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程度低，生物活性保持较好。度低，生物活性保持较好。3 3、超声破碎、超声破碎机理：机理：声频高于声频高于151520kHz20kHz的超声波在高强的超声波在高强度声能输入时可以进行细胞破碎，破碎机理尚度声能输入时可以进行细胞破碎，破碎机理尚未清楚，可能与未清楚，可能与空化现象空化现象引起的冲击波和剪引起的冲击波和剪切力有关。切力有关。破碎效率破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。度及菌种类型等因素有关。优点优点：操作简便，液量损失少操作简便，液量损失少存在问题存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。大容量时效率低，应用潜力有限。空化现象空化现象：在强声波作用下，引在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。起气泡形成，胀大和破碎的现象。锡箔纸测试空化强度与空化密度锡箔纸测试空化强度与空化密度看得到的空化现象看得到的空化现象超声波破碎仪超声波破碎仪大功率大功率超声波破碎仪超声波破碎仪4 4、化学渗透法、化学渗透法作用机理作用机理：某些某些有机溶剂，抗生素，表有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫方法叫渗透法渗透法。问题问题：EDTAEDTA、甲苯、甲苯、Triton X-100Triton X-100、盐、盐酸胍和脲的作用机理？酸胍和脲的作用机理？P70P70EDTAEDTA：破坏细胞的外层膜：破坏细胞的外层膜甲苯甲苯：溶解细胞膜的磷脂层：溶解细胞膜的磷脂层Triton X-100Triton X-100：溶解内膜的双磷脂层：溶解内膜的双磷脂层盐酸胍和脲盐酸胍和脲：削弱溶质分子间的疏水：削弱溶质分子间的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液作用，使疏水性化合物溶于水溶液优点（相对机械破碎）优点（相对机械破碎）：对产物释出有一定的选择性；对产物释出有一定的选择性；细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取；细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取；核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。缺陷缺陷：时间长，效率低；时间长，效率低；化学试剂有毒；化学试剂有毒；通用性差通用性差5 5、酶溶法、酶溶法机理机理：利用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解。利用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解。常用的溶酶常用的溶酶：溶菌酶溶菌酶(lysozyme)(lysozyme)、-1,3-1,3-葡聚葡聚糖酶糖酶(glucanase)(glucanase)、-1-1，6-6-葡聚糖酶、蛋白酶葡聚糖酶、蛋白酶（protease)protease)、甘露糖酶、甘露糖酶(mannanase)(mannanase)、肽链内切、肽链内切酶（酶（endopeptidase)endopeptidase)、壳多糖酶、壳多糖酶(chitinase)(chitinase)、细、细胞壁溶解酶（几种酶的复合物）等。胞壁溶解酶（几种酶的复合物）等。优点优点：一定的选择性；一定的选择性；细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程步分离过程 缺点缺点：（只能用于实验室（只能用于实验室）产物抑制造成效率低下；产物抑制造成效率低下；溶酶价格高；溶酶价格高；通用性差，通用性差，不易确定最佳条件；不易确定最佳条件；6 6、微波加热法、微波加热法机理机理：微波加热导致细胞内极微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，使胞内温度能，产生大量热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成微小孔洞，进一步加热可导致细微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。收缩，表面出现裂纹。优点优点：微波穿透性强，选择性高、加热效率高。微波穿透性强，选择性高、加热效率高。缺陷：缺陷：一般只适合对热稳定物质的分离；一般只适合对热稳定物质的分离；被处理的物料要具有良好的吸水性；被处理的物料要具有良好的吸水性；不适于富含淀粉和树胶等的天然植物不适于富含淀粉和树胶等的天然植物机械破碎法与非机械破碎法的比较机械破碎法与非机械破碎法的比较比较项目比较项目机械法机械法非机械法非机械法破碎机理破碎机理切碎细胞切碎细胞溶解局部壁膜溶解局部壁膜碎片大小碎片大小碎片细小碎片细小细胞碎片较大细胞碎片较大内含物释放内含物释放全部全部部分部分黏度黏度高（核酸多）高（核酸多）低（核酸少）低（核酸少）时间，效率时间，效率时间短，效率高时间短，效率高时间长，效率低时间长，效率低设备设备需专用设备需专用设备不需专用设备不需专用设备通用性通用性强强差差经济经济成本低成本低成本高成本高应用范围应用范围实验室，工业范围实验室，工业范围实验室范围实验室范围克隆表达的产物克隆表达的产物基因工程细胞基因工程细胞蛋白质蛋白质没有活性，一级结构正确，立体构型没有活性，一级结构正确，立体构型错误，无生物学活性！错误，无生物学活性！包涵体包涵体第三节第三节 蛋白质复性蛋白质复性难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。病毒在增殖的过程病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质内形成一种蛋白质性质的病变结构性质的病变结构包涵体包涵体SEMofE.colicontaininginclusionbodiesSEMofisolatedwashedinclusionbodies 包含体形成原因包含体形成原因：（比较复杂，目前尚不完全清楚。）比较复杂，目前尚不完全清楚。）缺少某些协助因子缺少某些协助因子（分子伴侣？）（分子伴侣？）或或者由于周围物理环境（温度等）不适，者由于周围物理环境（温度等）不适，使其难以连续进行次级键的形成，中间使其难以连续进行次级键的形成，中间产物相互凝集而积累形成包含体。产物相互凝集而积累形成包含体。应该考虑的事应该考虑的事：设法减少包含体的形成！设法减少包含体的形成！减少包涵体形成的策略减少包涵体形成的策略1、降低重组菌的生长温度降低重组菌的生长温度 降低培养温降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。培养培养E.coliE.coli时添加时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖谢糖可以阻止分泌的蛋白质聚集反应，在最适浓度可以阻止分泌的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有生长添加剂还有乙醇乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的低分子量的巯基或二硫化合物巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和原态，从而影响二硫键的形成）和NaClNaCl。3 3、供给丰富的培养基，创造最佳培养条件供给丰富的培养基，创造最佳培养条件如供氧、如供氧、pHpH等。等。2 2、添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂 蛋白质的复性蛋白质的复性：包含体蛋白质包含体蛋白质溶解溶解于于变性剂溶液中，呈变性状态，所有变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一构型，这一折叠过程折叠过程称为称为蛋白质复性蛋白质复性。如何使包涵体的构型复原成正确状态？如何使包涵体的构型复原成正确状态？包含体的分离及溶解包含体的分离及溶解 分离包含体：分离包含体：对培养收集的细胞进行对培养收集的细胞进行破碎破碎 (高压匀浆结合溶菌酶处理高压匀浆结合溶菌酶处理)，然后，然后离心离心(5000500020000g/r)20000g/r)，可使大部分包涵体沉淀，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。与可溶性蛋白分离。洗涤：洗涤：除去除去包涵体沉淀的包涵体沉淀的脂类和膜蛋白，脂类和膜蛋白，一一般加般加去污剂去污剂（Triton X-100Triton X-100或脱氧胆酸钠）和或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂低浓度变性剂（2mol/L2mol/L尿素或盐酸胍等）。尿素或盐酸胍等）。以以避免避免包涵体溶解和复性的过程中包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的重组蛋白质的降解。降解。溶解：溶解：a.a.包涵体的溶解必须用包涵体的溶解必须用很强的很强的变性剂变性剂，通过离，通过离子间的相互作用子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的破坏包涵体蛋白间的氢键氢键而而增溶蛋白。以增溶蛋白。以异氰盐酸胍异氰盐酸胍的增溶效果最强，的增溶效果最强，尿素稍差；尿素稍差；b.b.去污剂去污剂（如（如SDSSDS）可以破坏蛋白内的）可以破坏蛋白内的疏水键疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中去除而不允许用在制药行业中；c.c.酸酸（如（如70%70%甲酸）可以破坏蛋白的甲酸）可以破坏蛋白的次级键次级键从从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。d.d.对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入加入还原剂还原剂（如（如DTTDTT、GSHGSH、-ME-ME）打开蛋）打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。e.e.同时还应加入同时还应加入金属螯合剂金属螯合剂，如，如EDTAEDTA或或EGTAEGTA，用来螯合，用来螯合CuCu2+2+、FeFe3+3+等金属离子以等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。蛋白质的折叠机理蛋白质的折叠机理 目前有多种不同的假设，但很多学目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个者认为有一个“熔球态熔球态”的的中间状中间状态态，在，在“熔球态熔球态”中，蛋白质的二中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构。可形成正确的立体结构。蛋白质的具体步骤可用下式描述：蛋白质的具体步骤可用下式描述：伸展态伸展态中间体中间体后期中间体后期中间体天天然态体然态体聚集体聚集体核糖核酸酶的变性和复性示意图核糖核酸酶的变性和复性示意图(A)(A)天然核糖核酸酶天然核糖核酸酶(B)(B)变性失活变性失活(C)“(C)“错乱错乱”核糖核酸酶核糖核酸酶错误发生的机制错误发生的机制复性过程中，部分折叠中间体的疏水簇复性过程中，部分折叠中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。质聚集。伸展肽链折叠为天然活性结构的过程受伸展肽链折叠为天然活性结构的过程受到周围环境的影响，如温度、到周围环境的影响，如温度、pHpH值、离子值、离子强度、复性时间等因素的影响。强度、复性时间等因素的影响。不同条件下具体复性方式不同条件下具体复性方式1 1、透析、稀释和超滤复性法透析、稀释和超滤复性法：最传统、应用：最传统、应用最普遍，原理最普遍，原理-使变性剂浓度降低到蛋白质能恢使变性剂浓度降低到蛋白质能恢复折叠的浓度复折叠的浓度。缺点：缺点：复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分离。离。稀释法稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的分大大增加溶液体积，不利于后续的分离纯化，且处理量太大，不利于工业放大离纯化，且处理量太大，不利于工业放大 ；透透析法析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤超滤法法在膜上聚集变性，易造成膜污染。在膜上聚集变性，易造成膜污染。2 2、高蛋白浓度下的复性方法：、高蛋白浓度下的复性方法：（一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。能得到较高的复性率。）缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中复性缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性。加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性。因为完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠因为完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。的蛋白一起聚集。温度跳跃策略温度跳跃策略：变性蛋白在变性蛋白在低温低温下复性折叠下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为中间体大都转化为不易聚集的不易聚集的后期中间体后后期中间体后，温度快速升高温度快速升高来促来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。复性在中等的变性剂浓度下进行复性在中等的变性剂浓度下进行，变性，变性剂浓度应剂浓度应高到高到足以有效防止聚集，同时又必足以有效防止聚集，同时又必须须低到低到能够引发正确复性。能够引发正确复性。3 3、添加促进剂的复性方法添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：进作用可以分为：稳定正确稳定正确折叠蛋白质折叠蛋白质的天然结构、的天然结构、改变错误改变错误折叠蛋白质的稳折叠蛋白质的稳定性、定性、增加增加折叠复性折叠复性中间体中间体的溶解性、的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性增加非折叠蛋白质的溶解性。常用促进剂常用促进剂：a、共溶剂共溶剂：如通过与中间体特异的形成非聚集复合物，阻止蛋如通过与中间体特异的形成非聚集复合物，阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；b、去污剂及表面活性剂去污剂及表面活性剂：如如Trition X-100Trition X-100、CHAPsCHAPs、磷、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；结合，很难去除；c、氧化氧化-还原剂还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，入氧化还原体系，通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率；提高了正确配对的二硫键的产率；d、小分子的添加剂小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集。类等，都可阻止蛋白聚集。e、0.40.6M L-Arg：L-ArgL-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。9 9f、添加分子伴侣和折叠酶添加分子伴侣和折叠酶g、人工伴侣人工伴侣h、单克隆抗体单克隆抗体I、其它其它：多聚离子化合物、甘油等。多聚离子化合物、甘油等。此外，有：此外，有：4、液相色谱（液相色谱（LCLC）复性法：）复性法：疏水相互作用色谱（疏水相互作用色谱（HICHIC）、离子交换色谱）、离子交换色谱（IECIEC）、凝胶排阻色谱（）、凝胶排阻色谱（SECSEC）、亲和色谱）、亲和色谱（AFCAFC）已成功的对变性蛋白进行了复性。其）已成功的对变性蛋白进行了复性。其中中HICHIC的分离效果较理想的分离效果较理想；SECSEC最差；最差；盐酸盐酸胍会在胍会在IECIEC柱上保留，与蛋白一起洗脱下来；柱上保留，与蛋白一起洗脱下来；AFCAFC使用范围窄、所需时间长、价格昂贵，使用范围窄、所需时间长、价格昂贵，。变性蛋白在变性蛋白在HICHIC上的复性机理上的复性机理：当蛋白质、变性剂和杂蛋白进入当蛋白质、变性剂和杂蛋白进入HICHIC系统后，系统后，变性剂在柱上的作用力较弱，变性蛋白质的变性剂在柱上的作用力较弱，变性蛋白质的作用力较强作用力较强，变性剂首先同变性的蛋白质分，变性剂首先同变性的蛋白质分离，随流动相一起流出色谱柱。随着流动相离，随流动相一起流出色谱柱。随着流动相的不断变化，变性蛋白质不断地在固定相表的不断变化，变性蛋白质不断地在固定相表面上进行面上进行吸附吸附-解吸附解吸附-再吸附再吸附，并在此过程并在此过程中逐渐被复性，形成与天然蛋白质构象相同中逐渐被复性，形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质，并流出色谱柱的蛋白质，并流出色谱柱。液相色谱复性的优点：液相色谱复性的优点：（与传统的稀释法和透析法相比）与传统的稀释法和透析法相比）在进样后在进样后可很快除去变性剂可很快除去变性剂；色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率高蛋白质复性的质量和活性回收率；在蛋白质复性同时，可使目标蛋白质与杂蛋白在蛋白质复性同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行使复性和纯化同时进行；便于回收变性剂，降低废水处理成本便于回收变性剂，降低废水处理成本。5、反胶束复性法反胶束复性法：表面活性剂的极表面活性剂的极 性头朝内，疏水性头朝内，疏水 的尾部向外，中的尾部向外，中 间形成极性的间形成极性的“核核”有机溶剂有机溶剂极性极性“头头”极性的极性的“核核”非极性非极性“尾尾”蛋白质在反胶束内水相中可以蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性，这样可使保持其构象和活性，这样可使蛋白质相互分离，减少了蛋白蛋白质相互分离，减少了蛋白质折叠过程中的聚集作用。质折叠过程中的聚集作用。第四节第四节 固液分离固液分离分离细胞、细胞碎片、包含体、沉淀分离细胞、细胞碎片、包含体、沉淀物等的手段，物等的手段，不仅应用于初级阶段，不仅应用于初级阶段，而且也应用于精制阶段而且也应用于精制阶段。一、离心沉降一、离心沉降根据固体和液体之间的根据固体和液体之间的密度差密度差,利用离心机利用离心机提供的离心力实现固液分离。提供的离心力实现固液分离。优点：技术易掌握；结果重复性好优点：技术易掌握；结果重复性好沉降的难易取决于固体物质和液体的密度沉降的难易取决于固体物质和液体的密度差差,同时还取决于固体和液体的其他性质以同时还取决于固体和液体的其他性质以及离心机的离心能力及离心机的离心能力.(.(可以颗粒可以颗粒沉降速度沉降速度表示表示)斯托克斯公式斯托克斯公式(Stokes):(Stokes):Uc=d Uc=d2 2(s s-L L)r)r2 2/18/18UcUc颗粒沉降速度颗粒沉降速度;dd颗粒直径颗粒直径(假定为球形假定为球形)ss固体密度固体密度LL液体密度液体密度rr离心半径离心半径;角速度角速度;(r(r2 2:离心力离心力)液体粘度液体粘度分离因数分离因数:a=(ra=(r2 2:离心力离心力)/g)/gaa衡量离心力的大小衡量离心力的大小主要指标主要指标,应应该主要是增大角速度而不是直径。该主要是增大角速度而不是直径。提高离心效果可通过提高离心效果可通过增加转速和延长增加转速和延长时间时间来取得。来取得。(r(r2 2:离心力离心力):):固液分离最重要的影响因素固液分离最重要的影响因素转筒常规工业用离心机转筒常规工业用离心机（-张家港华大离心机公司）张家港华大离心机公司）SSCSSC型离心机为三足式上部型离心机为三足式上部人工卸料沉降离心机，该人工卸料沉降离心机，该系列离心机装鼓壁上无孔，系列离心机装鼓壁上无孔，属沉降型转鼓，操作维修属沉降型转鼓，操作维修方便。主要适用于方便。主要适用于固相颗固相颗粒细小，悬浮液粘性较大，粒细小，悬浮液粘性较大，过滤介质再生困难，且含过滤介质再生困难，且含量较少的悬浮液的固液分量较少的悬浮液的固液分离。离。管式工业用离心机管式工业用离心机（-张家港华大离心机公司）张家港华大离心机公司）悬浮液从进料管进入转鼓，固悬浮液从进料管进入转鼓，固相颗粒在离心力场作用下受到相颗粒在离心力场作用下受到离心力的加速沉降至转鼓内壁，离心力的加速沉降至转鼓内壁，沉降的颗粒在螺旋输送器叶片沉降的颗粒在螺旋输送器叶片的推动下，从（直筒段）沉降的推动下，从（直筒段）沉降区通过（锥段）干燥区至固相区通过（锥段）干燥区至固相出口排出；经澄清的液相从溢出口排出；经澄清的液相从溢流孔溢出。从而实现固、液相流孔溢出。从而实现固、液相自动、连续的分离。自动、连续的分离。可应用于脱水、浓缩、分级澄可应用于脱水、浓缩、分级澄清等不同场合。清等不同场合。刮刀卸料工业用离心机刮刀卸料工业用离心机（-张家港华大离心机公司）张家港华大离心机公司）主电机带动套装的内外转鼓全主电机带动套装的内外转鼓全速旋转，物料由进料管引入转速旋转，物料由进料管引入转鼓，在离心力作用下，液相物鼓，在离心力作用下，液相物穿过滤布和内转鼓壁滤孔排出穿过滤布和内转鼓壁滤孔排出内转鼓，汇集到内外转鼓间的内转鼓，汇集到内外转鼓间的间隙内，穿过到虹吸室的通孔间隙内，穿过到虹吸室的通孔进入虹吸室，再由虹吸装置抽进入虹吸室，再由虹吸装置抽走排出机外。固相物截留在内走排出机外。固相物截留在内转鼓形成环形滤饼层。进料达转鼓形成环形滤饼层。进料达到预定容积后停止进料，进一到预定容积后停止进料，进一步分离，此时可进行洗涤。洗步分离，此时可进行洗涤。洗涤、分离结束，刮刀自动旋转，涤、分离结束，刮刀自动旋转，将固相物刮下经输料螺旋排出将固相物刮下经输料螺旋排出机外，然后自动洗网，开始下机外，然后自动洗网，开始下一个循环。一个循环。二、微孔膜过滤二、微孔膜过滤根据根据流体各组分尺寸大小的不同流体各组分尺寸大小的不同，利用利用高分子聚合膜，过滤分离高分子聚合膜，过滤分离微米级的细胞、微米级的细胞、细胞碎片和生物大分子的过程。细胞碎片和生物大分子的过程。何谓微孔何谓微孔膜过滤？膜过滤？切割分子量切割分子量?MWCO微滤（微滤（0.10.11010m)m)：分离固体颗粒分离固体颗粒超滤超滤（0.0010.0010.10.1m)m)：浓缩大分子物质浓缩大分子物质反渗透（反渗透（0.0010.001m)m)：从小分子中脱除水分从小分子中脱除水分微孔膜过滤的微孔膜过滤的3 3种方式：种方式：缺点：缺点：技术难以掌握，影响因素多；技术难以掌握，影响因素多；稳定性和重复性不好；稳定性和重复性不好；膜堵塞问题难以解决！膜堵塞问题难以解决！微孔膜过滤特点微孔膜过滤特点优点：优点：容易做到封闭式操作，不受环境污染容易做到封闭式操作，不受环境污染设备投资少，操作安全；设备投资少，操作安全；加工量可大可小，十分方便；加工量可大可小，十分方便；有利于分离密度差小而难以离心的固体，有利于分离密度差小而难以离心的固体，可直接用于下游的层析过程。可直接用于下游的层析过程。微滤技术要点：微滤技术要点：1.1.选择选择合适的膜合适的膜：不与蛋白质、脂类等发生吸附；不与蛋白质、脂类等发生吸附；孔径合适。孔径合适。不锈钢板式过滤器不锈钢板式过滤器不锈钢杯式过滤器不锈钢杯式过滤器正压过滤器正压过滤器机电一体式微机电一体式微滤过滤系统滤过滤系统 微滤技术要点：微滤技术要点：2.2.选择合适的操作条件：选择合适的操作条件：过滤方程（达西公式）：过滤方程（达西公式）：V=P/P/(Rc+Rm)(Rc+Rm)V：过滤速度，：过滤速度，P P：压力差，：压力差，：滤液粘度，：滤液粘度，RcRc：滤饼阻力，：滤饼阻力，RmRm：过滤介质（膜）的阻力。：过滤介质（膜）的阻力。P P恒定，恒定，RcRc增加，增加，V降低降低 保持保持V不变不变则需阻止滤饼生成或不增厚。若则需阻止滤饼生成或不增厚。若RmRm和和不变，则不变，则V恒定，因为恒定，因为P P增加会加大增加会加大RcRc。3.3.膜材料的新发展膜材料的新发展无机陶瓷膜无机陶瓷膜优点优点：（机械强度大、惰性更大）（机械强度大、惰性更大）孔径均匀，过滤效果好；孔径均匀，过滤效果好；耐蒸气消毒、耐酸碱和有机溶剂；耐蒸气消毒、耐酸碱和有机溶剂；坚固耐用，使用寿命长；坚固耐用，使用寿命长；可以加压反向冲洗可以加压反向冲洗缺点缺点：造价高；过滤面积小；表现对蛋白质一定的吸附；造价高；过滤面积小；表现对蛋白质一定的吸附；各种微孔膜柱及设备各种微孔膜柱及设备各种微孔膜柱及设备各种微孔膜柱及设备操作方式操作方式1.1.切向流过滤切向流过滤：（悬浮液沿与滤膜水平的方向流动，因此过悬浮液沿与滤膜水平的方向流动，因此过滤过程中不断带走堆积在介质表面的固体滤过程中不断带走堆积在介质表面的固体物质，不会形成滤饼层而使膜堵塞。物质，不会形成滤饼层而使膜堵塞。）一种维持恒压下高过滤速度的技术。一种维持恒压下高过滤速度的技术。原理原理：当移走固体与固体沉积速率相：当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。向流速度就可以得到不同的过滤速度。Sartocon SliceSartocon Slice整体整体型型切向流过滤切向流过滤系统系统德国德国Sartorius Vivaflow 50 Sartorius Vivaflow 50 回旋流回旋流/切向流超滤器切向流超滤器在在膜膜表表面面加加以以搅搅拌拌造造成成流流动动使使膜膜相相对对于于悬悬浮浮液液运运动动（将将膜膜附附于于圆圆筒筒上上高高速速旋旋转转）切向流过滤的缺点切向流过滤的缺点产生的剪切力使蛋白质产物失活，流速产生的剪切力使蛋白质产物失活，流速越快，失活越严重；越快，失活越严重；悬浮液在流动过程中有压力损失，能耗悬浮液在流动过程中有压力损失，能耗消耗大；消耗大；不能避免膜的污染和堵塞，当膜的阻力不能避免膜的污染和堵塞，当膜的阻力增大时，无法防止过滤速度的下降；增大时，无法防止过滤速度的下降；、脉冲反洗切向流过滤、脉冲反洗切向流过滤原理原理：在切向流过滤中在切向流过滤中间歇地在膜的背间歇地在膜的背面加一反压面加一反压，迫使部分滤液反透过膜以，迫使部分滤液反透过膜以冲掉膜上的固体沉积和膜孔中的堵塞物，冲掉膜上的固体沉积和膜孔中的堵塞物，使过滤速度保持在比较高的水平。使过滤速度保持在比较高的水平。、调整生化悬浮液的性质、调整生化悬浮液的性质调整调整pHpH值和离子强度；值和离子强度；加入絮凝剂；加入絮凝剂；加入过滤助剂（硅藻土系列）加入过滤助剂（硅藻土系列）三、双水相萃取三、双水相萃取原理原理：利用利用被提取物在二相中的分配不同实被提取物在二相中的分配不同实现分离目的。现分离目的。由于蛋白质在有机相中容易失活，由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如因此采用的二相均为亲水相，如PEG/PEG/葡聚糖