化妆品中双羟甲基咪唑烷基脲检测方法.doc

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化妆品中双羟甲基咪唑烷基脲检测方法
（征求意见稿）
1 合用范围
本方法规定了采用碱破坏和柱前衍生化液相色谱-紫外检测法测定化妆品中双羟甲基咪唑烷基脲（CAS：78491-02-8）的方法。
本方法合用于化妆品中双羟甲基咪唑烷基脲的含量测定，不合用于具有其它甲醛释放剂的化妆品。
2 方法提纲
双羟甲基咪唑烷基脲的测定采用强碱破坏，使双羟甲基咪唑烷基脲释放甲醛达恒定限度，然后通过柱前衍生化法，使甲醛与2，4-二硝基苯肼反映生成黄色的2，4-二硝基苯腙，经高效液相色谱分离，紫外检测器在355 nm波长下检测，根据保存时间定性，峰面积定量。本方法对双羟甲基咪唑烷基脲的检出限为0.1 µg，定量下限为0.2 µg；若取0.2 g样品测定，本方法对双羟甲基咪唑烷基脲的检出浓度为0.005 %，最低定量浓度为0.01 %。
3 试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。
3.1 双羟甲基咪唑烷基脲，纯度 ≥ 95.0% 。
3.2 2，4-二硝基苯肼，纯度 ≥ 99.0%。
3.3 氯仿，色谱纯，含量 ≥ 99.9%。
3.4 盐酸（r20 =1.19 g/mL）。
3.5 氢氧化钠。
3.6 磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）。
3.7 磷酸二氢钠（NaH2PO4•2H2O）。
3.8 乙腈，色谱纯。
3.9 甲醇，色谱纯。
3.10 去离子水。
3.11 2，4-二硝基苯肼盐酸溶液：称取2，4-二硝基苯肼（3.2）0.20 g，置于锥形瓶中，先加浓盐酸（3.4）40 mL使溶解，必要时可超声助溶，再加去离子水（3.10）60 mL，摇匀，即得。
3.12磷酸缓冲溶液（5 mol/L）：精密称定NaH2PO4•2H2O（3.7）2.28 g和Na2HPO4•12H2O（3.6）12.67 g，加水适量溶解后，转移到100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
3.13氢氧化钠溶液[r（NaOH）= 1 mol/L]：称取NaOH（3.5）10 g，加水适量溶解后，转移到250 mL量瓶中，用去离子水（3.10）稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
3.14 氢氧化钠溶液[r（NaOH）= 2 mol/L]：称取氢氧化钠（3.5）8 g，加水适量溶解后，转移到100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
3.15 盐酸水溶液 [r（HCl）= 2 mol/L]：量取浓盐酸16.7 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
3.16 乙腈水溶液（7+3）：量取乙腈140 mL，置锥形瓶中，加水60mL，摇匀，即得。
3.17 乙腈水溶液（9+1）：量取乙腈180 mL，置锥形瓶中，加水20mL，摇匀，即得。
3.18 系列浓度双羟甲基咪唑烷基脲标准溶液：精密称取双羟甲基咪唑烷基脲（3.1）0.2g（准确至0.001g）至10 mL量瓶中，加乙腈水溶液（7+3）（3.16）适量溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为20 mg/mL的浓储备液。然后按照表1，以乙腈水溶液（7+3）（3.16）为稀释溶液配制系列浓度双羟甲基咪唑烷基脲标准溶液。

表1 系列浓度双羟甲基咪唑烷基脲标准溶液配制
工作溶液
溶液初始浓度
量取体积
定容终体积
标准溶液终浓度
储备溶液1
20 mg/mL
1 mL
10 mL
2 mg/mL
储备溶液2
20 mg/mL
2.5 mL
10 mL
5 mg/mL
标准溶液1
2 mg/mL
5 mL
10 mL
1 mg/mL
标准溶液2
5 mg/mL
1 mL
10 mL
0.5 mg/mL
标准溶液3
2 mg/mL
1 mL
10 mL
0.2 mg/mL
标准溶液4
1 mg/mL
1 mL
10 mL
0.1 mg/mL
标准溶液5
0.5 mg/mL
1 mL
10 mL
0.05 mg/mL
标准溶液6
0.2 mg/mL
1 mL
10 mL
0.02 mg/mL

4 仪器
4.1 高效液相色谱仪：具有紫外检测器。
4.2 分析天平：感量0.001 g。
4.3 超声波清洗仪。
4.4 离心机。
5 测定环节
5.1 样品解决
称取化妆品样品0.20 g（精确至0.001 g），置具塞刻度管中，加乙腈水溶液（9+1）（3.17）至2.0 mL，涡旋2 min，使混匀，以5000 rpm转速离心10 min。取上清液1.0 mL置5 mL 离心管中，加氢氧化钠水溶液（3.14）1.0 mL，涡旋30 s，室温静置20 min，再加盐酸水溶液（3.15）1 mL，涡旋30 s，以5000 rpm转速离心5 min，准确量取上清液1.0 mL置10 mL离心管中，加2，4-二硝基苯肼盐酸溶液（3.11）0.4 mL，涡旋1 min，静置2 min，加磷酸缓冲液（3.12）0.4 mL，再加氢氧化钠溶液（3.13）2.0 mL，涡旋10 s，然后加入4 mL 氯仿（3.3），涡旋3 min，静置10 min，取氯仿层溶液1.0 mL置离心管中，以5000 rpm转速离心10 min，取上清液，备用。
5.2 色谱条件
色谱柱：C18色谱柱（250 × 4.6mm，5 µm）；
流动相：甲醇+水（60+40）；
流速：1.0 mL/min；
柱温：25 ℃；
检测波长：355 nm；
进样体积：10 µL；
运营时间：25 min。
5.3 双羟甲基咪唑烷基脲标准工作曲线制备
　取浓度分别为0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL的系列浓度标准溶液各1.0 mL，置5 mL塑料离心管中，加氢氧化钠水溶液（3.14）1.0 mL，涡旋30 s，室温静置20 min，再加盐酸水溶液（3.15）1.0 mL，涡旋30 s，以5000 rpm转速离心5 min，取上清液1.0 mL置10 mL离心管中，加2，4-二硝基苯肼盐酸溶液（3.11）0.4 mL，涡旋1 min，静置2 min，加磷酸缓冲液（3.12）0.4 mL，再加氢氧化钠溶液（3.13）2.0 mL，涡旋10 s，然后加入4.0 mL 氯仿，涡旋3 min，静置10 min，取氯仿层溶液1.0 mL置离心管中，以5000 rpm转速离心10 min，取上清液，备用。
5.4 测定
在“5.2”项色谱条件下，取“5.3”项下解决得到的标准曲线溶液分别进样，进行液相色谱分析，以双羟甲基咪唑烷基脲系列标准溶液浓度为横坐标，甲醛衍生物2，4-二硝基苯腙峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，得到回归方程。取“5.1”项下解决得到的待测溶液进样10 μL，根据测定的甲醛衍生物2，4-二硝基苯腙的峰面积，代入标准曲线计算双羟甲基咪唑烷基脲的质量浓度。按“7计算”，计算样品中双羟甲基咪唑烷基脲的含量。
6 平行实验
按以上环节操作，对同同样品独立进行测定获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
7 计算
rV
w（双羟甲基咪唑烷基脲）= ———— × 100%
m×103
式中：w（双羟甲基咪唑烷基脲）——化妆品中双羟甲基咪唑烷基脲的含量，%；
m ——样品取样量，g；
r ——代入标准曲线计算得到的待测样液中双羟甲基咪唑烷基脲的质量浓度，mg /mL；
V ——样品定容体积，本方法为2 mL。
7 回收率和精密度
多家实验室验证的平均回收率为98.6 % - 104 %，相对标准偏差小于8 %（n=6）。
8 色谱图

双羟甲基咪唑烷基脲标准溶液衍生化反映后的高效液相色谱图
色谱峰：甲醛衍生物（2，4-二硝基苯腙）（TR=17.8 min）