细胞衰老与凋亡10.pptx

第十三章第十三章 程序性细胞死亡与细胞衰老程序性细胞死亡与细胞衰老第十三章第十三章 程序性细胞死亡与细胞衰老程序性细胞死亡与细胞衰老程序性细胞死亡程序性细胞死亡细胞衰老细胞衰老 细胞的死亡是个体的死亡，对于多细胞生物而言，细胞细胞的死亡是个体的死亡，对于多细胞生物而言，细胞的死亡并不意味着个体生命的终结；相反，细胞死亡是维持的死亡并不意味着个体生命的终结；相反，细胞死亡是维持个体的正常生长发育及其生命活动所必需的，其重要性不亚个体的正常生长发育及其生命活动所必需的，其重要性不亚于细胞的增殖。于细胞的增殖。细胞的衰老，即复制衰老，指体外培养的正常细胞经过细胞的衰老，即复制衰老，指体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停止分裂，细胞形态和生理代谢活动发有限次数的分裂后，停止分裂，细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。生显著改变的现象。个体的衰老（个体的衰老（aging）是指随着年龄的增加，机体功能）是指随着年龄的增加，机体功能呈现退行性变化，并但随着生殖能力的下降和死亡率上升的呈现退行性变化，并但随着生殖能力的下降和死亡率上升的现象。现象。第一节第一节 程序性细胞死亡程序性细胞死亡动物细胞的程序性死亡动物细胞的程序性死亡 死亡方式：死亡方式：凋亡（凋亡（apoptosis）坏死（坏死（necrosis）自噬（自噬（autophagy）植物细胞的程序性死亡植物细胞的程序性死亡酵母细胞的程序性死亡酵母细胞的程序性死亡蝌蚪尾的消失蝌蚪尾的消失脊椎动物的神经系统的发育脊椎动物的神经系统的发育发育过程中手和足的成形过程发育过程中手和足的成形过程概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，所以也常常被称为细胞编程死亡（过程，所以也常常被称为细胞编程死亡（programmed cell death,PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用常关键的作用细胞凋亡的形态学、生化特征细胞凋亡的形态学、生化特征细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测细胞凋亡的分子机制细胞凋亡的分子机制动物细胞的程序性死亡动物细胞的程序性死亡细胞凋亡的形态学特征：细胞凋亡的形态学特征：凋凋亡亡的的起起始始：细细胞胞表表面面的的特特化化结结构构如如微微绒绒毛毛消消失失，细细胞胞间间接接触触的的消消失失，但但细细胞胞膜膜依依然然完完整整；线线粒粒体体大大体体完完整整，但但核核糖糖体体逐逐渐渐从从内内质质网网上上脱脱离离，内内质质网网囊囊腔腔膨膨胀胀，并并逐逐渐渐与与质质膜膜融融合合；染染色色质质固固缩缩，形形成成新新月月形形帽帽状状结结构构等等形形态态，沿沿着着核膜分布核膜分布凋凋亡亡小小体体的的形形成成：核核染染色色质质断断裂裂为为大大小小不不等等的的片片段段，与与某某些些细细胞胞器器如如线线粒粒体体一一起起聚聚集集，为为反反折折的的细细胞胞质质膜膜所所包包围围。细细胞胞表表面面产产生生了了许许多多泡泡状状或或芽芽状状突突起起，逐渐形成单个的凋亡小体。逐渐形成单个的凋亡小体。凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化胞凋亡的生化特征胞凋亡的生化特征细胞凋亡的主要特征是形成大小为细胞凋亡的主要特征是形成大小为180200bp特征性的特征性的DNA ladders组织转谷氨酰胺酶组织转谷氨酰胺酶tTG（tissue Transglutaminase）积累并达到较高水平）积累并达到较高水平细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳：电泳：DNA片段就呈现出梯状条带片段就呈现出梯状条带TUNEL测测定定法法，即即末末端端脱脱氧氧核核苷苷酸酸酶酶移移换换酶酶介介导导的的dUTP缺口末端标记测定法。缺口末端标记测定法。彗星电泳法（彗星电泳法（comet assay）流式细胞分析流式细胞分析 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察 台盼兰：活细胞台盼兰：活细胞 DAPI，Giemsa：结合：结合DNA染色质异固缩、凋亡小体的形成、细胞发泡染色质异固缩、凋亡小体的形成、细胞发泡细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测DNA电泳电泳：DNA片段就呈现出梯状条带片段就呈现出梯状条带 细胞凋亡的主要特征是形成大小为细胞凋亡的主要特征是形成大小为180200bp特征性的特征性的DNA ladders细胞色素细胞色素c诱导的凋亡细胞诱导的凋亡细胞DNA电泳图电泳图1细胞色素细胞色素c诱导诱导0 h2细胞色素细胞色素c诱导诱导1 h3细胞色素细胞色素c诱导诱导2 h4细胞色素细胞色素c诱导诱导3 h5细胞色素细胞色素c诱导诱导4 h6阴性对照阴性对照7Marker （自赵允、翟中和）自赵允、翟中和）细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测TUNEL测定法（测定法（DNA断裂的原位末端标记法，末端断裂的原位末端标记法，末端脱氧核苷酸酶移换酶介导的脱氧核苷酸酶移换酶介导的dUTP缺口末端标记测定法）缺口末端标记测定法）彗星电泳法（彗星电泳法（comet assay）：将单个细胞悬浮于琼脂）：将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色。泳，并用荧光染料染色。流式细胞分析流式细胞分析:凋亡细胞凋亡细胞DNA发生断裂和丢失，呈亚发生断裂和丢失，呈亚二倍体状态。二倍体状态。诱导细胞凋亡的因子诱导细胞凋亡的因子Caspase家族与凋亡：家族与凋亡：Caspase依赖性的细胞凋亡依赖性的细胞凋亡 由由死死亡亡受受体体起起始始的的外外源源途途径径：配配体体是是肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子（TNF）家族成员）家族成员 由由线线粒粒体体起起始始的的内内源源途途径径：细细胞胞色色素素c的的释释放放，线线粒粒体体外外膜通透性的改变受膜通透性的改变受BCL-2 家族家族的调控的调控 Caspase非依赖性的细胞凋亡非依赖性的细胞凋亡 凋亡诱导因子（凋亡诱导因子（AIF）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶Gp53与细胞凋亡与细胞凋亡三、细胞凋亡的分子机制三、细胞凋亡的分子机制细胞凋亡与坏死细胞凋亡与坏死二者的主要区别：二者的主要区别：细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptotic bodies），凋亡小体则），凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。在细胞坏死时，细胞质出现空泡，细胞质膜破损，细胞内容物，包在细胞坏死时，细胞质出现空泡，细胞质膜破损，细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段释放到胞外，导致炎症反应。在括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段释放到胞外，导致炎症反应。在细胞坏死过程中染色质不发生凝集，也不产生有规律的细胞坏死过程中染色质不发生凝集，也不产生有规律的200bp的的DNA降降解片段，而是被随即降解，琼脂糖凝胶电泳是呈现弥散性分布，俗称解片段，而是被随即降解，琼脂糖凝胶电泳是呈现弥散性分布，俗称“拖尾拖尾”现象。细胞坏死可能是现象。细胞坏死可能是“程序性死亡的程序性死亡的”的另一种形式，具有包的另一种形式，具有包括引发炎症反应在内的重要生理功能。当细胞凋亡不能正常发生而细胞括引发炎症反应在内的重要生理功能。当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时，坏死作为凋亡的必须死亡时，坏死作为凋亡的“替补替补”方式被细胞采用方式被细胞采用.分裂旺盛的细胞由分裂旺盛的细胞由DNA损伤引发的损伤引发的ATP水平急降会导致水平急降会导致细胞坏死，二分裂迟滞的细胞抵抗细胞坏死，二分裂迟滞的细胞抵抗DNA损伤的能力较强。损伤的能力较强。DNA损伤损伤NAD+ADP-核糖核糖PARP细胞质中细胞质中NAD+浓度下降浓度下降 葡萄糖葡萄糖 糖酵解糖酵解 丙酮酸丙酮酸 氧化磷酸化氧化磷酸化氨基酸氨基酸脂肪酸脂肪酸大分子合成大分子合成 氧化磷酸化氧化磷酸化 ATP氨基酸氨基酸脂肪酸脂肪酸大分子合成大分子合成 氧化磷酸化氧化磷酸化 ATP持续增殖细胞持续增殖细胞 非持续增殖细胞非持续增殖细胞“程序性程序性”坏死坏死 细胞存活细胞存活 DNA修复修复细胞自噬细胞自噬细胞自噬主要发生在个体遭遇营养危机的时候和胚胎发育期间细胞自噬主要发生在个体遭遇营养危机的时候和胚胎发育期间单细胞和单细胞生物均可发生自噬单细胞和单细胞生物均可发生自噬酵母磷脂酰基醇激酶（酵母磷脂酰基醇激酶（PI3K）信号途径）信号途径PI3KAKTTor翻译凋亡自噬ATP细胞外营养物质代谢底物PI3KAKTTor凋亡自噬ATP细胞外营养物质酵母细胞的自噬信号途径植物细胞的程序性死亡植物细胞的程序性死亡植物细胞的过敏（植物细胞的过敏（HR）反应）反应木质部管状细胞的成熟过程木质部管状细胞的成熟过程酵母细胞的程序性死亡酵母细胞的程序性死亡 1997，发现酵母突变株，发现酵母突变株cdc48具有程序性死亡现象具有程序性死亡现象 低浓度的双氧水或醋酸、较高浓度的盐或糖、植低浓度的双氧水或醋酸、较高浓度的盐或糖、植物抗真菌多肽等能诱导酵母发生细胞程序性死亡物抗真菌多肽等能诱导酵母发生细胞程序性死亡第二节第二节 细胞衰老细胞衰老(cellular aging或或cell senescence)Hayflick界限界限(Hayflick Limitation）细胞在体内条件下的衰老细胞在体内条件下的衰老衰老细胞结构的变化衰老细胞结构的变化细胞衰老的分子机理细胞衰老的分子机理一、一、Hayflick界限界限(Hayflick Limitation)概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就 是是 Hayflick界限界限 癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞已经不同于原先的细胞 细胞的增殖能力与供体年龄有关细胞的增殖能力与供体年龄有关 物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系 (龟龟175岁岁/90125次次,小鼠小鼠3.5年年/1428次次)二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的 决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境 是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老三、衰老细胞结构的变化三、衰老细胞结构的变化细细胞胞核核的的变变化化:体体外外培培养养的的二二倍倍体体细细胞胞，细细胞胞核核随随着着细细胞胞分分裂裂次数的增加不断增大次数的增加不断增大;核膜内折、染色质固缩化核膜内折、染色质固缩化内内质质网网的的变变化化:衰衰老老动动物物内内质质网网成成分分弥弥散散性性地地分分散散于于核核周周胞胞质质中，糙面内质网的总量似乎是减少了中，糙面内质网的总量似乎是减少了线线粒粒体体的的变变化化:通通常常细细胞胞中中线线粒粒体体的的数数量量随随龄龄减减少少，而而其其体体积积则随龄增大则随龄增大.致密体的生成致密体的生成:褐脂质、老年色素、血褐质、脂色素、残体。褐脂质、老年色素、血褐质、脂色素、残体。膜膜系系统统的的变变化化:膜膜流流动动性性降降低低、韧韧性性减减小小；衰衰老老细细胞胞间间间间隙隙连连接接;细胞细胞膜内（膜内（P面）颗粒的分布也发生变化面）颗粒的分布也发生变化.细胞衰老的生物学特征：细胞衰老的生物学特征：1.细胞生长停滞，分裂停止细胞生长停滞，分裂停止2.衰老相关的衰老相关的-半乳糖苷酶（溶酶体内半乳糖苷酶（溶酶体内的水解酶）活化的水解酶）活化四、细胞衰老的分子机理四、细胞衰老的分子机理端端粒粒与与衰衰老老：发发现现端端粒粒长长度度确确实实与与衰衰老老有有着着密密切切的的关关系系，提提出出细细胞胞衰衰老老的的“有丝分裂钟有丝分裂钟”学说（学说（Harley,1990Harley,1990）氧氧化化性性损损伤伤学学说说：代代谢谢过过程程中中产产生生的的活活性性氧氧基基团团或或分分子子（ROS-OROS-O2 2-，OHOH-，H H2 2O O2 2），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。rDNArDNA与衰老与衰老:酵母染色体外酵母染色体外rDNA rDNA 环（环（ERCERC）的积累，导致细胞衰老。）的积累，导致细胞衰老。沉沉默默信信息息调调节节蛋蛋白白复复合合物物（Sir Sir complexcomplex）与与衰衰老老：Sir Sir complex complex 存存在在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNADNA转录。转录。SGS1SGS1基因和基因和WRNWRN基因与衰老：基因与衰老：SGS1SGS1基因和基因和WRNWRN基因同源基因同源,编码解旋酶编码解旋酶;酵母酵母sgs1sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均突变体寿命明显短于野生型（平均9.59.5代代:24.5:24.5代）代）;wrnwrn突变突变 引发早老症引发早老症.发育程序与衰老发育程序与衰老:线粒体线粒体DNADNA与衰老与衰老:Sen-DNA(80:Sen-DNA(80年代年代);mtDNA);mtDNA突变积累与细胞衰老有关突变积累与细胞衰老有关.细胞来源细胞来源人胚肺成纤人胚肺成纤维细胞维细胞中年人成中年人成纤维细胞纤维细胞老年人成老年人成纤维细胞纤维细胞可增殖可增殖代数代数 40-60 20 2-4不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数二、细胞在体内条件下的衰老二、细胞在体内条件下的衰老在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生体发育的早期也会发生;衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长期明显延长;衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老;骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖速度也趋缓慢速度也趋缓慢.Caspase家族家族线虫线虫(C.elegans)凋亡研究发现凋亡研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。的激活，抑制细胞凋亡。Ced3哺乳类同哺乳类同源物是白介素源物是白介素-1转换酶转换酶ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即，即Caspase1。Caspase活性位点是半胱氨酸活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteine aspartic acic specific protease，即，即Caspase。现发现的哺乳类动物细胞。现发现的哺乳类动物细胞Caspase家族成员共有家族成员共有15种：种：白介素前体的活化：白介素前体的活化：Caspase1，4凋亡起始者：凋亡起始者：Caspase2，8，9，10凋亡执行者：凋亡执行者：Caspase3，6，7 Caspase自身以非活化的自身以非活化的Procaspase存在。一般的蛋白酶活化时，存在。一般的蛋白酶活化时，只是将只是将N端的肽段切除，而端的肽段切除，而caspase的活化则需要在两个亚基的连接的活化则需要在两个亚基的连接区的天冬氨酸位点进行切割，结果产生了由两个亚基组成的异二聚区的天冬氨酸位点进行切割，结果产生了由两个亚基组成的异二聚体而活化。体而活化。凋亡过程：激活期和执行期凋亡过程：激活期和执行期激活期激活期(起始起始Caspase活化活化):同性活化同性活化,酶元分子聚集成复合物达酶元分子聚集成复合物达到一定浓度时，彼此切割或者构象改变产生有活性的二聚体形式。到一定浓度时，彼此切割或者构象改变产生有活性的二聚体形式。执行期执行期(执行执行Caspase活化活化)：属异性活化，起始属异性活化，起始Caspase招募执招募执行行Caspase酶原分子后，对其进行切割，产生具有活性的执行酶原分子后，对其进行切割，产生具有活性的执行Caspase切割细胞内重要的结构和功能蛋白，导致细胞凋亡。切割细胞内重要的结构和功能蛋白，导致细胞凋亡。Caspase家族家族BCL-2家族家族 BCL-2是是一一种种原原癌癌基基因因，是是ced-9在在哺哺乳乳类类中中的的同同源源物物，能能抑抑制制细细胞胞凋凋亡亡；与与线线粒粒体体及及内内质质网网膜膜相相结结合合BCL-2家家族族成成员员的的基基因因中中，常常常常含含有有三三个个保保守守的的BCL-2同同源源区区，即即BH1，BH2和和BH3。这这三三个个区区域域是是调节凋亡以及蛋白质相互作用所必需的结构。调节凋亡以及蛋白质相互作用所必需的结构。哺哺乳乳动动物物细细胞胞中中发发现现三三种种凋凋亡亡蛋蛋白白酶酶活活化化因因子子：Apaf1，Apaf2（CytC），），Apaf3。BCL-2家族成员家族成员 a 正常正常T细胞杂交瘤细胞细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞凋亡细胞(扫描电镜扫描电镜)c 凋亡细胞凋亡细胞(透射电镜透射电镜)诱导细胞凋亡的因子：诱导细胞凋亡的因子：物理性因子，包括射线（紫外线，物理性因子，包括射线（紫外线，射线等），射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等较温和的温度刺激（如热激，冷激）等化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA 和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿 瘤坏死因子瘤坏死因子（TNF），抗），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等抗体等三、细胞凋亡的分子机制三、细胞凋亡的分子机制外源途径外源途径 内源途径内源途径FADDCaspase-8酶原酶原Caspase-3酶原酶原活化的活化的Caspase-3活化的活化的Caspase-9活化的活化的Caspase-8凋亡复合体凋亡复合体Caspase-9酶原酶原细胞色素细胞色素CCaspase非依赖性非依赖性细胞凋亡途径酶原细胞凋亡途径酶原Endo G Endo G AIF AIF线粒体线粒体+DISC死亡诱导死亡诱导信号复合物信号复合物其他其他刺激因素刺激因素Bid 剪切的剪切的Bid切割底物切割底物产生效应产生效应细胞核细胞核 由死亡受体起始的外源途径由死亡受体起始的外源途径细胞色素细胞色素c诱导的凋亡细胞诱导的凋亡细胞DNA电泳图电泳图1细胞色素细胞色素c诱导诱导0 h2细胞色素细胞色素c诱导诱导1 h3细胞色素细胞色素c诱导诱导2 h4细胞色素细胞色素c诱导诱导3 h5细胞色素细胞色素c诱导诱导4 h6阴性对照阴性对照7Marker （自赵允、翟中和）自赵允、翟中和）p53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。p53基因是人肿瘤有关基因中突变频率最高的基因基因是人肿瘤有关基因中突变频率最高的基因（50）。）。将将p53基因重新倒入已转化的细胞中则可能产生两基因重新倒入已转化的细胞中则可能产生两种不同的结果：生长阻遏、细胞凋亡。种不同的结果：生长阻遏、细胞凋亡。P53蛋白能特异地抑制蛋白能特异地抑制Bcl-2的表达，相反对的表达，相反对Bax 的的表达有明显的促进作用。表达有明显的促进作用。p53与细胞凋亡与细胞凋亡1.定义定义2.细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征3.细胞坏死与凋亡细胞坏死与凋亡4.细胞衰老的特征细胞衰老的特征5.细胞衰老与细胞凋亡的的主要区别细胞衰老与细胞凋亡的的主要区别 思考思考: