细胞的破碎与分离包涵体.pptx

细胞的破碎与分离细胞的破碎与分离概述概述很多生化产物存在于细胞内很多生化产物存在于细胞内(胞内产物胞内产物)细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型成分的基础。分泌型成分的基础。胞内物分离概述药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病-干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤细菌细胞壁结构细菌细胞壁结构back酵母细胞壁结构酵母细胞壁结构一、细胞壁的组成和结构一、细胞壁的组成和结构微生物微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚/nm/nm20-8020-8010-1310-13100-300100-300100-250100-250层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要组成主要组成肽聚糖肽聚糖（40-90%40-90%）多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖（1-4%1-4%）肽聚糖肽聚糖（5-10%5-10%）脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖（11-22%11-22%）磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖（30-40%30-40%）甘露聚糖甘露聚糖（30%30%）蛋白质蛋白质（6-8%6-8%）脂类脂类（8.5-8.5-13.5%13.5%）多聚糖多聚糖（80-90%80-90%）脂类脂类蛋白质蛋白质细胞破碎机理图细胞破碎机理图细胞破碎u细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；革兰氏阳性细菌的坚固；u酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；度和它的厚度；u由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。细胞破碎细胞破碎1.珠磨法（珠磨法（Bead mill）细胞破碎n高压匀浆器细胞破碎细胞破碎n超声破碎法（超声破碎法（Ultrasonication在在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。）引起的冲击波和剪切作用有关。空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。20Hz20000Hz正常人耳能听到的声音的频率范围正常人耳能听到的声音的频率范围超超 声声次次 声声细胞破碎n撞击破碎撞击破碎化学破碎方法酸碱法表面活性剂有机溶剂化学破碎方法u通用性差；通用性差；u时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；u有些化学试剂有毒有些化学试剂有毒。化学渗透法优点：化学渗透法优点：缺点：缺点：l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。步提取。物理破碎方法渗透压冲击冻融法细细胞胞破破碎碎后后，大大量量带带电电荷荷的的内内含含物物被被释释放放到到水水相相，使导电率上升。使导电率上升。1.1.破碎率的测定破碎率的测定1)1)直接测定法直接测定法2)2)目的产物测定法目的产物测定法3)3)导电率测定法导电率测定法采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%100%破碎率所获得的标破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。准数值比较，计算其破碎率。破碎率的测定破碎率的测定破碎率的测定破碎率的测定0.05%美蓝染色结果美蓝染色结果基因工程包涵体的纯化基因工程包涵体的纯化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理基因工程菌培养液不同表达形式的前处理(胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心,收集液相收集液相浓缩浓缩纯化。纯化。(胞内表达：胞内表达：l胞内可溶性表达：离心胞内可溶性表达：离心,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心，离心，收集上清收集上清纯化纯化l胞内周质表达：离心胞内周质表达：离心,收集菌体收集菌体低浓度溶菌酶或渗透低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物压冲击等溶解目标物离心离心,收集上清液收集上清液纯化。纯化。l不溶性包涵体：离心不溶性包涵体：离心,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心离心,收集收集沉淀沉淀包涵体洗涤包涵体洗涤目标蛋白变性溶解目标蛋白变性溶解复性复性纯化。纯化。包涵体的分离和蛋白质复性n包涵体：指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。n形成原因：表达量过高、过快外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白蛋白产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白/%/%外源蛋白的积累外源蛋白的积累人胰岛素人胰岛素50%50%形成包涵体形成包涵体-丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在细胞间区在细胞间区-人体干扰素人体干扰素25%25%形成包涵体形成包涵体凝乳酶原凝乳酶原形成包涵体形成包涵体牛生长激素牛生长激素30%30%形成包涵体形成包涵体-内酰胺酶内酰胺酶形成间区包涵体形成间区包涵体人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包涵体形成包涵体包涵体表达形式的优点 在一定程度上保持表达产物的结构稳定;能避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集;简化外源基因表达产物的分离操作;能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白包涵体表达形式的缺点包涵体表达形式的缺点l 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白。l体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30%l 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。包涵体的纯化方法包涵体的纯化方法收集菌体细胞细胞破碎包涵体包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性包涵体获得几种常见的工艺路线(一)机械破碎机械破碎(高压匀浆、高速珠磨）高压匀浆、高速珠磨）离心提取包含体离心提取包含体加变性剂溶解加变性剂溶解除变性剂复性除变性剂复性包涵体获得几种常见的工艺路线（二）机械破碎膜分离获得包涵体加变性剂溶解包含体除变性剂复性除变性剂复性1）包涵体的洗涤）包涵体的洗涤l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。l洗涤的重要性：洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。子而聚集，给后步纯化带来困难。l洗涤剂：洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。去部分膜蛋白和脂质类杂质。l洗涤剂浓度洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。产物为原则。n包涵体的溶解包涵体的分离和蛋白质复性二硫键二硫键目的次级键次级键变性剂去污剂还原剂盐酸胍、尿素SDS、Triton 100巯基乙醇、DTTn包涵体的复性包涵体的分离和蛋白质复性游离巯基次级键重新折叠形成复性通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构 复性注意事项复性注意事项 1.最适pH值范围为8.0-9.0之间；2.温度适宜选择4；3.复性过程蛋白浓度不宜过大，0.1-0.2mg/mL4.复性时间一般为24-36小时；